臨床常見微生物的鑒定-分枝桿菌屬、諾卡菌屬、放線菌屬鑒定

放線菌屬分類含分枝菌酸：諾卡菌屬、分枝桿菌屬、棒狀桿菌屬不含分枝菌酸：放線菌屬放線菌屬(Actinomyces)主要致病菌——衣氏放線菌（A.israelii)生物學(xué)性狀G+、非抗酸性絲狀菌培養(yǎng)困難，厭氧或微需氧硫磺樣顆粒（菌落）

壓片或組織切片，顯微鏡下可見顆粒呈菊花狀硫磺樣顆粒(sulfurgranule)致病性與免疫性

屬正常菌群主要引起內(nèi)源性感染導(dǎo)致軟組織的化膿性炎癥，若無繼發(fā)感染大多呈慢性無痛性過程，并常伴有多發(fā)性瘺管形成與齲齒和牙周炎有關(guān)診斷硫磺樣顆粒分枝桿菌屬一類細(xì)長彎曲的桿菌，因有分枝生長的趨勢而命名主要特點(diǎn)細(xì)長彎曲，分枝狀生長細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)（分枝菌酸）常用抗酸染色鑒定，呈抗酸染色陽性引起疾病都呈慢性，并伴肉芽腫分類結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群非結(jié)核分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌分枝桿菌的分類

分類生長特性主要對人致病的分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生長緩慢結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌Ⅰ組生長緩慢、光產(chǎn)色堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌Ⅱ組生長緩慢、暗產(chǎn)色瘰癘分枝桿菌Ⅲ組生長緩慢、不產(chǎn)色鳥-胞內(nèi)分枝桿菌Ⅳ組生長快速、偶發(fā)分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌人工培養(yǎng)基上不生長抗酸染色由于細(xì)菌細(xì)胞壁中含大量脂質(zhì)，一般不易著色，若經(jīng)加溫或延長染色時間而著色后又能抵抗強(qiáng)脫色劑鹽酸酒精的脫色，故又稱抗酸桿菌(acid-fastbacilli)抗酸染色法(acid-faststain)：以5％石炭酸復(fù)紅加溫染色，再用3％鹽酸酒精脫色，然后用美藍(lán)復(fù)染，則分枝桿菌呈紅色(+)，其他細(xì)菌和背景物質(zhì)為藍(lán)色(-)。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)

俗稱結(jié)核桿菌，引起人類結(jié)核病致病菌主要為結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)世界上1/3人感染，70%在亞洲世界防治結(jié)核病日：3月24日2000年我國衛(wèi)生部宣布：中國處于結(jié)核病的緊急狀態(tài)：（五多一緩慢）

