表面化學(xué)分析 表面表征 共聚焦熒光顯微鏡橫向分辨的測量 征求意見稿

GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20151表面化學(xué)分析表面表征共聚焦熒光顯微鏡橫向分辨的測量本文件描述了一種通過對尺寸比預(yù)期分辨小得多的物體成像來測定共聚焦熒光分辨的方法。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1點擴(kuò)展函數(shù)pointspreadfunction成像系統(tǒng)對點光源或點狀物體的響應(yīng)。3.2橫向分辨lateralresolution在樣品表面平面內(nèi)或在與圖像形成光學(xué)器件的軸線成直角的平面內(nèi)能可信區(qū)分成分變化所對應(yīng)的測量距離。4符號和縮略語下列符號和縮略語適用于本文件。APD：雪崩光電二極管（avalanchephotodiode）CFM：共聚焦熒光顯微鏡（confocalfluorescencemicroscope）FWHM：半高峰寬（fullwidthathalf-maximum）LSCM：激光掃描共聚焦顯微鏡（laserscanningconfocalmicroscope）NA：數(shù)值孔徑（numericalaperture）OL：物鏡（objectivelens）PMT：光電倍增管（photomultipliertube）PSF：點擴(kuò)展函數(shù)（pointspreadfunction）QD：量子點（quantumpoint）5概述GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:201525.1背景信息度，因此空間分辨可以得到提高[2]。像相比，根據(jù)熒光波長所形成的圖像具有更好的對比度，且在一張圖像中進(jìn)行多色成像也是可能的。處理。通過CFM對薄膜或納米級物體進(jìn)行成像和化學(xué)分析的過程中，當(dāng)物體軸向尺寸明顯小于CFM軸向分辨的典型數(shù)值時，橫向分辨尤為重要。不同的制造商常用不同的方法來表征儀器的空間分辨。本文件提供了一種測量CFM儀器橫向空間分辨的方便、有效方法，它適用于非專業(yè)操作者使用。本文件中的術(shù)語和分析程序符合ISO18516[3]。5.2CFM的操作類型5.2.1概要這里根據(jù)樣品的激光聚焦掃描技術(shù)來描述不同操作模式的CFM。本文件的主要對象為臺式掃描CFM和激光掃描CFM。5.2.2臺式掃描CFM由于CFM中涉及的光學(xué)器件是靜止的，因此光路簡單且?guī)缀醪恍枰S護(hù)。光學(xué)準(zhǔn)直過程中的像差或漂移被最小化。掃描區(qū)域的大小只受樣品掃描臺的機(jī)械運動的影響，因此可以進(jìn)行大面積掃描。精細(xì)單元進(jìn)行成像。5.2.3激光掃描CFM此保持了樣品的狀態(tài)。限，且掃描區(qū)域的大小還取決于物鏡的放大倍率。在這種情況下，優(yōu)先使用具有高NA（具有較好的采集效率和較高的分辨）的低倍物鏡（具有較大的掃描區(qū)域）。5.2.4轉(zhuǎn)盤式CFM高速轉(zhuǎn)盤會涉及多個激光焦點和共軛探測器針孔。5.3影響CFM橫向分辨的參數(shù)5.3.1概要通過測量CFM的PSF橫向尺寸來評估橫向分辨。光學(xué)顯微鏡空間分辨的理論極限為：GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20153阿貝分辨X,Y=λ/2NA和阿貝分辨Z=2λ/NA2相關(guān)參數(shù)的全面綜述和確定PSF尺寸的實驗方案可通過文獻(xiàn)[2,5~7]獲得。5.3.2物鏡激光聚焦尺寸和采集體積取決于物鏡（OL）的NA，因此物鏡對CFM圖像的橫向分辨有直接影響。5.3.3探測針孔的尺寸和鏡筒透鏡的焦距探測針孔的最佳尺寸須由操作人員來酌情選擇。由于探測針孔經(jīng)鏡筒透鏡和OL在樣品平面上的成像尺寸比其實際尺寸更為重要，因此也宜對OL和鏡筒透鏡的放大倍率進(jìn)行規(guī)定。5.3.4激光照明光束的準(zhǔn)直和純度只要照明光束經(jīng)準(zhǔn)直且填充OL的背孔，就可能達(dá)到OL的預(yù)期性能。5.3.5激光照明的偏振性輸入激光的偏振性會影響PSF的形狀和尺寸。線性偏振光照明會沿著偏振方向拉長PSF[8]。5.3.6激發(fā)和發(fā)射波長發(fā)射波長不同于（大于）激發(fā)波長，它會降低分辨[2]。5.3.7圖像對比度為了準(zhǔn)確測量橫向分辨，要求CFM圖像具有好的對比度。