高致病性美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種PCR檢測(cè)方法編制說(shuō)明

PAGE3《高致病性美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種PCR檢測(cè)方法》編制說(shuō)明1.項(xiàng)目背景，包括產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、立項(xiàng)背景及必要性等。本標(biāo)準(zhǔn)的提出是根據(jù)《中華人民共和國(guó)漁業(yè)法》、《關(guān)于創(chuàng)新體制機(jī)制推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的意見(jiàn)》、《關(guān)于加快推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見(jiàn)》、《水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疫病防控指南》等國(guó)家政策文件對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展的要求，積極開(kāi)發(fā)高效、精準(zhǔn)并且可以現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的病害檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于支撐我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害綜合防控技術(shù)體系建設(shè)和推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae，PDD）是弧菌科發(fā)光桿菌屬美人魚(yú)發(fā)光桿菌（Photobacteriumdamselae）的一個(gè)亞種，廣泛分布于全球海洋環(huán)境中，可以感染魚(yú)類、甲殼類、軟體動(dòng)物、海龜、鯨豚類等不同的海洋動(dòng)物發(fā)病，對(duì)人也有一定的致病性。PDD首次分離于1971年發(fā)生的一起“未知海洋弧菌”感染人類傷口的事件。而后，該菌于1981年再次從患病斑鰭光鰓魚(yú)（Chromispunctipinnis）的皮膚潰瘍病灶處被分離出來(lái)，被命名為美人魚(yú)弧菌（Vibriodamsela），并報(bào)道于Science雜志。20世紀(jì)90年代，Smith等人將其歸為發(fā)光桿菌屬，并重新命名為美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種，與魚(yú)類巴斯德氏菌病的病原美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種（P.damselaesubsp.piscicida）同種。PDD不僅是多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病原，還可對(duì)人類導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染。魚(yú)類在感染PDD之后的典型特征為局部出血和體表潰瘍性損傷，而人類傷口在感染PDD之后，往往會(huì)形成大皰和明顯的水腫，并且有可能發(fā)展為壞死性筋膜炎，多器官衰竭。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，PDD主要是因魚(yú)刺、魚(yú)鉤和水中雜物（如木塊）等扎傷后接觸傷口而感染人。該菌在近海海水環(huán)境中廣泛分布，不僅會(huì)感染養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病從而對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)造成經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)對(duì)海水養(yǎng)殖從業(yè)者、海濱浴場(chǎng)游客、海上工程作業(yè)人員等構(gòu)成一些潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)引起足夠的重視PDD的致病性主要由四種不同的毒素決定，分別是由毒力質(zhì)粒pPHDD1編碼的damselysin（Dly）和phobalysinP（PhlyP），以及由染色體編碼的phobalysinC(PhlyC)和磷脂酶PlpV。其中Dly由毒力基因dly編碼，是一種對(duì)鞘磷脂表現(xiàn)高活性的D-磷脂酶；PlpV由毒力基因plpV編碼，是一種A2-磷脂酶；PhlyP和PhlyC都是穿孔毒素，分別由毒力基因hlyApl和hlyAch編碼，這四種毒素都通過(guò)II型分泌系統(tǒng)分泌。穿孔毒素PhlyP與PhlyC之間的加強(qiáng)作用，以及兩種磷脂酶（Dly和PlpV）與兩種穿孔毒素（PhlyP和PhlyC）之間的協(xié)同作用可以使菌株對(duì)魚(yú)類的致病力達(dá)到最大。此外，PDD菌株的染色體還能編碼一種膠原酶ColP，這種毒素對(duì)菌株的致病性起次要作用。而在諸多致病因子中，攜帶dly基因是決定PDD對(duì)魚(yú)類致病性強(qiáng)弱的主要毒力基因。到目前為止，我國(guó)境內(nèi)PDD感染海水養(yǎng)殖動(dòng)物的文獻(xiàn)報(bào)道集中于少量的發(fā)病案例和病原學(xué)報(bào)道，該菌被認(rèn)為是我國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)近幾年的新發(fā)病原之一。從已有的研究看，PDD可以感染我國(guó)從南方至北方的多種海水經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，如鞍帶石斑魚(yú)（Epinepheluslanceolatus）、半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）、許氏平鲉（Sebastesschlegeli）、凡納濱對(duì)蝦（Penaeusvannamei）等，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的地域或宿主特異性。以山東省長(zhǎng)島海洋生態(tài)文明綜合試驗(yàn)區(qū)周邊海域?yàn)槔?，該海域是我?guó)北方最大的深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)，現(xiàn)有中大型深水網(wǎng)箱738個(gè)，海水網(wǎng)箱總養(yǎng)殖水體達(dá)到63萬(wàn)m3。