第三節(jié)微生物的代謝調(diào)控與發(fā)酵生產(chǎn)

節(jié)微生物的代謝調(diào)控與發(fā)酵生產(chǎn)

2021/6/271一.酶活性的調(diào)節(jié)通過(guò)改變現(xiàn)成的酶分子活性來(lái)調(diào)節(jié)新陳代謝的速率的方式。是酶分子水平上的調(diào)節(jié)，屬于粗放的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方式：包括兩個(gè)方面：(1)酶的激活：在代謝途徑中后面的反應(yīng)可被較前面的反應(yīng)產(chǎn)物所促進(jìn)的現(xiàn)象；常見(jiàn)于分解代謝途徑。(2)反饋抑制指生物代謝途徑的末端產(chǎn)物過(guò)量時(shí)可反過(guò)來(lái)直接抑制該途徑中第一個(gè)酶的活性。主要表現(xiàn)在氨基酸、核苷酸等合成途徑中。特點(diǎn)：作用直接、效果快速、末端產(chǎn)物濃度降低時(shí)又可解除。2021/6/272(1)直線(xiàn)式代謝途徑中的反饋抑制： 蘇氨酸脫氨酶蘇氨酸 α-酮丁酸 異亮氨酸 反饋抑制(2)分支代謝途徑中的反饋抑制：在分支代謝途徑中，反饋抑制的情況較為復(fù)雜，為了避免在一個(gè)分支上的產(chǎn)物過(guò)多時(shí)不致同時(shí)影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物發(fā)展出多種調(diào)節(jié)方式。主要有：同功酶的調(diào)節(jié)，順序反饋，協(xié)同反饋，積累反饋調(diào)節(jié)等。

反饋抑制的類(lèi)型2021/6/273同功酶調(diào)節(jié)

定義：催化相同的生化反應(yīng)，而酶分子結(jié)構(gòu)有差別的一組酶。意義：在一個(gè)分支代謝途徑中，如果在分支點(diǎn)以前的一個(gè)較早的反應(yīng)是由幾個(gè)同功酶催化時(shí)，則分支代謝的幾個(gè)最終產(chǎn)物往往分別對(duì)這幾個(gè)同功酶發(fā)生抑制作用。———某一產(chǎn)物過(guò)量?jī)H抑制相應(yīng)的酶的活性，對(duì)其他產(chǎn)物沒(méi)影響。舉例：大腸桿菌的天冬氨酸族氨基酸合成的調(diào)節(jié)2021/6/274協(xié)同反饋抑制定義：分支代謝途徑中幾個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)才能抑制共同途徑中的第一個(gè)酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式。舉例：谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum） 多粘芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa） 天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受賴(lài)氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制。2021/6/275

天冬氨酸 E,R

4-磷酸天冬氨酸

E 天冬氨酸半醛 E,R E二氫吡啶二羧酸 同型絲氨酸 同型絲氨酸磷酸

E,R R O-琥珀酰同型絲氨酸 蘇氨酸

E,R六氫吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸

R

二氨基庚二酸 同型半胱氨酸

R

賴(lài)氨酸 甲硫氨酸 異亮氨酸天冬氨酸族

（谷氨酸棒桿菌）2021/6/276累積反饋抑制定義：每一分支途徑末端產(chǎn)物按一定百分比單獨(dú)抑制共同途徑中前面的酶，所以當(dāng)幾種末端產(chǎn)物共同存在時(shí)它們的抑制作用是積累的，各末端產(chǎn)物之間既無(wú)協(xié)同效應(yīng)，亦無(wú)拮抗作用。2021/6/277順序反饋抑制分支代謝途徑中的兩個(gè)末端產(chǎn)物，不能直接抑制代謝途徑中的第一個(gè)酶，而是分別抑制分支點(diǎn)后的反應(yīng)步驟，造成分支點(diǎn)上中間產(chǎn)物的積累，然后再反饋抑制第一個(gè)酶的活性。只有當(dāng)兩個(gè)末端產(chǎn)物都過(guò)量時(shí)，才能對(duì)途徑中的第一個(gè)酶起到抑制作用。2021/6/278二.酶合成的調(diào)節(jié)通過(guò)調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速率的調(diào)節(jié)機(jī)制，是基因水平上的調(diào)節(jié)，屬于精細(xì)的調(diào)節(jié)，但間接而緩慢。酶合成調(diào)節(jié)的類(lèi)型1.酶合成的誘導(dǎo)(induction)：是酶促分解底物或產(chǎn)物誘使微生物細(xì)胞合成分解代謝途徑中有關(guān)酶的過(guò)程。舉例：E.coli在含乳糖的培養(yǎng)基中合成β-半乳糖苷酶和半乳糖苷滲透酶等。誘導(dǎo)物(inducer)：底物或結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，如：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。2021/6/279按照酶的合成與環(huán)境影響的不同關(guān)系，可以將酶分為兩大類(lèi):