影響CFM圖像對比度的經(jīng)驗因素包括光學(xué)器件的清潔度、信號強(qiáng)度、噪聲、光電探測器的靈敏度、光路的通量和光束偏振性等。6通過對小尺寸物體成像來測量橫向分辨6.1背景信息可通過對一個非常小的物體成像來估算CFM的橫向分辨。由于可從單一的CFM圖像中獲得直接顯由于小物體的有限尺寸對其在CFM圖像中所觀察到的尺寸有貢獻(xiàn)，因此所觀察到的圖像代表了PSF和熒光納米顆粒。圖1給出了通過CFM測量熒光珠以及提取用于估算FWHM的譜線輪廓的示意圖。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20154圖1獲得的熒光圖像及用于估算CFM儀器橫向分辨的單個熒光珠橫截面輪廓的FWHM6.2樣品選擇和樣品要求如果熒光納米顆粒的尺寸與CFM的PSF的尺寸相當(dāng)，則需要一去卷積過程來推導(dǎo)顯微鏡的實際于300nm的PSF，典型PSF尺寸的四分之一為75nm，這表明能使用75nm的納米顆粒作能通過其它高分辨顯微鏡來獲得，如原子力顯微鏡和電子顯微鏡。中進(jìn)行超聲清洗，然后再用H2O進(jìn)行清洗，等離子體清洗同樣有效[10,11]。6.3儀器運行前的參數(shù)設(shè)置通過CFM獲得的圖像質(zhì)量取決于操作者的技能和實驗參數(shù)。在給定的參數(shù)設(shè)置下，不同的操作者件并不強(qiáng)制要求在操作CFM儀器時使用特定的實驗參數(shù)。與之相反，操作者可根據(jù)自己的決定選擇合適的實驗參數(shù)來優(yōu)化CFM成像。這些參數(shù)包括但不限于激發(fā)激光的波長和光束質(zhì)量、照明光束的偏振分之一，也就是說，橫向分辨的數(shù)值范圍宜定義為至少5個像素[3,4]。6.4數(shù)據(jù)采集和分析6.4.1選擇合適的光斑有所不同，典型的程序如下：1)開啟激光，確保通向樣品的光路暢通，且所有光學(xué)器件都安裝到位。2)安裝可獲得的具有最高NA的物鏡。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:201553)將制備好的樣品置于顯微鏡載物臺上，通過目鏡或相機(jī)顯示器觀察，使其緊密聚焦。4)轉(zhuǎn)動或調(diào)整必要的濾光器輪或分束器，使得從樣品表面反射的激光能被光電探測器探測到。5)在監(jiān)測光電探測器輸出的過程中，在最小的激光功率條件下調(diào)節(jié)OL與樣品之間的距離或探測針孔的位置（若可調(diào)），使得光電探測器的輸出最大化，從而實現(xiàn)對聚焦的微調(diào)。6)在仍能提供好的圖像對比度的前提下，使用探測針孔的最小尺寸。這一步驟主要取決于操作者的判斷。7)精細(xì)聚焦后，插入長通濾光器或控制計算機(jī)，使得阻擋激光進(jìn)入光電探測器的長通濾光器就位，提高激光功率。8)若所用儀器能以線掃描方式實時監(jiān)測光電探測器的輸出且樣品是高度熒光的，則能通過監(jiān)測熒光光強(qiáng)和使用長通濾光器來調(diào)整焦點和針孔位置，以嘗試改善聚焦和準(zhǔn)直。9)確定掃描方向、圖像大小、像素數(shù)和掃描速度（或像素駐留時間）。10)進(jìn)行成像并保存數(shù)據(jù)用于分析。測量FWHM。在選擇亮斑時，應(yīng)符合以下條件：1)亮斑應(yīng)是孤立的且不與相鄰的斑點重疊。建議對儀器進(jìn)行檢查。6.4.2通過譜帶平均處理提取譜線輪廓為了獲得單個光斑輪廓的代表性FWHM，應(yīng)使用譜帶平均處理方法。首先選擇由多條（至少5條）成線條得到的。圖2給出了在單個熒光光斑上進(jìn)行譜線輪廓譜帶平均處理的過程。譜帶應(yīng)沿著微珠輪廓的短軸和長軸方向選擇。為了用于FWHM的估算，得到的譜線輪廓應(yīng)滿足以下兩個條件：1)譜線輪廓的總長度宜至少是預(yù)期分辨的5倍[3]。也是用于估算橫向分辨的橫截面輪廓兩側(cè)平臺的峰高之間的最大變化值。圖2提取用于FWHM估算的代表性譜線輪廓的譜帶平均處理6.5數(shù)據(jù)記錄測得的PSF的FWHM直接受OL和激光激發(fā)和探測波長的影響，因此只有在正確描述這些實驗參數(shù)時，橫向分辨才有意義。應(yīng)提供的其它相關(guān)參數(shù)包括：a)CFM的操作類型：臺式掃描或激光掃描。b)OL的規(guī)格：空氣、油浸、水浸、NA和放大倍率。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20156預(yù)計針孔尺寸是一個可供選擇的參數(shù)，它可在此說明。d)激發(fā)波長和探測波長。