DB12T 648-2016 黃瓜品種純度SSR分子標(biāo)記檢測方法　

B31DB12黃瓜品種純度SSR分子標(biāo)記檢測方法MethodsofidentifyingvarietalpurityofcucumberbyusingSSR-basedmarkers天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、天津市蔬菜研究黃瓜品種純度SSR分子標(biāo)記檢測方法下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和NY/T2474黃瓜品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法品種純度指種子在SSR分子標(biāo)記帶型方面典型一致的程度，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣品種子粒數(shù)的百分率表示，以反映某品種特征特性的一致性由幾個(gè)核苷酸（1-6個(gè)）為重復(fù)單位聚集而成的長達(dá)幾十個(gè)至幾百個(gè)bp（一般為100-200bp）的串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不SSR分布于黃瓜整個(gè)基因組，每個(gè)位點(diǎn)上重復(fù)單位的數(shù)目不同造成了品種間的多態(tài)性，利用PCR技術(shù)將多態(tài)的SSR擴(kuò)增出來，通過電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，利用電泳圖譜進(jìn)行黃瓜品種純乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2三羥甲基氨基甲烷（Tris鹽酸（HCl，36%十二烷基硫酸鈉（SDS）；氯化鈉（NaCl）；氫氧化鈉（NaOH）；硼酸；去離子甲酰胺；溴酚藍(lán)；二甲苯青）；）；按照GB/T3543.2規(guī)定方法扦樣，從送檢樣品中隨機(jī)取10g種子，分別隨機(jī)取其親本種子在玻璃培養(yǎng)皿底部墊上一層厚度適宜的棉花，用自來水浸濕后均勻地撒上種子，再于表取單株幼苗子葉，放入1.5mL離心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL離心管中。將DNA提取液預(yù)篩選帶型清晰，雙親間差異大，互補(bǔ)性好的引物作為純度檢測的SSR按照附錄C規(guī)定的方法，進(jìn)行4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣品種子粒數(shù)的百分率表示純度，計(jì)算公式如下：純度%=具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)×100%檢測樣品種子粒數(shù)4A.1DNA提取液按照引物合成單的說明先配制100μmol/L的儲(chǔ)存液，取適量儲(chǔ)存液稀釋40倍，配制濃度為2.5mmol/L的使用液。A.36×變性上樣緩沖液Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDA.540%丙烯胺膠丙烯酰胺190g，甲叉雙丙烯酰胺10A.64.5%丙烯胺膠20μL親和硅烷，20μL冰醋酸，加無水乙醇至2mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。A.82%剝離硅烷0.1g過硫酸銨溶于1mL超純水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。R:GGAGAGAAATTGGAATTCF:GGGTCTAATATTTGGGGR:GTTTCGCACTCACTCTTF:ACTATCATTCTTTATCCCCAR:TGTAAAAGTGATCAGGAGGR:TGCAATTATGGCAAATCR:TCCATGGTACAACAAGAAF:CATTCTAGGTCAATGAATR:GGGATATGCGTTTGCATF:CCTCTAGACTGAAAAAGAGR:ATTATTTGGGCCTTTGGR:CACACTCTTATGGCTTTCGF:TTGGAAAAGTCGCCAAF:AGAGGGCAAATTGGTGAR:TCCATCCTGTATGATTTGAF:GAGCCATCCATCAGAGR:ACCCACAAGCTTCAGAF:AGGTACGAAACAACGGR:TCGCACTCACTCTTTAF:CACACCATTTACGGTTAR:CATTTGGTTCAGAAAGR:TGGTCAATGAGCTTAGCTTR:AATTTGGTCCAACCCAF:GCAGGTCAGCACCTTCR:TACGCCCGATATTCTTF:CTGGTGGGTTTTCTGAF:AAGTTTATATTACAGTTGCAACR:TGCACATGTTTAATGGR:TCAAGCCGATTTCTCTTR:AGAAGAACACCTGGAACAF:ACCAACTTGTGAAAGGR:CACATGATTCACTTCCTTTCAF:TTTGAGCCTTGAGGCAAR:GCAATTCAACGTAATGF:CACATGACACAAACACAATR:GAGTCCCCAAAAGCAAF:ATTTCTTCCCCCACCAAR:ATGAATCCTCCTCCCAF:CCCTGCAGCTCTTCTTTR:TGGTTACAGAAGCAAAAF:AAACGTCGATCGAGAGR:AAAGAACCGCCATGTC將玻璃板洗凈，用無水乙醇擦兩遍，晾干。在長板上涂1%親和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作過程中防止兩塊玻璃板互相污染。待玻璃板徹底干燥后，將生。灌膠結(jié)束后，將梳子齒向外，輕輕的插入膠中，使其聚合1h以上。待膠凝固后，拔出梳子，將電泳槽組裝好，80W恒功率下預(yù)電泳15min~在20μLPCR產(chǎn)物中加入4μ