《葡萄植株中7種植物激素含量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法》

ICS65.020.01

CCSB20

GXNS

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GXNSXXXX—XXXX

葡萄植株中7種植物激素含量的測(cè)定

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

Determinationof7phytohormonesingrapebyliquidchromatography-Mass

spectrometry/Massspectrometry

（征求意見(jiàn)稿）

在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

廣西農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全服務(wù)協(xié)會(huì)??發(fā)布

T/GXNSXXXX—XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由廣西大學(xué)提出。

本文件由廣西農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全服務(wù)協(xié)會(huì)歸口。

本文件起草單位：廣西大學(xué)、廣西西大檢測(cè)有限公司、廣西亞熱帶作物研究所、廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)

品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院、廣西思浦林科技有限公司。

本文件主要起草人：梁瓊月、黃宏飛、石梁穩(wěn)、范曉蘇、呂麗蘭、王博、何明遠(yuǎn)、黃麗寧、裴根、

沈方科、路丹、覃雪、隆銀燕、王士偉、黃超技、梁芳婷。

I

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葡萄植株中7種植物激素含量的測(cè)定

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

1范圍

本文件描述了液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定葡萄植株中7種植物內(nèi)源激素含量的原理，規(guī)定了試劑和

材料、儀器和設(shè)備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算和表述、精密度等的要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于葡萄植株的葉、芽、果等組織中玉米素、玉米素核苷、赤霉素A3、生長(zhǎng)素、水楊酸、

茉莉酸、脫落酸含量的測(cè)定。

本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限詳見(jiàn)附錄A中表A.1。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

植物激素planthormone

由植物自身合成，通常自產(chǎn)生部位移動(dòng)到作用部位，并在極低濃度下具有顯著生理作用的微量有機(jī)

物質(zhì)，也被稱為植物天然激素或植物內(nèi)源激素。

4原理

試樣用異丙醇混合溶液低溫震蕩提取植物激素，經(jīng)反相色譜柱分離，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)

定，外標(biāo)法定量。

5試劑和材料

除非另有說(shuō)明，本方法使用的試劑均為色譜純；水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。

異丙醇。

甲醇。

二氯甲烷。

鹽酸，優(yōu)級(jí)純。

異丙醇+水+鹽酸（2+1+0.003）：取20mL異丙醇（5.1）加10mL水，再加入0.03mL鹽酸（5.4），

混勻。

50%甲醇溶液：取50mL甲醇（5.2）加50mL水，混勻。

植物激素標(biāo)準(zhǔn)品：玉米素、玉米素核苷、赤霉素A3、生長(zhǎng)素、水楊酸、茉莉酸、脫落酸，化合物

信息詳見(jiàn)附錄A中表A.1，純度均≥98%。

單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取各植物激素標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1mg）至棕色容量瓶中，加入甲醇

（5.2）溶解配成濃度為1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-80℃避光保存，有效期為6個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別吸取7種植物激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1mL（5.8），置于10mL棕色容量瓶中，

用甲醇（5.2）稀釋成濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-80℃避光保存，有效期為3個(gè)月。

1

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混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.9）于10mL棕色容量瓶中，加

入已預(yù)冷的50%甲醇溶液（5.6）定容稀釋成濃度為0.02ng/mL~100ng/mL的植物激素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶

液，臨用新配。

液氮。

濾膜：0.22μm濾膜，有機(jī)相。

6儀器和設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。

電子天平：感量0.1mg。

渦旋混勻器。

低溫震蕩儀：溫度可至5℃。

超低溫冰箱：溫度可至-80℃。

氮吹儀。

7分析步驟

樣品制備

分別取新鮮的葡萄植株的葉、芽、果等部位供試樣，迅速用超純水洗凈樣品附著的雜物，表面水分

用吸水紙擦干，立即保存于液氮中。將樣品從液氮中取出，置于研缽中加液氮磨細(xì)，混勻，立即轉(zhuǎn)移至

-80℃冰箱避光保存。

試樣處理

稱取0.2g（精確至0.1mg）制備好的試樣于15mL塑料離心管中，加入2mL預(yù)冷（4℃）的提取

劑（5.5），置于5℃震蕩儀中以200r/min振蕩1h，再加入4mL預(yù)冷（4℃）的二氯甲烷（5.3），繼

續(xù)震蕩1h，取二氯甲烷層氮吹至近干。加入0.5mL預(yù)冷（4℃）的50%甲醇溶液（5.6）復(fù)溶，漩渦混

勻，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，濾液供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

