4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品課件

4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品一·參考標(biāo)準(zhǔn)樣品在FCM使用的意義參考標(biāo)準(zhǔn)樣品在FCM中使用，為了監(jiān)測(cè)儀器的液流·電子和各個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，校正和調(diào)試儀器的CV值，最大限度的提高儀器的分辨能力．4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品

1.調(diào)整儀器在高性能的狀態(tài)下工作。

2.由于FCM的測(cè)量是相對(duì)的，而不是絕對(duì)的，所以參考細(xì)胞有助于單個(gè)樣品或一組樣品的測(cè)量參數(shù)的解釋。

3.參考標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞可供監(jiān)測(cè)工作狀態(tài)下儀器的穩(wěn)定性，以使所測(cè)參數(shù)具有可靠性和可比性。

4·參考細(xì)胞可被用于監(jiān)測(cè)染色過程。

5·能夠用于校驗(yàn)FCM分選術(shù)的回收和純度。參考細(xì)胞的主要作用如下:4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品二、標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞樣品具備的特性一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，應(yīng)具有較恒定的體積大小具有較恒定熒光發(fā)射量子細(xì)胞的形狀較一致在液流中的流動(dòng)取向較一致在懸液中可保持高度的單分散狀態(tài)，放置較長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)聚集、不改變其形狀、體積大小及其光學(xué)特性4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品1.外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)樣品在流式分析實(shí)驗(yàn)樣品前或后，上儀器測(cè)量，以校正儀器在工作條件下穩(wěn)定性。缺點(diǎn)由于參考樣品與實(shí)驗(yàn)樣品不同步染色，以及在實(shí)驗(yàn)過程中儀器條件的漂移，可能引起定量檢測(cè)的誤差，因此，近年在流式細(xì)胞定量檢測(cè)中已被摒棄。參考標(biāo)準(zhǔn)的使用方法4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品2.內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法是將標(biāo)準(zhǔn)樣品與實(shí)驗(yàn)樣品按一定的細(xì)胞數(shù)混懸在一起進(jìn)行同步染色,這種方法可以避免外標(biāo)法引入的誤差,可以避免因染色、光源強(qiáng)度的瞬時(shí)波動(dòng)，以及細(xì)胞流速的變化和流束與激光束焦點(diǎn)的漂移造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。內(nèi)標(biāo)法可保證標(biāo)準(zhǔn)樣品與實(shí)驗(yàn)樣品在同樣條件下制備和測(cè)量，可使測(cè)量誤差降到最小限度。內(nèi)標(biāo)法在流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)中已廣泛應(yīng)用。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品三、參考樣本的制備方法㈠非生物標(biāo)準(zhǔn)樣本

塑料微球已廣泛應(yīng)用于參考標(biāo)準(zhǔn)樣品，這些塑料小球可分為兩種：1.無熒光塑料小球可用于散射光的校正，此種統(tǒng)一大小無熒光微球，對(duì)于校正儀器光散射是非常有用的。最好采用10μm大?。ㄅc正常人淋巴細(xì)胞大小相似），通過微球大小的測(cè)量，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品細(xì)胞的面積，直徑，橫截面積和體積作出相對(duì)大小的判斷。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品2.標(biāo)記有熒光染料的塑料微球標(biāo)記熒光染料多選用PI、EB、FITC、AO等，熒光染色的塑料微球可用于調(diào)整和監(jiān)測(cè)光散射和熒光信號(hào)的檢測(cè)。對(duì)不同熒光染色細(xì)胞所結(jié)合的熒光的數(shù)目和細(xì)胞體積的大小進(jìn)行較準(zhǔn)確的計(jì)算。流式細(xì)胞儀對(duì)于微球分辨率的大小，取決于微球大小是否一致，分辨率的大小一般用變異系數(shù)(CoeffienceofVariationCV)來表示，目前有的生產(chǎn)廠家出售的商品微球已標(biāo)明cv值。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品美國(guó)生產(chǎn)微球有如下公司的產(chǎn)品：1.DOWDiagnostics2.02μm2.PolyscienCesInc400

