《貓細小病毒實時熒光 RAA 檢測方法》

ICS11.220

B41

團體標準

T/CVMAXXXXX—XXXX

貓細小病毒實時熒光RAA檢測方法

Real-timeRAAmethodfordetectionoffelineparvovirus

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征求意見稿

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（征求意見稿）

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XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布

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貓細小病毒實時熒光RAA檢測方法

1范圍

本文件規(guī)定了貓細小病毒實時熒光RAA檢測方法的要求。

本文件適用于貓細小病毒核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T27401—2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

實時熒光RAAReal-timeRAA

一種重組酶介導的等溫核酸快速擴增技術(shù)（簡稱RAA技術(shù)）。利用從細菌或真菌中獲得的重組酶，

在恒溫下（一般37℃~42℃），該重組酶可與引物緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，在單鏈DNA結(jié)

合蛋白的幫助下，打開模板DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，當引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補序列時，

在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，擴增產(chǎn)物以指數(shù)級增長。利用熒光探針的標記，隨著

RAA反應的進行，RAA產(chǎn)物與熒光信號的增長呈現(xiàn)對應關(guān)系。

3.2

Ct值cyclethreshold

每個反應管內(nèi)的熒光信號量達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4符號和縮略語

下列縮略語適用于本文件。

RAA：重組酶介導的核酸擴增（recombinase-aidednucleicacidamplification）

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

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PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）

FPV：貓細小病毒（felineparvovirus）

5試劑和材料

5.1試劑

5.1.1總則：除非另有說明，所用試劑均為分析純，試驗用水符合GB/T6682的要求。

5.1.2PBS緩沖液（0.01mol/LPBS，pH7.4）：用800mL蒸餾水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4

和0.24gKH2PO4，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，121℃高壓滅菌15min。

5.1.3DNA提取試劑盒。

5.1.4RAA反應預混液。

5.1.5引物和探針，其序列見附錄A。

5.1.6RAA熒光基礎(chǔ)反應單元：包含重組酶，單鏈結(jié)合蛋白，DNA聚合酶的凍干粉。

5.1.7280mmol/L乙酸鎂。

5.2耗材

5.2.1帶濾芯移液器吸頭（規(guī)格：10μL、20μL、200μL和1000μL）。

5.2.21.5mL滅菌離心管。

5.2.30.2mLPCR光學反應管。

5.2.4冰盒（?20℃以下預冷）。

6儀器設(shè)備

6.1微量移液器（量程：0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μL～200μL和200μL～1000μL）。

6.2冰箱（2℃～8℃和?20℃以下）。

6.3高速冷凍離心機。

6.4實時熒光PCR儀或恒溫熒光基因檢測儀。

7樣品的采集與處理

7.1總則

實驗室生物安全要求按照GB19489的規(guī)定。

7.2采樣工具

非抗凝真空采血管、無菌棉拭子、5mL滅菌離心管、滅菌剪刀、組織研磨器。

7.3樣品采集

7.3.1血清樣品采集

用非抗凝真空采血管采集全血。

7.3.2糞便或肛拭子樣品采集

2

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用無菌棉拭子采集貓新鮮糞便，或插入肛門轉(zhuǎn)圈3~4次采集肛拭子，將拭子放入5mL滅菌離心管