，主養(yǎng)品種為許氏平鲉，年養(yǎng)殖產(chǎn)量在1000噸左右。但近10年來(lái)，該地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的許氏平鲉連續(xù)在高溫季節(jié)暴發(fā)流行性的皮膚潰瘍病，該病具有傳播速度快、致死率高等顯著特點(diǎn)，發(fā)病期間單口網(wǎng)箱的累計(jì)死亡率最高超過(guò)了60%（數(shù)據(jù)來(lái)源于長(zhǎng)島海洋生態(tài)文明綜合試驗(yàn)區(qū)海洋經(jīng)濟(jì)促進(jìn)中心的調(diào)研報(bào)告），導(dǎo)致約30%的網(wǎng)箱養(yǎng)殖業(yè)主近幾年放棄養(yǎng)殖、空置網(wǎng)箱，經(jīng)濟(jì)損失慘重。本標(biāo)準(zhǔn)起草人在該地區(qū)針對(duì)該病進(jìn)行了連續(xù)兩年的系統(tǒng)性流行病學(xué)調(diào)查，不僅充分證實(shí)PDD是該病的致病原，也從這一養(yǎng)殖海區(qū)不同養(yǎng)殖時(shí)期陸續(xù)分離獲得了11株P(guān)DD菌株。后續(xù)的病原學(xué)研究結(jié)果表明，這11株菌株和本實(shí)驗(yàn)室保存的其他來(lái)源的PDD菌株不僅生理生化指標(biāo)、抗生素藥物敏感性等常規(guī)表型指標(biāo)存在較明顯的差異，與致病力緊密相關(guān)的溶血能力也表現(xiàn)了非常明顯的差異。多次人工感染實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證，這些菌株對(duì)許氏平鲉的致病力也存在極為明顯的差異。同為高濃度的活菌液注射感染，致病力強(qiáng)的菌株可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)魚(yú)在極短的時(shí)間內(nèi)就全部死亡，而其他的一些PDD菌株注射后受試魚(yú)卻無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生。事實(shí)上，以生理生化指標(biāo)和對(duì)宿主致病力的強(qiáng)弱作為評(píng)判依據(jù)，不同PDD菌株在全球范圍內(nèi)也表現(xiàn)了表型特征多樣化的現(xiàn)象。隨著我國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)，深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖被確認(rèn)為拓展海水養(yǎng)殖空間的戰(zhàn)略發(fā)展方向。目前，山東省已經(jīng)進(jìn)行了大型網(wǎng)箱、養(yǎng)殖工船等深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖模式的先行先試，而許氏平鲉就是深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖的主要品種之一。參照以往的產(chǎn)業(yè)經(jīng)驗(yàn)，高密度的養(yǎng)殖模式在發(fā)展的過(guò)程中往往擺脫不了病害問(wèn)題的制約。本標(biāo)準(zhǔn)起草人團(tuán)隊(duì)前期的研究已經(jīng)證實(shí)，高致病性PDD是導(dǎo)致網(wǎng)箱養(yǎng)殖許氏平鲉敗血性皮膚潰瘍癥的主要致病原，而海水環(huán)境中的PDD菌株存在顯著的致病性差異，部分低致病性的PDD菌株即使感染也不會(huì)誘發(fā)疾病。因此，建立針對(duì)高致病性PDD菌株的檢測(cè)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同致病力PDD菌株的差異化檢測(cè)，對(duì)于深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的精準(zhǔn)防控是十分有必要的。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)全文公開(kāi)系統(tǒng)和中國(guó)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)的搜索，僅查找到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中副溶血性弧菌的檢測(cè)》（GB/T26426-2010）、《食品微生物檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB4789.7-2013），未見(jiàn)有關(guān)美人魚(yú)發(fā)光桿菌及其檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范的報(bào)道。制定高致病性美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種檢測(cè)技術(shù)規(guī)程，對(duì)于指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)者科學(xué)規(guī)范地進(jìn)行精準(zhǔn)化的病害檢測(cè)，降低疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提高疾病防控效率具有指導(dǎo)作用，也為推進(jìn)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐，具有突出的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。2.工作簡(jiǎn)況，包括任務(wù)來(lái)源、協(xié)作單位、主要工作過(guò)程、編寫(xiě)組成員及其所做的主要工作等。（1）任務(wù)來(lái)源本標(biāo)準(zhǔn)的起草和制訂來(lái)源于山東水產(chǎn)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制訂項(xiàng)目。（2）協(xié)作單位本標(biāo)準(zhǔn)的起草由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所作為牽頭單位，聯(lián)合山東信得科技股份有限公司和山東信達(dá)基因科技有限公司作為協(xié)作單位共同完成。其中，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所負(fù)責(zé)完成標(biāo)準(zhǔn)的編制以及標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試、適用性評(píng)價(jià)等工作。