ValleyRoadWarrmgtonPA189791.75μm3.BectonDickinsonConpanyProduction1.75μm,2.02μm以上幾種微球在FACS儀器上，光散射CV值為1.2%，熒光CV值為2.2%(為淺黃色熒光)。4.DukeStandardSamPLe5.1μm5.CounterElectronicsInc10μm這兩種微球的CV值為光散射2%，熒光2.8%。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品非生物性塑料小球可作為長(zhǎng)期使用于流式的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其配制方法和保存方法根據(jù)出售廠家的產(chǎn)品說明。但各種微球多要避光保存，因白炙光可使熒光微球的熒光淬滅。在冰箱內(nèi)保存要防止冷凍結(jié)冰和懸液干燥破壞微球，在長(zhǎng)期使用過程中或換批號(hào)使要做對(duì)比鑒定。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品

㈡生物性標(biāo)準(zhǔn)樣品1.某些生物性顆粒

可作為短期標(biāo)準(zhǔn)，例如植物花粉、一些真菌等，可作為體積大小的光散射標(biāo)準(zhǔn)，但是由于其準(zhǔn)確性較差，產(chǎn)生誤差較大，且在水中不易保存和易發(fā)生體積大小、光學(xué)型號(hào)特征等方面的變化，因此很少在流式細(xì)胞術(shù)中使用。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品⑴雞紅細(xì)胞的制備：雞紅細(xì)胞在體內(nèi)為一終末細(xì)胞，其DNA含量是均一致的，相當(dāng)于正常人淋巴細(xì)胞(二倍體細(xì)胞)DNA含量的35%，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其DNA含量分布組方圖。所得結(jié)果為單一狹窄、對(duì)稱的正態(tài)峰，在前向光散射組方圖上表現(xiàn)為兩個(gè)正態(tài)峰。出現(xiàn)兩個(gè)光散射正態(tài)峰的原因是雞血紅細(xì)胞呈盤狀，在流過光探測(cè)敏感區(qū)時(shí)，由于細(xì)胞所處的取向不同，造成前向光散射強(qiáng)度不同，因此在光散射組方圖上出現(xiàn)不同大小的光散射信號(hào)，即呈兩個(gè)正態(tài)分布的組方圖。２．生物細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品雞血紅細(xì)胞即可作為DNA內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，也可以作為調(diào)整儀器的標(biāo)準(zhǔn)樣品，美國(guó)Stanford大學(xué)醫(yī)學(xué)部成功的使用雞血紅細(xì)胞調(diào)試儀器，其CV值最好可達(dá)2%，用戊二醛固定的雞紅細(xì)胞可發(fā)出自發(fā)熒光，在不染色的條件下，其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜與熒光素和羅丹明極接近，美國(guó)BecktonDickison生產(chǎn)的FACS儀器上，其熒光分布的單峰CV值在10%左右。雞血紅細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)樣品，放入實(shí)驗(yàn)樣品的比例為5～10:100。雞血紅細(xì)胞制備簡(jiǎn)單，來源豐富，價(jià)格低廉，是一種值得提倡的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。

4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品⑵虹鱒魚紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：鱒魚血細(xì)胞的DNA含量相當(dāng)于人二倍體細(xì)胞(人淋巴細(xì)胞)80%左右，由于其DNA含量接近于人的二倍體細(xì)胞，其計(jì)算比值產(chǎn)生的誤差較小，鱒魚紅細(xì)胞DNA含量均一.近年來，已有大量報(bào)道使用該細(xì)胞作為DNA定量檢測(cè)的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)或儀器校正的標(biāo)準(zhǔn)樣品，Vindelov等使用鱒魚和雞血細(xì)胞作為雙內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，比較了鱒魚細(xì)胞和雞血細(xì)胞與二倍體細(xì)胞DNA含量的計(jì)算比值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鱒魚細(xì)胞與二倍體細(xì)胞DNA比值誤差較小。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品

雞血紅細(xì)胞和鱒魚紅細(xì)胞DNA含量，隨著其性別差異有所不同.表1雞、鱒魚不同性別紅細(xì)胞DNA含量細(xì)胞類別雄雌P值雞紅細(xì)胞100.096.30.001

