DB33T 963-2015 厚皮甜瓜種子純度分子標(biāo)記鑒定方法　　

DB33PurityidentificationofMuskmelonvarietyusingmolecularmarkeranalysis浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、寧波市種1厚皮甜瓜種子純度分子標(biāo)記鑒定方法農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-4-2010轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)品種在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)占供檢本作物樣品種子數(shù)的百分率表示僅能檢測(cè)顯性等位基因，不能夠區(qū)分純合和雜合基因型的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。2以基因組DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核目不同，PCR擴(kuò)增后獲得的產(chǎn)物長(zhǎng)度不同，通過(guò)高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫或者擴(kuò)增片段大小不同的差異。這些差異可利用電泳圖譜ACCTGGACACACACCGGAACSSR（SimpleSequenceRepeat）引物名稱(chēng)、序列及差異片3ATCCAACTCGACCAAGAAAC5.2瓊脂糖稱(chēng)取80.0g氫氧化鈉（NaOH），先用160），解后，冷卻至室溫，用按本標(biāo)準(zhǔn)5.4配置氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa5.61mol/L三羥甲基氨基甲稱(chēng)取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mLpH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min。分別量取10mL按本標(biāo)準(zhǔn)5.6配置的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液和乙酸二鈉溶液，加水定容至1000mL。在103.4配置的乙二胺四乙酸二鈉溶液，加水定容至1000mL。使用時(shí)用水稀釋成05.9加樣緩沖液稱(chēng)取1g水溶性鈉型溴酚藍(lán)于100mL水中，渦旋直到完全溶解，配制成0.15%溴酚藍(lán)。稱(chēng)取1g二甲二甲基苯腈藍(lán)，加入100μL按本標(biāo)準(zhǔn)5.5配置的乙4將濃度為2.5mmol/L的dATP、dTTP、d抽樣結(jié)束后，播種，待第一片真葉長(zhǎng)至0.5cm～1cm時(shí)，即可單株取真葉樣品，體積(μL）//5體積(μL）/5/）；電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀或紫8.1.1標(biāo)記的差異位點(diǎn)顯示共顯性，供試材料的帶型與雜種一代雙親之一相同，則表明該材料在差異位點(diǎn)雜交不成功，判斷為雜株；同