山東信得科技股份有限公司和山東信達(dá)基因科技有限公司，主要負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)參數(shù)的驗(yàn)證和示范。（3）主要工作過(guò)程為更好地完成標(biāo)準(zhǔn)的制訂工作，標(biāo)準(zhǔn)起草團(tuán)隊(duì)從以下幾個(gè)方面開(kāi)展了工作：1）標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)前，團(tuán)隊(duì)成員已進(jìn)行了相關(guān)技術(shù)資料的收集。標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)通知下達(dá)后，成立了專門(mén)的標(biāo)準(zhǔn)起草小組，制定工作計(jì)劃，落實(shí)實(shí)施方案。2）學(xué)習(xí)有關(guān)政策法規(guī)，廣泛收集有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和研究成果，包括GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則》、GB/T6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》、GB19489-2008《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》、SC/T7014-2006《水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》、SC/T7201.1-2006《魚(yú)類細(xì)菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)》、SC/T7015-2011《染疫水生動(dòng)物無(wú)害化處理規(guī)程》、SN/T2102.1-2008《食源性病原體PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第1部分：通用要求和定義》等標(biāo)準(zhǔn)以及國(guó)家和農(nóng)業(yè)部有關(guān)質(zhì)量管理規(guī)定、產(chǎn)業(yè)政策等文件。3）標(biāo)準(zhǔn)編制組收集了國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料，在國(guó)內(nèi)的海水魚(yú)類養(yǎng)殖場(chǎng)、原良種場(chǎng)、網(wǎng)箱養(yǎng)殖企業(yè)、深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖企業(yè)進(jìn)行了系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查，與相關(guān)技術(shù)人員進(jìn)行了深入的交流，并充分征求科研、管理等相關(guān)部門(mén)人員的意見(jiàn)，在總結(jié)各方面意見(jiàn)的基礎(chǔ)上確定標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)內(nèi)容，于2023年6月形成標(biāo)準(zhǔn)的征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明。4）起草小組于2023年8月份就形成的標(biāo)準(zhǔn)草案征求意見(jiàn)稿及編制說(shuō)明在全國(guó)范圍內(nèi)公開(kāi)征求專家意見(jiàn)（征求意見(jiàn)單位及回函單位不少于20家），征求意見(jiàn)的專家單位包括中國(guó)海洋大學(xué)、江蘇海洋大學(xué)、寧波大學(xué)、西南大學(xué)、海南大學(xué)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所、山東省海洋科學(xué)研究院等，咨詢專家為長(zhǎng)期從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究的高級(jí)專業(yè)技術(shù)人員，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿提出初步的意見(jiàn)和建議，征求意見(jiàn)的時(shí)間不少于30天。標(biāo)準(zhǔn)起草小組于10月底收到了全部20為專家的返回意見(jiàn)，并對(duì)返回的意見(jiàn)進(jìn)行匯總和整理，按照專家意見(jiàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿進(jìn)行修訂，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿完善后提交秘書(shū)處，組織相關(guān)專家進(jìn)行評(píng)審。（4）編寫(xiě)組成員及其所做的主要工作編寫(xiě)組成員為張正、于永翔、王印庚、羅展、王春元、馬廣斌、趙永偉、張世佳。編寫(xiě)組成員主要負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)制訂工作的組織、協(xié)調(diào)，相關(guān)資料的查閱、收集，標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說(shuō)明的起草、撰寫(xiě)，組織召開(kāi)研討會(huì)，通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)考察、電子郵件、傳真、電話等方式，征集、整理和歸納相關(guān)的意見(jiàn)、標(biāo)準(zhǔn)送審等。所做的主要工作見(jiàn)表1。表1編寫(xiě)組成員及其所做的主要工作姓名工作單位承擔(dān)的工作3.標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容（如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則等）的論據(jù)（包括試驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)），修訂標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)當(dāng)列出新、舊標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比。