《生物化學(xué)實驗》課件021919

生物化學(xué)實驗

Biochemical

Experiment1完整版課件ppt

生物化學(xué)實驗技術(shù)理論2完整版課件ppt一、層析技術(shù)1903年，俄國科學(xué)家M.C.Jber首創(chuàng)了一種從綠葉中分離多種不同顏色色素成分的方法，命名為色譜法(Chromatography)，由于翻譯和習(xí)慣的原因．又常稱為層析法。80多年來，層析法不斷發(fā)展，形式多種多樣。50年代開始，相繼出現(xiàn)了分配層析、離于交換層析、凝膠層析、親和層析、吸附層析等。幾乎每一種層析法都已發(fā)展成為一門獨立的生化高技術(shù)，在生化領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。3完整版課件ppt一、層析技術(shù)1、層析技術(shù)原理2、層析技術(shù)分類3、常用層析技術(shù)原理4完整版課件ppt1、層析技術(shù)原理層析原理：是一種物理的分離方法，利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一相為固定相，另一相流過此相稱作流動相，并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離的目的。可分離物質(zhì)：糖類、有機酸、氨基酸、核苷酸。5完整版課件ppt2、層析技術(shù)分類名稱操作方式固定相流動相分離依據(jù)分配層析紙層析薄層層析液體液體溶解度離子交換層析離子交換柱層析固體液體帶電性靜電引力吸附層析吸附薄層層析氣體吸附層析固體固體液體氣體吸附力親合層析酶與底物抗原與抗體固體液體配體專一性凝膠層析凝膠過濾固體液體分子大小6完整版課件ppt3、常用的層析原理（1）分配層析——紙層析原理：溶質(zhì)在互不相溶的兩相中溶解度不同，在終點時達(dá)到一種平衡，其比值為一個常數(shù)，即分配系數(shù)（α）。

固定相內(nèi)溶質(zhì)的濃度

α=

流動相內(nèi)溶質(zhì)的濃度固定相：濾紙上吸附的水流動相：有機溶劑（正丁醇）7完整版課件ppt1286464326432164848168324832842040402042123040301228完整版課件ppt紙層析紙層析是最簡單的液一液相分配層析。濾紙是紙層析的支持物。當(dāng)支持物被水飽和時，大部分水分子被濾紙的纖維素牢牢吸附，因此，紙及其飽和水為層析的固定相，與固定相不相混溶的有機溶劑為層析的流動相。對某些特定化合物，在特定的展層系統(tǒng)，一定的溫度條件下，Rf是個常數(shù)。9完整版課件ppt（2）離子交換層析原理：將能與周圍介質(zhì)進(jìn)行離子交換的不穩(wěn)定離子固定于惰性基質(zhì)上，從而分離介質(zhì)中的組分。常用的惰性基質(zhì)：人工合成樹脂（單體：苯乙烯、交聯(lián)劑：二乙烯苯）陽離子交換劑：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基陰離子交換劑：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基可交換離子：陽離子：Na+、H+

陰離子：Cl-、OH-10完整版課件ppt示意圖（交換樹脂表面）11完整版課件ppt示意圖（離子交換過程）電離基團(tuán)（磺酸根）可交換離子（鈉離子）交換離子不交換離子12完整版課件ppt示意圖水分子B物質(zhì)A物質(zhì)13完整版課件ppt（3）吸附層析原理：當(dāng)氣體或液體中某組分的分子在運動中碰到一個固體表面時，分子會貼在固體表面上并停留一定時間然后才離開，此為吸附現(xiàn)象。吸附現(xiàn)象形成的原因：吸附作用可能由幾種作用力形成，包括被吸附物與吸附劑之間相反電荷基團(tuán)與基團(tuán)之間的靜電引力(形成離子鍵)、氫鍵及范德華引力等。在不同條件下，占主要地位的作用力可能不同，也可能幾種力同時起作用吸附劑：氧化鋁、活性炭、硅膠；纖維素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。14完整版課件ppt吸附層析示意圖

吸附劑易吸附分子不易吸附分子15完整版課件ppt（4）親和層析原理：利用分子間具有專一親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。專一親和力分子對：酶與底物、特異性抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體載體：使親和物固相化的水不溶性化合物。如：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。16完整版課件ppt17完整版課件ppt（5）凝膠過濾原理：被分離物質(zhì)因分子大小不同，在凝膠中向下移動的速度不同。物質(zhì)進(jìn)入凝膠柱之后有兩種運動方式：垂直向下移動和無定向的擴(kuò)散運動。大分子物質(zhì)直徑大無法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，只能分布于顆粒間隙中向下移動快，而小分子物質(zhì)可擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)，因此向下移動慢。凝膠物質(zhì)：馬鈴薯淀粉凝膠、瓊脂、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠。18完整版課件ppt19完整版課件ppt電泳技術(shù)一.電泳的概念二.電泳技術(shù)分類三.電泳技術(shù)基本原理四.幾種常見電泳方法的比較五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理20完整版課件ppt一.電泳的概念帶電質(zhì)點在電場中移動的現(xiàn)象。21完整版課件ppt二.電泳技術(shù)分類22完整版課件ppt三.電泳技術(shù)基本原理1.基本原理