*感染人數(shù)多44.5%的人口感染，約為5.5億*患病人數(shù)多450萬*傳染源多150萬*耐藥病人多耐藥率19%-47%，多耐藥(MDRTB)*死亡人數(shù)多13萬/年*疫情下降緩慢患病率年遞降率為3.8%一、生物學(xué)特性形態(tài)與染色細(xì)長略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性培養(yǎng)特點(diǎn)專性需氧生長緩慢營養(yǎng)要求高，常用羅氏培養(yǎng)基生長現(xiàn)象液體：表面生長（菌膜）固體：顆粒、結(jié)節(jié)、花菜狀菌落，乳白或米黃，不透明生化反應(yīng)不發(fā)酵糖類觸酶試驗(yàn)陽性，耐熱觸酶試驗(yàn)陰性抵抗力四不怕干燥酸（3%HCl或6%H2SO4)或堿（4%NaOH)有抵抗力堿性染料青霉素等抗生素四怕乙醇濕熱紫外線抗癆藥物（鏈霉素、異煙肼、利福平等）結(jié)核桿菌在干痰中存活6～8個月，若粘附于塵埃上，保持傳染性8～10天。在3%HCl或4%NaOH溶液中能耐受30分鐘，因而常以酸堿中和處理嚴(yán)重污染的檢材，殺死雜菌和消化粘稠物質(zhì)，提高檢出率。。但對濕熱、紫外線、酒精的抵抗力弱。在液體中加熱62～63℃15分鐘，直射日光下2～3小時，75%酒精內(nèi)數(shù)分鐘即死亡。變異性形態(tài)結(jié)構(gòu)變異：結(jié)核桿菌的L型：顆粒狀、絲狀、Much顆粒毒力變異：卡介苗BCG：Calmette和Guérin將牛分枝桿菌經(jīng)13年230次傳代而獲得的減毒活疫苗株耐藥性變異：耐異煙肼及其他抗結(jié)核藥物的結(jié)核菌株日益增多致病物質(zhì)二、致病性莢膜與細(xì)胞表面受體結(jié)合（粘附與入侵作用）保護(hù)（阻止有害物質(zhì)的進(jìn)入菌體）脂質(zhì)索狀因子（破壞細(xì)胞，引起肉芽腫）磷脂（形成結(jié)核結(jié)節(jié)）硫酸腦苷脂（抑制吞噬體與溶酶體結(jié)合）蠟質(zhì)D（引起遲發(fā)性過敏反應(yīng)）蛋白質(zhì)引起遲發(fā)性過敏反應(yīng)所致疾病感染方式呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入機(jī)體所致疾病結(jié)核病，以肺結(jié)核常見肺部感染原發(fā)感染：外源性感染多發(fā)生于兒童（無免疫力）原發(fā)綜合征(肺門淋巴腫大等)形成結(jié)核結(jié)節(jié)（即結(jié)核肉芽腫），少數(shù)病灶擴(kuò)散，引起全身TB轉(zhuǎn)歸原發(fā)后感染：外或內(nèi)源性感染多見成人病灶局限引起局部TB、開放性TB（反應(yīng)劇烈，干酪性壞死、空洞）肺外感染進(jìn)入血液循環(huán)引起肺內(nèi)、外播散，如腦、腎、腸、腹腔大多與結(jié)核分枝桿菌L型有關(guān)三、免疫性傳染、免疫、超敏反應(yīng)共存免疫機(jī)制主要是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫屬于感染免疫(infectionimmunity)，又稱有菌免疫免疫與超敏反應(yīng)細(xì)胞免疫為主,遲發(fā)型超敏反應(yīng)同時存在郭霍現(xiàn)象注射結(jié)核桿菌于豚鼠皮下初次注射局部反應(yīng)小全身擴(kuò)散無免疫無超敏反應(yīng)再次注射局部反應(yīng)大不擴(kuò)散有免疫有超敏反應(yīng)以前感染過或免疫豚鼠正常豚鼠24-48小時10-14天局部紅腫、淺潰瘍局部紅腫、潰瘍不擴(kuò)散，脫落后自行愈合壞死，經(jīng)久不愈有毒TB菌全身擴(kuò)散皮下郭霍現(xiàn)象結(jié)核菌素試驗(yàn)OT(oldtuberculin),PPD(purifiedproteinderivative)是應(yīng)用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚試驗(yàn)來測定機(jī)體對結(jié)核分枝桿菌是否能引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)（Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)）的一種試驗(yàn)方法前臂皮內(nèi)注射PPD5單位意義48～72h紅腫硬結(jié)超過5mm,陽性，有免疫力,大于15mm,為強(qiáng)陽性陰性，無免疫力（四種情況除外：初染，嚴(yán)重結(jié)核，免疫力低下，老人）應(yīng)用選擇卡介苗接種對象和測定卡介苗接種后的免疫效果。結(jié)核菌素試驗(yàn)陰性者應(yīng)接種或補(bǔ)種卡介苗在未接種卡介苗的人群中作結(jié)核桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查,了解人群自然感染率作為嬰幼兒(尚未接種過卡介苗者)結(jié)核病的輔助診斷測定腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能四、微生物學(xué)檢查法標(biāo)本處理：濃縮集菌(氫氧化鈉處理）直接鏡檢：抗酸染色分離培養(yǎng)：培養(yǎng)基、時間（2~4周后見結(jié)果）動物試驗(yàn)：豚鼠等快速診斷：PCR等痰液等1、標(biāo)本采集：根據(jù)結(jié)核菌感染的類型，應(yīng)采取病灶部位的適當(dāng)標(biāo)本。

☆如肺炎結(jié)核有采取咯痰（最好取早晨第一次咯痰，挑取帶血或膿痰）；

☆腎或膀胱結(jié)核以無菌導(dǎo)尿或取中段尿液；

☆腸結(jié)核采取糞便標(biāo)本，結(jié)核性腦膜炎進(jìn)行腰脊穿刺采取腦脊液；

☆膿胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓結(jié)核等則穿刺取膿液。2.1直接涂片染色:

抗酸染色，若鏡檢找到抗酸性桿菌，可能是結(jié)核桿菌，但通常應(yīng)報(bào)告：“查到抗酸性桿菌”。如標(biāo)本中結(jié)核桿菌量少時，直接涂片不易檢出，應(yīng)濃縮集菌后，再涂片染色鏡檢，以提高檢出陽性率。