中，加入2mLPBS緩沖液，浸泡20min~30min。

7.3.3腸道等組織樣品采集

無菌采集貓腸道等組織樣品，放入5mL滅菌離心管中。

7.4樣品保存和運輸

采集的樣品可立即用于檢測。不能立即檢測的樣品，在2℃~8℃下保存應不超過24h，-18℃及以

下可以穩(wěn)定保存3個月，-70℃及以下可長期保存。樣品運送采用低溫保存進行運輸，并在規(guī)定溫度下

的保存期內(nèi)送達實驗室。

7.5樣品處理

7.5.1血清樣品處理

采集的樣品室溫靜置30min~60min，全血采用4000r/min離心5min，吸取1mL上清液至1.5mL滅

菌離心管內(nèi)備用。

7.5.2糞便或肛拭子樣品處理

采集的樣品振蕩、擠干拭子，浸泡液采用5000r/min離心10min，吸取1mL上清液至1.5mL滅

菌離心管內(nèi)備用。

7.5.3腸道等組織樣品處理

取1g組織樣品，剪碎，加入2mLPBS緩沖液，勻漿研磨制成懸液，反復凍融3次，5000r/min

離心10min，吸取1mL上清液至1.5mL滅菌離心管內(nèi)備用。

7.5.4細胞培養(yǎng)上清液處理

細胞培養(yǎng)上清液2000r/min離心5min，吸取1mL上清液至1.5mL滅菌離心管內(nèi)備用。

8實時熒光RAA操作程序

8.1DNA提取

8.1.1采用DNA提取試劑盒提取各類樣本中的病毒核酸，或用自動化核酸提取儀提取各類樣本中的

病毒核酸。如在2h內(nèi)檢測可將提取的核酸置于冰上保存，否則應置于-20℃冰箱保存。

8.1.2每次抽提核酸，應至少包括一個陽性對照和一個陰性對照。陽性對照樣品應為FPV核酸陽性樣

本（血清、糞便、肛拭子、腸道等組織或細胞培養(yǎng)上清液）；陰性對照樣品應為去離子水或者FPV核

酸陰性樣本（血清、糞便、肛拭子、腸道等組織或細胞培養(yǎng)上清液）。

8.2實時熒光RAA檢測

8.2.1反應體系的配制

在試劑配制區(qū)進行。每個樣品配制43μL熒光RAA反應混合液，包括：RAA預混液25μL、正向引物

FPV-F（10μmol/L）2.1μL、反向引物FPV-R（10μmol/L）2.1μL、探針FPV-P（10μmol/L）0.6μL、去

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離子水13.2μL。將熒光RAA反應混合液加入RAA熒光基礎(chǔ)反應單元中；將2μLDNA模板加入每個反應

管中，將5μL乙酸鎂加在反應單元管蓋上。每次進行熒光RAA擴增時均應設(shè)立陽性、陰性及空白對照。

陽性對照應用陽性對照樣品所提取核酸作為模板，陰性對照應用陰性對照樣品所提取核酸作為模板，空

白對照應用去離子水作為模板。配制反應液在冰盒中進行。

8.2.2實時熒光RAA反應程序

8.2.2.1熒光通道設(shè)置

在檢測區(qū)進行。將配制好的反應液短暫離心后放入熒光PCR檢測儀或恒溫熒光基因檢測儀中。設(shè)置

報告熒光為FAM，采用其他報告熒光應按儀器說明設(shè)定對應通道；淬滅熒光設(shè)定為None，校準熒光設(shè)

定為None?？筛鶕?jù)不同品牌儀器說明等效設(shè)置參數(shù)。

8.2.2.2循環(huán)條件設(shè)置與檢測

39℃，60s，1個循環(huán)；39℃，30s，40個循環(huán)，每次循環(huán)時收集熒光信號。

8.2.3試驗成立條件

8.2.3.1熒光PCR檢測儀陽性對照有熒光對數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，相應的Ct值

≤30.0；陰性對照無熒光對數(shù)增長，相應的無報告Ct值，試驗結(jié)果有效；否則應重新進行試驗。

8.2.3.2恒溫熒光基因檢測儀陽性對照起峰時間≤5min且出現(xiàn)特異性起峰曲線，陰性對照無起峰時間

或陰性對照起峰時間＞10min且無特異性起峰曲線，試驗結(jié)果有效；否則應重新進行試驗。

8.2.4結(jié)果判定

8.2.4.1符合8.2.3.1的條件，被檢樣品對數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，相應的Ct值≤30.0，

則判為FPV核酸陽性；被檢樣品無熒光對數(shù)增長，相應的無報告Ct值，或者Ct值>30.0，或者無典型

的擴增曲線，則判定為FPV核酸陰性。

8.2.4.2符合8.2.3.2的條件，被檢樣品起峰時間≤10min，且出現(xiàn)特異性起峰曲線，則判為FPV核酸陽

性；被檢樣品無起峰時間或被檢樣品起峰時間＞10min且無特異性起峰曲線，則判定為FPV核酸陰性。

9檢測過程中防止交叉污染的措施

檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27401—2008中5.3.13的規(guī)定執(zhí)行。

4

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

引物和探針

引物、探針的名稱和序列見表A.1

表A.