（1）標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)的提出是根據(jù)《關(guān)于加快推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見(jiàn)》、《關(guān)于創(chuàng)新體制機(jī)制推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的意見(jiàn)》等國(guó)家政策文件對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展的要求，積極開(kāi)發(fā)高效、精準(zhǔn)并且可以現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的病原檢測(cè)技術(shù)并制定技術(shù)規(guī)程，符合我國(guó)有關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物病原檢測(cè)、疫病診斷的規(guī)章及規(guī)范性文件要求。標(biāo)準(zhǔn)起草過(guò)程中，按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》給出的規(guī)則起草制定，為新制訂標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)文本中能直接引用的標(biāo)準(zhǔn)盡量引用，相關(guān)內(nèi)容不再在本標(biāo)準(zhǔn)中出現(xiàn)。（2）確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)1）范圍限定了本標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍是進(jìn)行高致病性PDD菌株的PCR檢測(cè)。2）規(guī)范性引用文件規(guī)定了對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的制訂和應(yīng)用不可缺少的參考標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范和其他文件。列舉的引用文件中，凡注日期的文件，僅注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)的參考引用，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于標(biāo)準(zhǔn)的參考引用。3）術(shù)語(yǔ)和定義確定了本標(biāo)準(zhǔn)適用的檢測(cè)對(duì)象為高致病性美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種（high-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae）美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae）是弧菌科發(fā)光桿菌屬美人魚(yú)發(fā)光桿菌（Photobacteriumdamselae）的一個(gè)亞種，廣泛分布于全球海洋環(huán)境中，可以感染魚(yú)類、甲殼類、軟體動(dòng)物、海龜、鯨豚類等不同的海洋動(dòng)物發(fā)病，對(duì)人也有致病性。該菌種的不同菌株因攜帶的毒力基因不同，對(duì)宿主呈現(xiàn)出高致病性、低致病性和無(wú)致病性的致病力表型差異。本標(biāo)準(zhǔn)界定的高致病性美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種是指感染魚(yú)類宿主后能引起發(fā)病，最短可在數(shù)小時(shí)內(nèi)造成宿主死亡，從而引發(fā)流行性疾病的菌株。4）PCR引物本標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)依據(jù)是通過(guò)檢測(cè)PDD菌株攜帶的不同毒力基因，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株致病力差異性的區(qū)分。檢測(cè)過(guò)程中共使用了兩對(duì)PCR引物，包括用于檢測(cè)位于菌株染色體上hlyB基因的特異性引物，以及用于檢測(cè)位于菌株毒性質(zhì)粒上dly基因的特異性引物。hlyB基因是一部分致病性細(xì)菌溶血素毒力系統(tǒng)中一個(gè)重要的毒力基因，位于細(xì)菌染色體上，主要表達(dá)溶血素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等毒力因子，它并不是像16srDNA基因和gyrB基因等一樣是一個(gè)通用型的細(xì)菌基因，而是只在一部分細(xì)菌中才有，并且其中的部分序列高度保守，具有很好的種間識(shí)別性。而dly基因是目前已經(jīng)確認(rèn)的只有致病性美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種的高毒力質(zhì)粒才攜帶的重要毒力基因，主要表達(dá)溶血素蛋白。這一基因位于質(zhì)粒上，會(huì)隨著質(zhì)粒一同丟失，高致病性菌株在丟失這一基因后會(huì)變?yōu)榈椭虏⌒曰蚍侵虏⌒跃?，所以是作為鑒別美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種是否具有高致病力的理想靶標(biāo)基因。檢測(cè)hlyB基因的存在主要確認(rèn)被檢菌株為PDD，檢測(cè)dly基因的存在主要確認(rèn)被檢的PDD菌株攜帶有高致病性的毒力基因。兩對(duì)PCR特異引物序列如下：①hlyB基因的特異引物正向序列hlyB-F:5'-ACTCGCTTACTTGAATCGGAAAT-3'反向序列hlyB-R:5'-TCACGAAAGACATTGAGCATC-3'②dly基因的特異引物正向序列dly-F:5'-TTTGGACGAGCGGTCCATTT-3'反向序列dly-R:5'-GGAGCCCAATCTTGACCAGG-3'5）儀器設(shè)備和試劑耗材規(guī)定了用于開(kāi)展高致病性PDD菌株檢測(cè)所需的基本條件要求，包括主要的儀器設(shè)備，試劑和耗材。6）檢測(cè)步驟依據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)研究和技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果，確定了開(kāi)展高致病性PDD菌株P(guān)CR檢測(cè)的基本實(shí)驗(yàn)步驟，包括三個(gè)步驟：①待檢樣品及陰性、陽(yáng)性對(duì)照組的核酸模板制備：詳細(xì)描述了對(duì)待檢病樣樣品的采集和前處理過(guò)程，及相關(guān)的技術(shù)參數(shù)要求，確保最終制備出符合檢測(cè)要求的DNA核酸模板。