鱒魚細(xì)胞100.0100.60.0234.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品⑶人淋巴細(xì)胞懸液的制備：正常人外周血中淋巴細(xì)胞是一終末細(xì)胞，具有細(xì)胞核DNA含量均一，細(xì)胞體積大小一致，形態(tài)相似的特點(diǎn)，已作為適用的調(diào)整流式細(xì)胞儀的生物性參考樣品，并已被確認(rèn)為一種可靠的二倍體細(xì)胞DNA含量的參考標(biāo)準(zhǔn)，在腫瘤細(xì)胞DNA倍體的研究中，已廣泛用于DNA倍體的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品⑷元魚血細(xì)胞的制備：元魚血細(xì)胞的核DNA含量相當(dāng)于人二倍體細(xì)胞的70%左右，其核DNA含量均一，形態(tài)大小一致，國(guó)內(nèi)已有作者采用元魚細(xì)胞作為流式細(xì)胞儀的參考指標(biāo)，其變異系數(shù)可達(dá)1.8%左右，遠(yuǎn)低于雞血紅細(xì)胞。其來源豐富，制備簡(jiǎn)單，一只元魚可取10ml血液，在－80oC冰箱中保存兩年以上無任何變化，是實(shí)驗(yàn)中理想的生物性內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品四、DNA定量分析參考標(biāo)準(zhǔn)

Tiersch等選擇了39種脊椎動(dòng)物細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)定量分析這些動(dòng)物二倍體細(xì)胞的DNA含量(見表2)用于DNA含量分析的參考標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品

標(biāo)本采集:使用人末梢血淋巴細(xì)胞，牛、狗、豬、鼠、馬采用末梢血白細(xì)胞，其他動(dòng)物均采用全血細(xì)胞，(這些動(dòng)物的全血細(xì)胞均為有核紅細(xì)胞)他們還提出DNA含量的計(jì)算公式，DNA含量的單位以微微克或沙克Picogram.Pg10-9/克來表示。

