DB12T 506-2014 大豆轉(zhuǎn)基因成分篩查方法　

DB12DB12/T506—2014大豆轉(zhuǎn)基因成分篩查方法Screeningmethodforgeneticallymodifiedsoybean2014-04-22發(fā)布2014-07-20實(shí)施天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB12/T506—2014DB12/T506—2014本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大豆中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR篩查的術(shù)語GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)通用要求農(nóng)業(yè)部2031號(hào)公告—19—2013轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)抽樣Lectin基因LectingeneCaMV35S啟動(dòng)子35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus（CaMV）NOS終止子terminatorofnopalinesynthase（NOS）geneCP4-epsps基因5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegenederivedfromAgrobacter來源于土壤農(nóng)桿菌株系（Agrobacteriumsp.）CP4株系一段可編碼5-Bt基因Bt（Bacillusthuringiensis）gene來源與蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthur），見的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/crybar/pat基因bialaphosresistancegene/phosphinothricinacetyltransferasDB12/T506—2014bar基因來源于土壤吸水鏈霉菌（Streptomyceshygroscopicuspat基因來源于綠產(chǎn)色鏈霉菌4檢測(cè)方法4.1.1實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水或符合GB/），注：溴化乙錠有致癌作用，配制和使用時(shí)應(yīng)戴），）：）：），），4.1.13引物：大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆Lectin210bpCaMV35SNOSNOS-F：5′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-NOS-R：5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-DB12/T506—2014mCP4ES-F：5′-ACGGTGAYCGTCTTCCMGTTACmCP4ES-R：5′-GAACAAGCARGGCMGCAACCBtBt-F：5′-GAAGGTTTGAGCAATCBt-R：5′-CGATCAGCCTAGTAAGbarbar-F：5′-GAAGGCACGCAACGCCTACbar-R：5′-CCAGAAACCCACGTCATGCC262bppatpat-F：5′-GAAGGCTAGGAACGCTTACGpat-R：5′-CCAAAAACCAACATCATGCCA262bpDB12/T506—2014水2.5μL25mmol/L氯化鎂溶液1.5μL2.0μL0.1～0.5μmol/L0.25～1.25μL0.1～0.5μmol/L0.25～1.25μL0.025U/μL——2.0μL25.0μL注1：大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PCR檢測(cè)反應(yīng)體系中，上下游引物分別為lec-1672F和lec-為0.2μmol/L；CaMV35S啟動(dòng)子PCR檢測(cè)反應(yīng)體系中，上下游引物分別是35S-F和35S-Bt基因PCR檢測(cè)反應(yīng)體系中，上下游引物分別是Bt-F和Bt-R，引物終濃度分別為0.5μmol/L；bar基因和pat別為0.1μmol/L。LectinNOS5DB12/T506—2014Btbar/pat4.3.5.1.5反應(yīng)結(jié)束后取出PCR管，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。mL瓊脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插條件下電泳檢測(cè)。DB12/T506—20145.2.1在試樣的PCR反應(yīng)中，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致；而CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Bt基因、bar/pat基因和CP4-epsps基因均未得到DB12/T506—2014A.2CaMV35S啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列A.4CP4-epsps基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列一