②PCR反應(yīng)體系的配置：確定了分別用于檢測(cè)hlyB基因和dly基因的兩個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系，以及陰性、陽(yáng)性對(duì)照組PCR反應(yīng)體系的組成。③PCR擴(kuò)增：確定了進(jìn)行hlyB基因和dly基因PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件參數(shù)、產(chǎn)物電泳條件，以及結(jié)果觀察方法。7）結(jié)果判定主要包括兩部分內(nèi)容：①檢測(cè)結(jié)果成立的條件：詳細(xì)描述了被檢樣品判定為高致病性PDD感染的條件，即hlyB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)后在344bp的位置出現(xiàn)特異性條帶，dly基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)后在695bp的位置出現(xiàn)特異性條帶，且陰性對(duì)照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后均未出現(xiàn)條帶，則檢測(cè)結(jié)果成立。②結(jié)果判定的方法：對(duì)檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)的多種情況及其結(jié)果判定進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，分為四種情況：一是在檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，即hlyB基因和dly基因兩條特異性條帶同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，且陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶，可判定為高致病性PDD感染。二是在檢測(cè)結(jié)果不成立的前提下，hlyB基因出現(xiàn)特異性條帶，而dly基因未出現(xiàn)條帶，且陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶，可判定為PDD感染，但不是高致病菌株。三是在檢測(cè)結(jié)果不成立的前提下，只要hlyB基因未出現(xiàn)特異性條帶，無(wú)論dly基因是否出現(xiàn)特異性條帶，即可判定該樣品不是PDD感染。四是檢測(cè)過(guò)程中也可以選擇高致病PDD菌株作為陽(yáng)性對(duì)照。若陽(yáng)性對(duì)照hlyB基因和dly基因任意一個(gè)未出現(xiàn)特異性條帶，證明本次檢測(cè)存在操作失誤，再次重復(fù)該檢測(cè)。8）防止交叉污染和廢棄物處理的措施引用了其他已頒布的國(guó)標(biāo)和行標(biāo)，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染，以及檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物和檢測(cè)完成后樣品的處理方式進(jìn)行了規(guī)定。4.主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果。（1）主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析本標(biāo)準(zhǔn)起草人在過(guò)去的研究中，共收集保存了46株P(guān)DD菌株。這些菌株來(lái)自國(guó)內(nèi)河北、天津、山東、江蘇、浙江、福建、海南7個(gè)省市，分離自大菱鲆、褐牙鲆、半滑舌鰨、許氏平鲉、大瀧六線魚(yú)、褐點(diǎn)石斑魚(yú)、珍珠龍膽石斑魚(yú)、赤點(diǎn)石斑魚(yú)、大黃魚(yú)、南美白對(duì)蝦、高鰭鯊、皺紋盤(pán)鮑等12個(gè)海水養(yǎng)殖品種，時(shí)間跨度長(zhǎng)達(dá)11年，基本上覆蓋了我國(guó)的主要海水養(yǎng)殖區(qū)域。在對(duì)這些菌株的持續(xù)研究中，發(fā)現(xiàn)不同的PDD菌株在生理生化指標(biāo)、抗生素藥物敏感性、溶血和磷脂酶表型，以及對(duì)魚(yú)類宿主的致病力方面都存在著極為明顯的差異。因此，開(kāi)展不同致病力菌株的差異化檢測(cè)，對(duì)在生產(chǎn)中高效、精準(zhǔn)的預(yù)防PDD感染就尤為重要。通過(guò)對(duì)高致病力、低致病力和無(wú)致病力的PDD菌株進(jìn)行全基因組的比較分析，發(fā)現(xiàn)其致病力的差異主要是由于攜帶不同的毒力基因而導(dǎo)致的。通過(guò)深入的基因組解析，并檢索了大量文獻(xiàn)，最終選定位于染色體上的hlyB基因和位于毒性質(zhì)粒上的dly基因作為檢測(cè)高致病性PDD菌株的鑒別基因。其中，位于染色體上的hlyB基因是所有PDD菌株都攜帶的毒力系統(tǒng)基因之一，其基因序列相對(duì)保守，主要用于鑒別被檢菌株為PDD菌株。而dly基因是高致病性PDD菌株毒性質(zhì)粒攜帶的特有毒力基因，只有攜帶該基因的PDD菌株才會(huì)表現(xiàn)出極強(qiáng)的致病力，也是鑒別高致病性PDD菌株的標(biāo)志性基因。由于該基因位于菌株的質(zhì)粒上，因此存在質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，有可能會(huì)將dly基因轉(zhuǎn)入其他非PDD菌株。因此，本標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)思路是通過(guò)對(duì)hlyB基因和dly基因同步檢測(cè)的方式，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)高致病性PDD菌株的快速檢測(cè)鑒別。（2）綜述報(bào)告確定上述技術(shù)思路后，本標(biāo)準(zhǔn)起草人團(tuán)隊(duì)對(duì)hlyB基因和dly基因進(jìn)行了全序列分析，并挑選了其中高度保守的一段序列，設(shè)計(jì)了特異性引物，并委托相關(guān)公司進(jìn)行了引物合成。隨后，從實(shí)驗(yàn)室的菌種庫(kù)中挑選出23株不同的細(xì)菌菌株（表1）進(jìn)行了hlyB基因引物特異性的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只有3株P(guān)DD菌株在344bp的位置出現(xiàn)條帶，其余的20株非PDD菌株均未出現(xiàn)條帶，證明所設(shè)計(jì)的hlyB基因?qū)DD菌株具有較好的特異性，可以用于對(duì)PDD菌株的特異性檢測(cè)。