組成酶(Structuralenzymes)

它們的合成與環(huán)境無(wú)關(guān)，隨菌體形成而合成，是細(xì)胞固有的酶，在菌體內(nèi)的含量相對(duì)穩(wěn)定。如糖酵解途徑（EMP）有關(guān)的酶。誘導(dǎo)酶(Inducibleenzyme)

只有在環(huán)境中存在誘導(dǎo)劑（Inducer)時(shí)，它們才開(kāi)始合成，一旦環(huán)境中沒(méi)有了誘導(dǎo)劑，合成就終止2021/6/27102.酶合成的阻遏是阻礙代謝過(guò)程中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的合成的現(xiàn)象，從而更徹底地控制和減少末端產(chǎn)物的合成?！镒瓒糇饔玫念?lèi)型：①末端產(chǎn)物阻遏（end-productrepression）：由于終產(chǎn)物的過(guò)量積累而導(dǎo)致生物合成途徑中酶合成的阻遏的現(xiàn)象，常常發(fā)生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等這些重要結(jié)構(gòu)元件生物合成的時(shí)候。例如過(guò)量的精氨酸阻遏了參與合成精氨酸的許多酶的合成。②分解代謝物阻遏（cataboliterepression）：當(dāng)微生物在含有兩種能夠分解底物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶的合成的現(xiàn)象。最早發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌生長(zhǎng)在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基時(shí),故又稱(chēng)葡萄糖效應(yīng)。分解代謝物阻遏導(dǎo)致出現(xiàn)“二次生長(zhǎng)（diauxicgrowth）”.直接作用者是優(yōu)先利用的碳源的中間代謝物——實(shí)質(zhì)是：因代謝反應(yīng)鏈中某些中間代謝物或末端代謝物的過(guò)量積累而阻遏代謝中一些酶的合成的現(xiàn)象。2021/6/2711酶合成調(diào)節(jié)的機(jī)制操縱子學(xué)說(shuō)概述：(1)操縱子（operon）：是基因表達(dá)和控制的一個(gè)完整單元，其中包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、操作基因和啟動(dòng)基因。①結(jié)構(gòu)基因(structuralgenes)：是決定某一多肽的DNA模板，可根據(jù)其上的堿基順序轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，然后再可通過(guò)核糖體轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的酶;（編碼蛋白質(zhì)的DNA序列）②啟動(dòng)基因(promoter)：能被依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的堿基順序，是RNA聚合酶的結(jié)合部位和轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)；（在許多情況下還包括促進(jìn)這一過(guò)程的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。）③操縱基因（operator）：位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，是阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，能通過(guò)與阻遏物相結(jié)合來(lái)決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄是否能進(jìn)行；④調(diào)節(jié)基因（regulatorgene）：用于編碼組成型調(diào)節(jié)蛋白的基因，一般遠(yuǎn)離操縱子,但在原核生物中,可以位于操縱子旁邊,編碼調(diào)節(jié)蛋白。2021/6/2712對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌（E.coli）培養(yǎng)基中加入乳糖可誘導(dǎo)

-半乳糖苷酶的合成

酶合成的誘導(dǎo)——E.coli乳糖操縱子學(xué)說(shuō)2021/6/2713Monod和Jacob（1961）提出了操縱子學(xué)說(shuō)用于解釋酶的誘導(dǎo)機(jī)制大腸桿菌乳糖操縱子酶合成的誘導(dǎo)EnzymeInduction：

2021/6/2714酶合成的阻遏EnzymeRepression：(1)終產(chǎn)物的阻遏：(endproductrepression):（反饋?zhàn)瓒?即在合成代謝中，終產(chǎn)物阻遏該途徑所有酶的合成。為基因表達(dá)的控制。如：色氨酸(Try)合成的調(diào)控(正調(diào)節(jié))2021/6/2715