2、涂片染色報(bào)告方法報(bào)告方法鏡檢結(jié)果報(bào)告方法鏡檢結(jié)果(－)末發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌/300個油鏡視野2＋1-9個抗酸桿菌/10個油鏡視野(±)1-8個抗酸桿菌/300個油鏡視野3＋1-9個抗酸桿菌/每個油鏡視野*1＋3-9個酸桿菌/100個油鏡視野4＋>10個抗酸桿菌/每個油鏡視野**:必須看100個油鏡視野沉淀集菌法：將標(biāo)本用2%NaOH消化，37℃30min；或高壓滅菌液化后，3000r/min×30min，取沉渣涂片。漂浮集菌法：將標(biāo)本用生理鹽水充分稀釋，再加放汽油或二甲苯0.5-1ml，振蕩15-30min后，吸取泡沫和油層接界部分涂片，兩者均用抗酸染色，報(bào)告方法同前述。2.2集菌涂片：2.3熒光顯微鏡檢查法:制片方法同前，用金胺O染色，鏡檢方法同前。3、分離培養(yǎng)：

標(biāo)本預(yù)處理：咯痰和糞便標(biāo)本濃縮集菌因含雜菌多，需用4%NaOH或3%HCl或6%H2SO4處理30min，然后，用離心沉淀法將結(jié)核桿菌濃縮聚集于管底，再取沉淀物0.1ml接種于固體培養(yǎng)基上，以蠟封口防止干燥。37℃培養(yǎng)4～6周后檢查結(jié)果。

4、動物試驗(yàn):取經(jīng)濃縮集菌處理的標(biāo)本1.0毫升注射于豚鼠腹股溝皮下，經(jīng)3～4周飼養(yǎng)觀察，如出現(xiàn)局部淋巴結(jié)腫大，消瘦或結(jié)核菌素試驗(yàn)陽性，可及時剖檢；若觀察6～8周后，仍未見發(fā)病者，也要剖檢。剖檢時應(yīng)注意觀察淋巴結(jié)、肝、脾、肺等臟器有無結(jié)核病變。

5、基因診斷：涂片檢查需5×103-4/ml，培養(yǎng)需1×102/ml，標(biāo)本中菌數(shù)少于此值不易被檢出，PCR技術(shù)用于快速檢測，少至每ml幾個細(xì)菌均能檢出，且速度很快，因此應(yīng)用前景比較廣泛。但由于實(shí)驗(yàn)器材的污染易出現(xiàn)假陽性。6、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)：國內(nèi)外采用方法有絕對濃度法、比例法和擴(kuò)散法，現(xiàn)在已有快速藥敏試驗(yàn)商品化試劑銷售?？梢姴豢捎翰糠謽?biāo)本出現(xiàn)涂片陽性而培養(yǎng)卻陰性，有稱此種菌為可見不可育菌；多由于高效化療藥物的應(yīng)用及機(jī)體免疫力的作用等原因形成的低活性菌或死菌。因此對每個標(biāo)本都應(yīng)同時進(jìn)行涂片和培養(yǎng)檢查。五、防治原則預(yù)防一般性預(yù)防：衛(wèi)生宣傳、提高機(jī)體抵抗力特異性預(yù)防：發(fā)現(xiàn)和治療痰菌陽性者新生兒接種卡介苗治療一般治療：合理營養(yǎng)，注意休息抗結(jié)核藥物鏈霉素、異煙肼、利福平等治療原則：早期、聯(lián)合、適量、規(guī)律、分階段治療和堅(jiān)持全程第二節(jié)

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosismycobacteria)概念結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌與麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌對酸、堿比較敏感對常用的抗結(jié)核菌藥物較耐受生長溫度不如結(jié)核分枝桿菌嚴(yán)格多存在于環(huán)境中、為條件致病菌可引起結(jié)核樣病變而受到關(guān)注抗原與結(jié)核分枝桿菌有交叉特性分類第Ⅰ組：光產(chǎn)色菌堪薩斯分枝桿菌，引起人類肺結(jié)核樣病變第Ⅱ組：暗產(chǎn)色菌瘰癘分枝桿菌，引起兒童淋巴結(jié)炎第Ⅲ組：不產(chǎn)色菌鳥-胞內(nèi)分枝桿菌，可引起結(jié)核樣病變第Ⅳ組：迅速生長菌恥垢分枝桿菌鑒別有否致病性可用抗煮沸試驗(yàn)加以區(qū)別L型麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium.leprae)

俗稱麻風(fēng)桿菌，引起麻風(fēng)，是一種慢性傳染病流行廣泛，主要分布在亞、非和拉丁美洲生物學(xué)性狀形態(tài)、染色與結(jié)核分枝桿菌相似麻風(fēng)分枝桿菌是一種典型胞內(nèi)菌麻風(fēng)細(xì)胞體外人工培養(yǎng)至今仍未成功犰狳致病性與免疫性傳播方式破損的皮膚黏膜、呼吸道也可通過接觸傳染發(fā)病慢,病程長麻