表1用于驗(yàn)證hlyB基因引物特異性的菌株序號(hào)菌株拉丁名編號(hào)來(lái)源1美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1605實(shí)驗(yàn)室分離2美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1608實(shí)驗(yàn)室分離3美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1808實(shí)驗(yàn)室分離4輪蟲(chóng)弧菌vibriorotiferianusVR1實(shí)驗(yàn)室分離5輪蟲(chóng)弧菌vibriorotiferianusVR2實(shí)驗(yàn)室分離6輪蟲(chóng)弧菌vibriorotiferianusVR3實(shí)驗(yàn)室分離7哈維氏弧菌VibroharveyiVHBZ0001購(gòu)自北微所8哈維氏弧菌VibroharveyiVHBZ0002實(shí)驗(yàn)室分離9哈維氏弧菌VibroharveyiVHBZ0003實(shí)驗(yàn)室分離10鰻弧菌VibrioanguillarumVABZ0001購(gòu)自北微所11鰻弧菌VibrioanguillarumVABZ0002實(shí)驗(yàn)室分離12燦爛弧菌VibriosplendidusVSBZ0001購(gòu)自北微所13燦爛弧菌VibriosplendidusVSBZ0002實(shí)驗(yàn)室分離14副溶血弧菌VibrioparahaemolyticusVPBZ0001購(gòu)自北微所15副溶血弧菌VibrioparahaemolyticusVPBZ0002實(shí)驗(yàn)室分離16溶藻弧菌VibrioalginolyticusVABZ0003購(gòu)自北微所17溶藻弧菌VibrioalginolyticusVABZ0004實(shí)驗(yàn)室分離18費(fèi)氏弧菌VibriofischeriSm02112702A購(gòu)自北微所19大菱鲆弧菌VibrioscophtalmiVS1實(shí)驗(yàn)室分離20嗜環(huán)弧菌VibriocyclitrophicusVC1實(shí)驗(yàn)室分離21大腸桿菌EscherichiaColiTrans1-T1實(shí)驗(yàn)室分離22大腸桿菌EscherichiaColiTrans1-T2實(shí)驗(yàn)室分離23大腸桿菌EscherichiaColiTrans1-T3實(shí)驗(yàn)室分離完成了對(duì)hlyB基因引物特異性的驗(yàn)證后，本標(biāo)準(zhǔn)起草人團(tuán)隊(duì)又從實(shí)驗(yàn)室的菌種庫(kù)中挑選出25株不同來(lái)源的PDD菌株，其中包括已經(jīng)完成全基因組解析和致病力驗(yàn)證的2株高致病性菌株，分別用設(shè)計(jì)的hlyB基因引物和dly基因引物對(duì)這25株P(guān)DD開(kāi)展了特異性檢測(cè)，結(jié)果如圖1和圖2所示，25株P(guān)DD菌株的hlyB基因引物全部出現(xiàn)了特異性條帶，而只有其中的2株高致病性菌株的dly基因引物出現(xiàn)了特異性條帶，證實(shí)本標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)思路可以實(shí)現(xiàn)對(duì)高致病性PDD菌株的精準(zhǔn)檢測(cè)。圖1用hlyB基因引物對(duì)25株P(guān)DD菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果圖2用dly基因引物對(duì)25株P(guān)DD菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果（3）技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證本標(biāo)準(zhǔn)面向海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中病害防控的痛點(diǎn)問(wèn)題，規(guī)定了高致病性PDD菌株的PCR檢測(cè)方法，適用于魚(yú)類、對(duì)蝦等主要養(yǎng)殖品種對(duì)PDD感染檢測(cè)的技術(shù)需求。采用本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確鑒別出具有高致病性的PDD菌株，實(shí)現(xiàn)對(duì)PDD感染的精準(zhǔn)防控。標(biāo)準(zhǔn)的制訂，對(duì)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的病害臨床防控具有重要的指導(dǎo)意義，能夠有效節(jié)約養(yǎng)殖生產(chǎn)單位在防控PDD疾病感染過(guò)程中的人力和物力投入。（4）預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效益2019年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部聯(lián)合十部委共同印發(fā)了《關(guān)于加快推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的意見(jiàn)》，其中第十五條“加強(qiáng)疫病防控”中提出了應(yīng)“提高重大疫病防控和應(yīng)急處置能力”。2022年，山東省委、省政府印發(fā)了《海洋強(qiáng)省建設(shè)行動(dòng)計(jì)劃》，其中再次強(qiáng)調(diào)了要發(fā)展深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖，推進(jìn)近海漁業(yè)向深遠(yuǎn)海發(fā)展。PDD是本標(biāo)準(zhǔn)起草人團(tuán)隊(duì)在近十年的流行病調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的感染許氏平鲉、大黃魚(yú)等深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖魚(yú)類的新興病原菌，可引起嚴(yán)重的疾病和導(dǎo)致極高的死亡率。但不同PDD菌株的致病力存在顯著的差異性，部分無(wú)致病力PDD菌株即使感染魚(yú)類宿主也不會(huì)導(dǎo)致疾病和死亡。因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中精準(zhǔn)的檢測(cè)高致病性PDD菌株就能夠顯著提高疾病防控的有效性。