PG＝7.0(X/S)(S/H)7.0：二倍體淋巴細(xì)胞DNA含量值

X：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組方圖中G0/1期細(xì)胞峰的均道值

H：人淋巴細(xì)胞G0/1峰細(xì)胞均道值

S：內(nèi)參考標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞G0/1峰的均道值4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)樣品細(xì)胞DNA含量的計(jì)算，不能使用染色體條數(shù)計(jì)算DNA含量。人類的二倍體細(xì)胞有46條染色體(DNA含量為7.0)，在東南亞有一種小鹿僅有6條染色體，但其二倍體細(xì)胞DNA含量與人二倍體細(xì)胞DNA含量相似，家馬的二倍體細(xì)胞染色體為64條，但其二倍體DNA含量比人的二倍體細(xì)胞還少約10%。在使用標(biāo)準(zhǔn)樣品的過程中，不同的染色和不同的固定劑都會(huì)出現(xiàn)不同的定量分析結(jié)果，作者總結(jié)了一些文獻(xiàn)報(bào)道和我們所測(cè)結(jié)果，人的淋巴細(xì)胞與雞血紅細(xì)胞，鱒魚和元魚紅細(xì)胞DNA含量的所測(cè)比值(見表3)，還有作者報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)樣品的保存溫度和保持時(shí)間也會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，因此在使用標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵照同樣染色方法和固定方法。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品五、腫瘤DNA倍體標(biāo)準(zhǔn)㈠新鮮組織細(xì)胞DNA倍體定量標(biāo)準(zhǔn)1984年，在洛杉磯召開國(guó)際細(xì)胞分析學(xué)會(huì),就DNA含量分析的二倍體細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)作出了規(guī)定：在DNA定量分析時(shí)，一般應(yīng)用同種同一個(gè)體的正常細(xì)胞DNA含量作為二倍體細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，禽、魚類紅細(xì)胞或熒光微球只能作為儀器準(zhǔn)直的標(biāo)準(zhǔn)樣品。因此，人的末梢血淋巴細(xì)胞被廣泛用于DNA二倍體標(biāo)準(zhǔn)樣品細(xì)胞，在很多腫瘤細(xì)胞DNA倍體FCM研究中，也使用了人的淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和單核細(xì)胞等。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品1992年，由美國(guó)國(guó)立癌癥研究中心,在亞特蘭大組織召開了FCMDNA定量分析的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)際會(huì)議，制定了FCMDNA倍體的標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格使用DNA二倍體標(biāo)準(zhǔn)樣品，DNA倍體的標(biāo)準(zhǔn)必須：①同種屬，同個(gè)體，同樣的正常細(xì)胞②同樣的樣品處理方法，同樣的固定方法，同樣的染色方法，和樣品細(xì)胞與DNA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞同步染色，即采用內(nèi)參考標(biāo)準(zhǔn)。③采用雙內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)即儀器準(zhǔn)直標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞和DNA二倍體細(xì)胞同時(shí)按一定細(xì)胞比例加入實(shí)驗(yàn)細(xì)胞樣品中去。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品㈡石蠟包埋腫瘤組織DNA倍體分析的標(biāo)準(zhǔn)大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，石蠟包埋腫瘤組織的DNA定量分析中，其DNA二倍體標(biāo)準(zhǔn)使用存在的差異比新鮮組織更大。Schutte等研究發(fā)現(xiàn)，用新鮮組織二倍體細(xì)胞或用末梢血淋巴細(xì)胞以及用儀器準(zhǔn)直標(biāo)準(zhǔn)作為石蠟包埋腫瘤組織細(xì)胞DNA倍體標(biāo)準(zhǔn)更不合適，主要原因在于石蠟包埋組織的固定劑為10%甲醛，如用EB、PI等熒光染色，甲醛固定劑對(duì)細(xì)胞熒光染色有很強(qiáng)的干擾作用，而且在正常組織細(xì)胞之間也存在較大差異。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品我們對(duì)各種石蠟包埋的正常組織二倍體細(xì)胞DNA含量進(jìn)行了研究，將人的淋巴細(xì)胞DNA含量作為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，將人的淋巴細(xì)胞分離出來后，進(jìn)行石蠟包埋，以70%乙醇固定的雞血紅細(xì)胞作為DNA內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，采用PI同步染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種正常組織細(xì)胞之間DNA含量存在較大的差異(見表4)。各種正常組織細(xì)胞之間DNA含量存在差異，推斷，可能各組織細(xì)胞之間與熒光染料結(jié)合多少有密切關(guān)系，熒光染料與DNA結(jié)合取決于染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)的凝聚程度。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品例如7－AAD(Aminoactionmycin，7－氨基－放線菌素D)與不同的正常組織DNA二倍體細(xì)胞結(jié)合，可以測(cè)定不同的DNA含量結(jié)果。例如精子細(xì)胞其染色質(zhì)高度凝聚，像PI、EB、AO一些熒光染料不能與其DNA結(jié)合，需經(jīng)過酸或熱變性處理后才能被染色。鑒于石蠟包埋組織的二倍體標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞DNA含量的定量結(jié)果差異較大的特點(diǎn)，對(duì)DNA二倍體標(biāo)準(zhǔn)的使用強(qiáng)調(diào)同種、同個(gè)體、同源組織，最好在同一個(gè)石蠟包埋組織塊中既有正常組織又有腫瘤組織。4.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品表4人類石蠟包埋正常組織二倍體細(xì)胞DNA含量分析正常組織類別例數(shù)DNA比值人淋巴細(xì)胞52.93±0.13淋巴結(jié)細(xì)胞302.91±0.16脾細(xì)胞102.87±0.13扁桃體152.90±0.17口腔粘膜222.65±0.21食管粘膜532.65±0.18胃粘膜403.01±2.03腸粘膜253.01±0.16氣管粘膜172.88±0.14肺組織222.77±0.134.流式細(xì)胞術(shù)的參考樣品腎組織102.81±0.15腎上腺53.11±0.27膀胱粘膜