不同的帶電顆粒在同一電場中泳動速度，主要與其所帶凈電荷量，分子量及分子形狀有關(guān)。pH>pI分子帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動;

pH<pI分子帶正電荷,在電場中向負(fù)極移動;

泳動度u=v=d/t=dleV/lVt23完整版課件ppt2.影響電泳速度的因素(1)電場強度泳動速度與電場強度成正比常壓電泳(100—500V).2—10V/cm，幾小時或幾天；蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì);高壓電泳(500—1000V).20—200V/cm，幾分鐘；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物質(zhì);（2）溶液的pH值pH距待分離物質(zhì)的pI越遠(yuǎn)，泳動速度越大；（3）溶液離子強度離子強度越小,電動勢越大,泳動速度越快。（4）電滲現(xiàn)象：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。24完整版課件ppt四.幾種常見電泳的比較類型優(yōu)點缺點紙電泳設(shè)備操作簡單分辨率差，電滲現(xiàn)象醋酸纖維薄膜電泳設(shè)備操作簡單，樣品用量少分辨率差瓊脂糖凝膠電泳快速，分辨率高電滲現(xiàn)象嚴(yán)重聚丙烯酰胺凝膠電泳可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，樣品用量少分辨率高，無電滲現(xiàn)象高濃度凝膠難剝離25完整版課件ppt五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理1.原理具有電泳和分子篩的雙重作用2.聚丙烯酰胺凝膠的聚合單體：丙稀酰胺（Acr）交聯(lián)劑：甲叉雙丙稀酰胺交聯(lián)劑(Bis)

催化劑聚合形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OCH2=CH-C-NH2OOCH2=CH-C-NH

-CH2-NH-C-CH=CH226完整版課件ppt五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理2.聚丙烯酰胺凝膠的聚合催化劑（1）過硫酸銨-TEMED系統(tǒng)堿性條件下催化作用溫度與聚合快慢成正比（2）核黃素-TEMED系統(tǒng)光激發(fā)的催化反應(yīng)用量少，對分析樣品無影響聚合時間可自由控制27完整版課件ppt五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理3.聚丙烯酰胺凝膠的孔徑凝膠越濃T，凝膠孔徑↓，所受阻力，機械強度

丙稀酰胺濃度分離物質(zhì)分子量4％大于100萬7－7.5％1－100萬15－30％小于1萬膠的孔徑為蛋白質(zhì)分子平均大小一半時效果好凝膠強度的選擇先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或4%--10%的凝膠梯度測試28完整版課件ppt

五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理

4.緩沖系統(tǒng)的選擇

pH、離子種類和離子強度酸性蛋白質(zhì)高pH堿性蛋白質(zhì)低pH連續(xù)和不連續(xù)系統(tǒng)電泳槽中的緩沖系統(tǒng)和pH與凝膠相同電泳槽中的緩沖系統(tǒng)和pH與凝膠相同，分辨率高29完整版課件ppt

五.盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（1）盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的四個不連續(xù)性

A.凝膠層的不連續(xù)性濃縮膠T=2.8％C=20%；分離膠T=7％C=2.5%

B.緩沖液成分的不連續(xù)性：凝膠緩沖液Tris-HCl,含Cl－，電極緩沖液Tris-Gly,Gly－

C.pH的不連續(xù)性：濃縮膠pH6.7,分離膠pH8.9，電極緩沖液pH8.3

D.電位梯度的不連續(xù)性30完整版課件ppt五.盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（2）盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種效應(yīng)

樣品的濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)31完整版課件pptA.樣品的濃縮效應(yīng)緩沖液成分及pH的不連續(xù)性濃縮膠pH6.7緩沖液濃縮膠Tris-HCl,電極緩沖液Tris-Gly解離度：

Cl>

蛋>

Glymcl

cl>m蛋

蛋>mGly

Gly凝膠中Cl－為快離子，Gly－為慢離子，蛋白質(zhì)樣品被夾在中間。緩沖液樣品濃縮膠分離膠32完整版課件ppt緩沖液成分及pH的不連續(xù)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品

濃縮效應(yīng)示意圖

快離子慢離子蛋白質(zhì)樣品

33完整版課件ppt

E：每厘米的電壓降E＝I(電流強度)/(電導(dǎo)率)E與電泳速度成正比電泳開始后，由于快離子泳動率最大，在快離子后面形成一個離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。電位梯度的不連續(xù)性34完整版課件pptE：每厘米的電壓降E＝I(電流強度)/(電導(dǎo)率)E與電泳速度成正比電泳開始后，由于快離子泳動率最大，在快離子后面形成一個離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。

電位梯度的不連續(xù)性35完整版課件pptA.

樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：緩沖液成分及pH的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性緩沖液濃縮膠樣品分離膠36完整版課件pptA.樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液樣品濃縮膠分離膠37完整版課件pptA.樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液樣品濃縮膠分離膠38完整版課件pptA.樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液濃縮膠分離膠39完整版課件pptA.樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液濃縮膠分離膠