ELISA法檢測(cè)乙肝五項(xiàng)的影響因素與臨床意義

ELISA法檢測(cè)乙肝五項(xiàng)的影響因素及臨床應(yīng)用【摘要】眾所周知，乙肝的致病原是乙肝病毒，乙肝病毒在肝細(xì)胞內(nèi)生存、復(fù)制后，再排出到血液中。所以不僅血流中病毒高負(fù)荷，而且肝臟的大多數(shù)肝細(xì)胞都被感染。當(dāng)今社會(huì)談乙肝色變，主要有下列幾個(gè)方面：長(zhǎng)期病毒攜帶或患病怕傳染給親屬和周邊的人群，同時(shí)亦擔(dān)心受到社會(huì)的歧視；治療乙肝和各種護(hù)肝藥名目繁多，且各有利弊而不知所從；長(zhǎng)期病毒攜帶或久治不愈而演化成肝硬化甚至肝癌。作為檢測(cè)乙肝五項(xiàng)的工作人員應(yīng)該慎重操作，對(duì)每一個(gè)結(jié)果負(fù)責(zé)，不能因假陽(yáng)性引起患者的心理壓力和精神痛苦，造成不必要的糾紛。【關(guān)鍵詞】ELISA法；乙肝兩對(duì)半；乙肝兩對(duì)半又稱(chēng)乙肝五項(xiàng)，為國(guó)內(nèi)常用的乙肝病毒(HBV)感染的檢測(cè)血清標(biāo)志物。乙肝病毒免疫學(xué)標(biāo)記有表面抗原(HBsAg)、表面抗體(抗-HBs或HBsAb)、e抗原(HBeAg)和e抗體(抗-HBe或HBeAb)、核心抗原(HBcAg)和核心抗體(抗-HBc或HBcAb)”?？蓹z測(cè)患者是否感染乙肝及感染的具體情況。隨著現(xiàn)代臨床免疫學(xué)的發(fā)展，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)因其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性高等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于乙肝五項(xiàng)的檢測(cè)。但由于乙肝標(biāo)志物檢測(cè)生產(chǎn)試劑廠家較多，各種試劑診斷靈敏度及特異性相差很大，因此，如何選擇靈敏度高、特異性好的乙肝標(biāo)志物檢測(cè)試劑成為乙肝檢測(cè)中至關(guān)重要的問(wèn)題之一。本研究分別選擇3家國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒對(duì)來(lái)甘肅省武威腫瘤醫(yī)院參加健康體檢患者血液樣品進(jìn)行乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)檢測(cè)，乙肝表面抗原(HBsAg)檢測(cè)試劑盒，通過(guò)ELISA法檢測(cè)300例健康體檢患者血清中HBsAg水平，檢測(cè)出的陽(yáng)性標(biāo)本再用免疫膠體金試紙條檢測(cè)，比較三個(gè)不同公司生產(chǎn)試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性率及與金標(biāo)試紙條法檢測(cè)的一致性，現(xiàn)報(bào)道如下：1資料與方法1．1一般資料選擇我院2013年7月——2013年11月健康體檢患者300例，其中，男170例，女130例；年齡20～54歲，平均30歲。抽取患者靜脈血，分離血清，低溫(2~8℃)保存待檢。1．2方法1．2．1檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司(簡(jiǎn)稱(chēng)江萊)，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司(簡(jiǎn)稱(chēng)萬(wàn)泰)、英科新創(chuàng)(廈門(mén))科技有限公司(簡(jiǎn)稱(chēng)新創(chuàng))。其中包括96孔(48人份)酶標(biāo)板，陰性對(duì)照1mL，陽(yáng)性對(duì)照1mL，酶結(jié)合物6mL，顯色劑A6mL，顯色劑B6mL，20倍洗滌液40mL，終止液6mL，說(shuō)明書(shū)1份，不干膠3張，自封袋1個(gè)?？笻BV金標(biāo)試紙條購(gòu)自新創(chuàng)。1．2．2檢測(cè)儀器振蕩器(型號(hào)ZD一8800)。購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自鄭州安圖生物工程有限公司，型號(hào)：Anthos2010。1．2．3檢測(cè)方法采用ELISA法檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行，即：①使用前，充分混勻所有試劑，勿產(chǎn)生泡沫。②根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量確定所需酶標(biāo)板數(shù)量。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照孔1孔。陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各2孔。待檢標(biāo)本用稀釋液1：1稀釋后加入50L于酶標(biāo)板反應(yīng)孔內(nèi)。采用棋盤(pán)法做倍比稀釋?zhuān)箻?biāo)本濃度依次為40、20、10、5．0、2．5、1．25、IU／L。同樣方法稀釋陰性血清。③加人稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品及陰性血清50L于反應(yīng)孔，待測(cè)樣品50L于反應(yīng)孔內(nèi)，立即加入50L的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板．輕輕振蕩混勻，37℃孵育1h。④甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30S，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作5次。⑤每孔加入80L的親和鏈酶素一HRP，輕輕振蕩混勻，37℃孵育30min。⑥每孔加入底物A、B各50L，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10min。避免光照射。⑧取出酶標(biāo)板，迅速加入50L終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。⑨在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。分別用3個(gè)不同公司的試劑盒進(jìn)行初測(cè)，初測(cè)ELISA陽(yáng)性標(biāo)本再采用膠體金法測(cè)定1次。金標(biāo)試紙條于檢測(cè)線及對(duì)照線位置處各出現(xiàn)一條紫紅色線條為陽(yáng)性，只于對(duì)照線位置出現(xiàn)l條紫紅色線條為陰性。未出現(xiàn)任何線條表示金標(biāo)試紙條失效。1．3結(jié)果判定及觀察項(xiàng)目測(cè)定孔OD值／陰性對(duì)照孔OD值(S／N)大于2．1判為陽(yáng)性。比較3個(gè)不同公司ELISA檢測(cè)靈敏度、特異性及與膠體金法檢測(cè)的一致性2結(jié)果江萊、萬(wàn)泰、新創(chuàng)三家廠家生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)HBsAg陽(yáng)性率分別為13％(39／300)、10％(30／300)、20％(60／300)。