當(dāng)代謝產(chǎn)生末端代謝產(chǎn)物色氨酸后，色氨酸作為效應(yīng)物與原阻遏物結(jié)合，使后者發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)，并能與操縱基因結(jié)合，從而阻止了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。

調(diào)節(jié)基因遠(yuǎn)離操縱子，所表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白不能直接與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)能順利進(jìn)行。

調(diào)節(jié)蛋白稱(chēng)為原阻遏物（prerepressor)。酶阻遏的色氨酸操縱子模型2021/6/2716終產(chǎn)物的阻遏2021/6/2717(2)分解代謝物阻遏（Cataboliterepression）當(dāng)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在兩種可利用底物（碳源或氮源）時(shí)，利用快的底物會(huì)阻遏與利用慢的底物有關(guān)的酶合成?，F(xiàn)象：阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的結(jié)果，而是由這種底物分解過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝物引起的，所以稱(chēng)為分解代謝物阻遏。原因：葡萄糖效應(yīng)二次生長(zhǎng)現(xiàn)象大腸桿菌利用混合碳源生長(zhǎng)時(shí)時(shí)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖會(huì)抑制其它糖的利用大腸桿菌在含乳糖和葡萄糖的培養(yǎng)基中，優(yōu)先利用葡萄糖，并只有當(dāng)葡萄糖耗盡后才開(kāi)始利用乳糖，這就形成了在兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間的第二個(gè)生長(zhǎng)停滯期分解代謝產(chǎn)物阻遏2021/6/27181.單獨(dú)加入葡萄糖時(shí)，菌體生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有延遲期；單獨(dú)加入乳糖時(shí)，菌體生長(zhǎng)有明顯的延遲期；2.同時(shí)加入葡萄糖和乳糖時(shí)，菌體呈二次生長(zhǎng)2021/6/2719乳糖操縱子模型解釋分解代謝物的阻遏機(jī)制

乳糖操縱子的啟動(dòng)基因內(nèi)，除RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外，還有一個(gè)稱(chēng)為CAP-cAMP復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)腺苷酸環(huán)化酶2021/6/2720三.代謝調(diào)控在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用工業(yè)發(fā)酵的目的：大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。代謝的人工控制：人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行。人工控制代謝的手段：改變微生物遺傳特性(遺傳學(xué)方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）；改變細(xì)胞膜透性；2021/6/2721工業(yè)發(fā)酵的目的——大量地積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。

在正常生理?xiàng)l件下

微生物通過(guò)其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，它們通常不浪費(fèi)原料和能量，也不積累中間代謝產(chǎn)物代謝的人工控制

人為地打破微生物的代謝控制體系，就有可能使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行

2021/6/2722（1）對(duì)于直線(xiàn)式代謝途徑：選育營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變株只能積累中間代謝產(chǎn)物

AaBbCcDdE

1.營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用

末端產(chǎn)物E對(duì)生長(zhǎng)乃是必需的，所以，應(yīng)在培養(yǎng)基中限量供給E，使之足以維持菌株生長(zhǎng)，但又不至于造成反饋調(diào)節(jié)（阻遏或抑制），這樣才能有利于菌株積累中間產(chǎn)物C。2021/6/2723(2)分支代謝途徑：情況較復(fù)雜，可利用營(yíng)養(yǎng)缺陷性克服協(xié)同或累加反饋抑制積累末端產(chǎn)物，亦可利用雙重缺陷發(fā)酵生產(chǎn)中間產(chǎn)物ABCDEFG2021/6/2724谷氨酸棒桿菌的代謝調(diào)節(jié)與賴(lài)氨酸生產(chǎn)E：表示反饋抑制；R：表示反饋?zhàn)瓒?/p>

高絲氨酸脫氫酶（HSDH）

天冬氨酸激酶（AK)

賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌:高絲氨酸缺陷型

2021/6/2725分支途徑——①

賴(lài)氨酸發(fā)酵:谷氨酸棒桿菌的Hom–2021/6/2726分支途徑——②肌苷酸發(fā)酵

（IMP合成途徑的代謝調(diào)控）調(diào)控理論的實(shí)踐應(yīng)用2021/6/27272.抗反饋控制突變株的應(yīng)用★抗反饋控制突變株——是指對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐?，或兩者兼有之的菌株?！锟狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株和營(yíng)養(yǎng)缺陷性回復(fù)突變株中獲得。2021/6/2728DABCEF4.生物化學(xué)方法1.添加前體繞過(guò)反饋控制點(diǎn)：亦能使某種代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生(-)(-)(-)2.添加誘導(dǎo)劑：從提高誘導(dǎo)酶合成量來(lái)說(shuō)，最好的誘導(dǎo)劑往往不是該酶的底物，而是底物的衍生物，3.發(fā)酵與分離過(guò)程耦合：4.控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分：2021/6/27295.控制細(xì)胞膜滲透性使胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物迅速滲漏出去,解除末端產(chǎn)物的反饋抑制。(1)用生理學(xué)手段——直接抑制膜的合成或使膜受缺損如:在Glu發(fā)酵中把生物素濃度控制在亞適量可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改變細(xì)胞膜的成分，進(jìn)而改變膜透性；當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量較高時(shí)采用適量添加青霉素的方法；再如：產(chǎn)氨短桿菌的核苷酸發(fā)酵中控制因素是Mn2+；Mn2+的作用與生物素相似。(2)利用膜缺損突變株——油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過(guò)程中，有限制地添加油酸，合成有缺損的膜，使細(xì)胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸產(chǎn)量。甘油缺陷型菌株的細(xì)胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量滲漏。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸過(guò)量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。2021/6/2730第四節(jié)微生物初級(jí)代謝與次級(jí)代謝產(chǎn)物一.初級(jí)代謝與次級(jí)代謝的概念一類(lèi)與生物生存有關(guān)的、涉及到產(chǎn)能代謝和耗能代謝的代謝類(lèi)型，普遍存在于一切生物中。初級(jí)代謝：微生物從外界吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)和能量的過(guò)程，稱(chēng)為初級(jí)代謝。某些生物為了避免在初級(jí)代謝過(guò)程某種中間產(chǎn)物積累所造成的不利作用而產(chǎn)生的一類(lèi)有利于生存的代謝類(lèi)型。可以認(rèn)為是某些生物在一定條件下通過(guò)突變獲得的一種適應(yīng)生存的方式。通過(guò)次級(jí)代謝合成的產(chǎn)物通常稱(chēng)為次級(jí)代謝產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物。根據(jù)其作用，可將其分為抗生素、激素、生物堿、毒素及維生素等類(lèi)型。次級(jí)代謝：2021/6/2731二.初級(jí)代謝與次級(jí)代謝的關(guān)系：初級(jí)代謝系統(tǒng)、代謝途徑和初級(jí)代謝產(chǎn)物在各類(lèi)生物中基本相同。它是一類(lèi)普遍存在于各類(lèi)生物中的一種基本代謝類(lèi)型。(1)存在范圍及產(chǎn)物類(lèi)型不同次級(jí)代謝只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且代謝途徑和代謝產(chǎn)物因生物不同而不同，就是同種生物也會(huì)由于培養(yǎng)條件不同而產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物。2021/6/2732例如某些青霉菌、芽孢桿菌和黑曲霉在一定的條件下可以分別合成青霉素、桿菌肽和檸檬酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物。不同的微生物可產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物相同的微生物在不同條件下產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物灰黃青霉在Czapek——Dox培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)可以合成灰黃霉素，在Raulin培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)則合成褐菌素（fulvicacid）；2021/6/2733次級(jí)代謝產(chǎn)物雖然也是從少數(shù)幾種初級(jí)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間體或代謝產(chǎn)物衍生而來(lái)，但它的骨架碳原子的數(shù)量和排列上的微小變化，如氧、氮、氯、硫等元素的加入，或在產(chǎn)物氧化水平上的微小變化都可以導(dǎo)致產(chǎn)生各種各樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，并且每種類(lèi)型的次級(jí)代謝產(chǎn)物往往是一群化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似的不同成分的混合物。例如，目前已知的新霉素有4種，桿菌肽、多粘菌素分別有有10多種，而放線(xiàn)菌素有20多種等。產(chǎn)黃青霉在在Raulin中培養(yǎng)時(shí)可以合成青霉酸。但在Czapek——Dox中培養(yǎng)則不產(chǎn)青霉酸。2021/6/2734初級(jí)代謝產(chǎn)物，如單糖或單糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等單體以及由它們組成的各種大分子聚合物，蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類(lèi)等通常都是機(jī)體生存必不可少的物質(zhì)，只要在這些物質(zhì)的合成過(guò)程的某個(gè)環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙，輕則引起生長(zhǎng)停止、重則導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生突變或死亡。次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)于產(chǎn)生者本身來(lái)說(shuō)，不是機(jī)體生存所必