本標(biāo)準(zhǔn)制訂實(shí)施后，對(duì)養(yǎng)殖企業(yè)預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效益體現(xiàn)在兩方面，一是建立的PDD檢測(cè)方法可以為生產(chǎn)中提供技術(shù)規(guī)范，通過(guò)對(duì)病原的檢測(cè)并提前采取措施實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的有效預(yù)防，從而顯著降低疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，減少病害損失。二是通過(guò)對(duì)不同致病力PDD菌株的精準(zhǔn)檢測(cè)，使對(duì)病原感染的防控更有針對(duì)性，更加精準(zhǔn)化，可以避免一些不必要的投入品（如藥物）的使用，為企業(yè)節(jié)約養(yǎng)殖成本，同時(shí)也有利于保護(hù)養(yǎng)殖水域的生態(tài)環(huán)境，創(chuàng)造較好的生態(tài)效益。5.標(biāo)準(zhǔn)涉及的相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)說(shuō)明。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，與本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容直接相關(guān)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)有：①國(guó)家發(fā)明專利，強(qiáng)致病性和非強(qiáng)致病性美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種的快速鑒定PCR反應(yīng)體系，專利號(hào)ZL201911178338.5，授權(quán)日期2020年7月3日。②國(guó)家發(fā)明專利，適用于美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種快速檢測(cè)的RPA反應(yīng)體系，專利號(hào)ZL202010558367.0，授權(quán)日期2021年8月10日。③上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文，不同美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種菌株對(duì)許氏平鲉致病力差異分析，論文作者施琳妮，論文提交時(shí)間2019年。④上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文，兩種海水魚(yú)類致病菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用，論文作者陳京，論文提交時(shí)間2020年。上述知識(shí)產(chǎn)權(quán)全部為本標(biāo)準(zhǔn)起草人團(tuán)隊(duì)完成并獲得，不存在知識(shí)產(chǎn)權(quán)糾紛的情況。6.采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度，以及與國(guó)際、國(guó)外同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比情況，或與測(cè)試的國(guó)外樣品有關(guān)數(shù)據(jù)的對(duì)比情況。通過(guò)對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)全文公開(kāi)系統(tǒng)（/bzgk/gb/）、中國(guó)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)（/）和中國(guó)知網(wǎng)（）等標(biāo)準(zhǔn)檢索網(wǎng)站的搜索查詢，未檢索到美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種檢測(cè)相關(guān)的國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)，僅檢索到《飼料中副溶血性弧菌的檢測(cè)》（GB/T26426-2010）、《食品微生物檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB4789.7-2013）等內(nèi)容相近但適用對(duì)象不同的標(biāo)準(zhǔn)。因此，本標(biāo)準(zhǔn)屬于新制訂的標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)在編制過(guò)程中，查閱和參考了美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種致病機(jī)理等方面的最新文獻(xiàn)資料，同時(shí)引用了SC/T7014-2006、SC/T201.1-2006、SC/T7015-2011、SN/T2102.1-2008等有關(guān)水生動(dòng)物病原檢疫、染病動(dòng)物無(wú)害化處理等方面的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合了美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種在我國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的流行情況和致病特點(diǎn)，制訂了本標(biāo)準(zhǔn)，以使本標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)內(nèi)容更加科學(xué)、完善，為在養(yǎng)殖生產(chǎn)中高效的開(kāi)展病原檢測(cè)提供技術(shù)依據(jù)。7.與現(xiàn)有相關(guān)法律法規(guī)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)性。本標(biāo)準(zhǔn)符合《中華人民共和國(guó)漁業(yè)法》和《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》的規(guī)定；符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展技術(shù)導(dǎo)則（2018-2030年）》和《加快推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見(jiàn)》的相關(guān)要求；符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局印發(fā)的《水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病防控指南（試行）》中“養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)定期開(kāi)展水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病監(jiān)測(cè)和檢測(cè)”的指導(dǎo)原則。