儀器參考條件

7.3.1液相色譜參考條件

a）色譜柱：BEHC18柱，2.1mm×100mm，粒度1.7μm，或性能相當(dāng)者；

b）流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；

c）流速：0.3mL/min；

d）柱溫：40℃；

e）進(jìn)樣量：5μL。

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表1流動(dòng)相梯度洗脫程序

時(shí)間/min流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)/%流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)/%

08020

65050

80100

100100

10.18020

138020

7.3.2質(zhì)譜參考條件

a）離子源：ESI源；

b）掃描方式：正離子掃描模式和負(fù)離子掃描模式（參見(jiàn)附錄B）；

c）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM）；

d）干燥氣、霧化氣、碰撞氣均為高純氮?dú)?，使用前?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要

求，參考條件參見(jiàn)附錄B；

e）監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度，參考條件參見(jiàn)附錄B。

測(cè)定

7.4.1定性測(cè)定

在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果樣品中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的保留

時(shí)間一致（變化范圍在±2.5%以內(nèi)），且樣品譜圖中待測(cè)組分監(jiān)測(cè)離子的相對(duì)豐度和濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品

的相對(duì)豐度一致，允許偏差不超過(guò)表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物。

表2定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

相對(duì)離子豐度/%>50>20～50>10～20≤10

允許的相對(duì)偏差/%±20±25±30±50

7.4.2定量測(cè)定

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，將植物激素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低到高濃度依次進(jìn)樣分析，以被測(cè)物的峰

面積為縱坐標(biāo)，以被測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)，根據(jù)樣品含量繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量，應(yīng)使樣品溶

液中各被測(cè)物的響應(yīng)值在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)，如果含量超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線范圍上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋樣

液后重新測(cè)定。上述條件下，各植物激素的參考保留時(shí)間參見(jiàn)附錄B中表B.1，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖參見(jiàn)附錄C。

平行試驗(yàn)

按7.2～7.4步驟對(duì)同一試樣進(jìn)行兩次平行測(cè)定。

空白試驗(yàn)

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除不稱取試樣外，按7.2～7.4步驟進(jìn)行空白操作。

8結(jié)果計(jì)算和表述

試樣中待測(cè)物的含量按公式（1）計(jì)算：

C×V×f

ω=…………（1）

m

式中：

——試樣中待測(cè)物含量，單位為納克每克（ng/g）；

C——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測(cè)組分溶液質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

f——稀釋倍數(shù)；

V——定容體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）；

m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。

計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

9精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于其算術(shù)平均值的15%。

在再現(xiàn)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于其算術(shù)平均值的20%。

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附錄A

(規(guī)范性附錄）

7種植物激素中英文名字（縮寫）、CAS號(hào)、方法檢出限

7種植物激素中英文名字（縮寫）、CAS號(hào)、方法檢出限見(jiàn)表A.1。

表A.17種植物激素中英文名字（縮寫）、CAS號(hào)、方法檢出限

序號(hào)中文名稱英文名稱（縮寫）CAS號(hào)方法檢出限/(ng/g)

1玉米素trans-Zeati（Z）1637-39-40.25

2玉米素核苷trans-Zeatin-Riboside（ZR）6025-53-20.025

3生長(zhǎng)素Auxin（IAA）87-51-40.125

4赤霉素A3Gibberellins（GA3）77-06-50.25

5水楊酸SalicylicAcid（SA）69-72-70.125

6脫落酸AbscisicAcid(ABA）14375-45-20.25

7茉莉酸JasmonicAcid（JA）3572-66-50.125

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附錄B

(資料性附錄）

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜參數(shù)參考條件

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜參數(shù)參考條件如下：

a）離子源：電噴霧離子源（ESI）

b）掃描模式：正離子掃描模式和負(fù)離子掃描模式（參見(jiàn)表B.1）；

c）離子源溫度：105℃；

d）電噴霧電壓：4800V；

e）碰撞氣流量：0.75mL/min；

f）去溶劑氣流量：6L/min；

g）擋板電壓：700V；

h）去溶劑氣溫度：480℃；

i）定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表B.1。

表B.17種植物激素的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量

保留錐孔

序英文名定量離子定性離子碰撞能量

中文名稱時(shí)間電壓

號(hào)縮寫m/zm/zV

minV

正離子掃描模式

1玉米素Z1.30220.2/136220.2/136；220.2/202.25020；14

2玉米素核苷Z(yǔ)R2.18352.2/136.1352.2/136.1；352.2/220.25042；20

3生長(zhǎng)素IAA4.39176.1/130176.1/130；176.1/102.95018；40

負(fù)離子掃描模式

4赤霉素A3GA33.79345.1/143345.1/143；345.1/221.15036；36

5水楊酸SA4.98137.1/93.1137.1