新創(chuàng)陽(yáng)性性率最高。陽(yáng)性血清經(jīng)金標(biāo)試紙條檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果分別為30、23、42例。新創(chuàng)試劑盒ELISA法檢測(cè)抗原包被濃度為1．25IU／L時(shí)，仍可檢出陽(yáng)性標(biāo)本。其他兩個(gè)試劑盒最低檢出濃度為2．5IU／L。3.結(jié)論:不同廠家ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果存在差異，臨床檢測(cè)時(shí)需綜合幾個(gè)試劑盒結(jié)果及其他試驗(yàn)進(jìn)行印證。4.討論：慢性乙型肝炎為世界性醫(yī)學(xué)難題之一，為世界范圍內(nèi)引起慢性肝臟疾病的主要病原之一，起病緩慢，感染率高，我國(guó)為HBV感染的主要流行病區(qū)，截至2011年有慢性HBV攜帶者約1．2億，慢性乙型肝炎患者約3000萬(wàn)例，以每年新增病例l0萬(wàn)～25萬(wàn)的速度增長(zhǎng)。大多數(shù)患者無(wú)明顯癥狀并可導(dǎo)致肝硬化、肝癌等終末期肝病，目前尚無(wú)治療特效藥。主要通過(guò)血液、母嬰及性接觸傳播。乙肝疫苗為控制及預(yù)防乙型肝炎的主要措施。HBsAg血清中HBsAg陽(yáng)性是HBV感染的標(biāo)志，本身有抗原性，無(wú)傳染性，但由于HBsAg常與HBV同時(shí)存在，通常認(rèn)為是傳染性標(biāo)志之一。HBV標(biāo)志物檢測(cè)是臨床診斷乙肝感染的重要依據(jù)，也是抗病毒治療檢測(cè)的重要指標(biāo)之一。臨床通常采用免疫學(xué)檢測(cè)及核算檢測(cè)兩類(lèi)方法進(jìn)行。基于免疫學(xué)檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)因操作方便、靈敏度高、特異性好而較多用于乙肝患者的初篩。膠體金是由氯金酸(HAuC)在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，與靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，在弱堿性環(huán)境下可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固結(jié)合，這種結(jié)合為靜電結(jié)合，不影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)。單克隆抗體包被于檢測(cè)線處，抗金標(biāo)抗體包被于對(duì)照線處，金標(biāo)抗體吸附于固相載體無(wú)紡紗上。利用抗原抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)原理，在檢測(cè)線處形成抗體-待測(cè)抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，在對(duì)照線處形成抗金標(biāo)抗體-金標(biāo)抗體復(fù)合物。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。但常因判斷結(jié)果時(shí)間不夠、反應(yīng)不充分、溫度低、樣本加樣問(wèn)題、過(guò)濾膜破損等原因?qū)е屡袛嗍д`，也可因臨床醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)不足把隱約可見(jiàn)的陽(yáng)性線誤判為陰性等不正常結(jié)果發(fā)生。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)HBV抗體為較簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法。臨床檢測(cè)通常檢測(cè)HBsAg及HBsAb。HBsAg為病毒外膜蛋白的重要組成成分，為HBV感染的最主要的血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。HBsAg陽(yáng)性提示HBV現(xiàn)癥感染，陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間超過(guò)6個(gè)月則為慢性HBV感染。目前國(guó)內(nèi)HBsAg檢測(cè)使用的ELISA法多為定性檢測(cè)，只能初步判斷陰性或者陽(yáng)性，也有半定量檢測(cè)的ELISA試劑盒，通常以信號(hào)／臨界值(singal／cut—off．S／CO)或臨界指數(shù)表示。目前國(guó)產(chǎn)HBsAgELISA試劑盒靈敏度在0．2～0．5IU／mL之間。HBV9種不同血清型aywl、ayw2、zyw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq、adwq，分別位于HB-sag第2、3跨膜區(qū)親水區(qū)的a表位為各血清型病毒共有的免疫優(yōu)勢(shì)表位。正是由于不同血清型a位氨基酸組成的差異，導(dǎo)致同一試劑對(duì)不同血清型病毒檢測(cè)能力存在差異。本組研究中新創(chuàng)公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒靈敏度略高于其他兩個(gè)公司，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。不同廠家生產(chǎn)的ELISA試劑盒檢測(cè)HBsAg結(jié)果存在不一致性．可能與廠家用于檢測(cè)時(shí)包被的乙肝病毒基因片段不一致有關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同廠家ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果存在差異，臨床檢測(cè)時(shí)需綜合幾個(gè)試劑盒結(jié)果及其他試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。[參考文獻(xiàn)】【1】顧志冬,吳倩文，馮曉靜，等．用于國(guó)產(chǎn)一步法HBsAgELISA試劑及確認(rèn)試驗(yàn)試劑的改進(jìn)方法[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26(1)：32—35．【2】陳慧英．對(duì)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)肝炎病毒血清標(biāo)志物臨界結(jié)果報(bào)告的探討[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2006，21(Z1)：54—56．[3]祝繼華，嚴(yán)立，陳瀑，等．ELISA法在檢測(cè)乙肝標(biāo)志物中的應(yīng)用和評(píng)價(jià)『J1．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34(10)：1397—13