本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容與現(xiàn)行的各項(xiàng)法律法規(guī)、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)及各部委規(guī)章相協(xié)調(diào)，均無(wú)沖突。8.重大意見(jiàn)分歧的處理經(jīng)過(guò)和依據(jù)。本標(biāo)準(zhǔn)的制訂立項(xiàng)、內(nèi)容審定和頒布實(shí)施都將履行專家評(píng)審制度，廣泛征求來(lái)自研究、生產(chǎn)、檢測(cè)、管理等單位的專家意見(jiàn)。截止目前，專家們對(duì)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容細(xì)節(jié)提出了很多修改和完善的建議，但并未對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)和制訂提出重大的分歧性意見(jiàn)。如果在后續(xù)的審定過(guò)程中出現(xiàn)重大分歧意見(jiàn)，將根據(jù)具體的意見(jiàn)內(nèi)容，按照標(biāo)準(zhǔn)審定程序，征集更多的專家意見(jiàn)，并按照少數(shù)服從多數(shù)的原則，與意見(jiàn)分歧專家進(jìn)行當(dāng)面溝通并協(xié)商解決。9.貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過(guò)渡辦法等內(nèi)容）。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布，將為海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中精準(zhǔn)的檢測(cè)PDD感染建立有章可循的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，從而指導(dǎo)養(yǎng)殖企業(yè)進(jìn)行科學(xué)防控，降低疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，保障漁業(yè)環(huán)境安全和養(yǎng)成水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。標(biāo)準(zhǔn)起草人團(tuán)隊(duì)將認(rèn)真做好標(biāo)準(zhǔn)文本的制訂、修改和送交評(píng)審等各項(xiàng)工作，同時(shí)在評(píng)審的過(guò)程中加強(qiáng)與評(píng)審專家、養(yǎng)殖企業(yè)、主管部門(mén)等的聯(lián)系溝通，利用各種渠道做好制訂本標(biāo)準(zhǔn)的目的、意義、精神、技術(shù)內(nèi)容方面的宣貫工作，宣傳標(biāo)準(zhǔn)化工作的重要性。同時(shí)，團(tuán)隊(duì)成員將結(jié)合自身的科研工作，加強(qiáng)對(duì)不同海水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)高致病性PDD菌株的監(jiān)測(cè)力度，定期對(duì)多種養(yǎng)殖生境下水產(chǎn)動(dòng)物病原攜帶情況進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，對(duì)高致病性PDD菌株的留存狀況和致病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行排查，從而推動(dòng)本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容在養(yǎng)殖企業(yè)中得以有效的實(shí)施，降低高致病性PDD菌株感染海水養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病的概率，減少因病損失。此外，鼓勵(lì)不同的科研單位和養(yǎng)殖生產(chǎn)企業(yè)結(jié)合科研生產(chǎn)的實(shí)際情況，針對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化和升級(jí)，為今后修訂本標(biāo)準(zhǔn)做好技術(shù)儲(chǔ)備。10.其他應(yīng)予說(shuō)明的事項(xiàng)。無(wú)。主要參考文獻(xiàn)劉瀟,張正,王麗芳,等.海南地區(qū)與環(huán)渤海灣美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種水產(chǎn)動(dòng)物分離株的表型與遺傳特征分析[J].微生物學(xué)報(bào),2021,61(07):2101-2111.FouzB,LarsenJL,NielsenBB,etal.CharacterizationofVibriodamselastrainsisolatedfromturbotScophthalmusmaximusinSpain[J].DiseasesofAquaticOrganisms,1992,12(3):155-166.TakahashiH,MiyaS,KimuraB,etal.DifferenceofgenotypicandphenotypiccharacteristicsandpathogenicitypotentialofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaebetweenclinicalandenvironmentalisolatesfromJapan[J].MicrobialPathogenesis,2008,45(2):150-158.RivasAJ,LemosML,OsorioCR.Photobacteriumdamselaesubsp.damselae,abacteriumpathogenicformarineanimalsandhumans[J].FrontiersinMicrobiology,2013,4.KregerAS.CytolyticactivityandvirulenceofVibriodamsela[J].InfectImmun,1984,44(2):326-331.BaladoM,PuentesB,CouceiroL,et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