e)輸入光的偏振態(tài)。f)樣品上激光焦點的功率。g)樣品描述：用于成像的納米顆?；騋D的已知尺寸。h)圖像區(qū)域的大小，單位為μm。i)x和y方向上的像素數(shù)。j)快速掃描方向。k)用于測量橫向分辨的譜線輪廓的信噪比。l)CFM圖像中單個顆粒在x軸和y軸的FWHMs。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20157樣品制備與數(shù)據(jù)和分析示例A.1樣品制備這里介紹了使用熒光納米珠作為測試樣品來測量CFM橫向分辨的一個示例。只要顆粒能被近似為一個點光源，則任何類型固定在平面基底上的納米米顆粒的橫向尺寸不宜超過預(yù)期分辨的四分之一。顆粒。基底的清潔程度非常重要，它可用Piranha溶液[6]進(jìn)行清洗，也可在堿性的1MKOH溶液中進(jìn)行超聲清洗，然后再用H2O進(jìn)行清洗，等離子體清洗同樣有效[7,8]。制備樣品的實際操作步驟如下：進(jìn)行清洗。2)KOH浸泡時間為30min，丙酮和水清洗時間分別為15min；KOH溶液可溶解附著在載玻片上的無機(jī)物，丙酮可去除有機(jī)物，最后用水清洗掉載玻片上的所有物質(zhì)。3)重復(fù)步驟2）2~3次后，利用空氣輕輕吹干載玻片。5)通過旋涂（5000rpm、60s）分別下，使用稀釋200000倍的懸濁液得到的樣品通常每100μm2上有幾十個顆粒。A.2數(shù)據(jù)采集和分析這里采用德國Witec公司生產(chǎn)的Alpha300型CFM對6.1詳細(xì)的獲取顆粒圖像的實驗程序如下：行優(yōu)化。測器，從而顯著提高圖像的對比度。該芯的尺寸相當(dāng)于2倍的艾里斑。5)通過激光掃描樣品臺實現(xiàn)對樣品的光柵掃描，獲得CFM圖像。圖A1給出了沿著x和y方向進(jìn)行譜帶平均處理得到的同一GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20158圖A.1同一光斑的譜帶平均譜線輪廓A.3數(shù)據(jù)記錄表A.1數(shù)據(jù)記錄示例488nm樣品處為（2~3）μW5μL黃色熒光珠（Invitrogen公司）水溶液旋涂在載玻直徑約20nm60×60pixelsx軸0.33Hz（242.2±3.8）nm（242.1±3.8）nmGB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20159[1]ISO18115-1,Surfacechemicalanalysis—Vocabulary—Part1:Generaltermsandtermsusedinspectroscopy.[2]STELZERE.H.K.Contrast,resolution,pixilation,dynamicrangeandsignal-to-noiseratio:Fundamentallimitstoresolutioninfluorescencelightmicroscopy,JournalofMicroscopy,v189(1998)pp.15-24.[3]ISO18516,Surfacechemicalanalysis—AugerelectronspectroscopyandX-rayphotoelectronspectroscopy—Determinationoflateralresolution.[4]WILKENINGG.&KOENDERSL.Nanoscalecalibrationstandardsandmethods.Chapter21.Wiley-VCH,2005.[5]COLER.W.,JINADASAT.,BROWNC.M.Measuringandinterpretingpointspreadfunctionstodetermineconfocalmicroscoperesolutionandensurequalitycontrol,NatureProtocols,[6]ZUCKER,R.M.ConfocalMicroscopy.MethodsandProtocols.EvaluatingConfocalMicroscopySystemPerformance.Springer,2006.[7]MURRAYJ.M.,APPLETONP.L.,SWEDLOWJ.R.,WATERSJ.C.Evaluatingperformanceinthree-dimensionalfluorescencemicroscopy.JournalofMicroscopy,v228(2007)pp.390-405.[8]KIMJ.,KIMD.C,BAEKS.H.Demonstration