柱層析的試驗(yàn)方法和技巧

柱層析分離技術(shù)及其實(shí)驗(yàn)技巧膠柱層析（正、反相柱層析）——根據(jù)物質(zhì)的極性不同進(jìn)行分離根據(jù)固定相和流動(dòng)相之間的極性不同，硅膠柱層析可以分為：正相柱層析、反相柱層析。通常把固定相極性大于流動(dòng)相極性的柱色譜方法稱(chēng)為正相柱層析，常用的流動(dòng)相為有機(jī)溶劑，如石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等。較適宜分離化合物為低級(jí)性、中等極性化合物。而把固定相極性小于流動(dòng)相極性的柱色譜方法稱(chēng)為反相柱層析，常用的流動(dòng)相為甲醇、水等極性溶劑。較適宜分離極性較高的化合物。凝膠層析——根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離凝膠層析又稱(chēng)為凝膠過(guò)濾、分子篩層析等，是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。常用的凝膠是葡聚糖凝膠（Sephadex），如SephadexLH-20。三、柱層析實(shí)驗(yàn)操作3.1層析柱的選擇這與樣品的處理量、分離難度、所用的基質(zhì)和分離目的有關(guān)。以基質(zhì)是硅膠為例，當(dāng)樣品量較多，分離難度較大（相鄰組分的HR較小，相差不到0.1）時(shí)，需選用較粗大的柱子以填充較多的硅膠。柱子長(zhǎng)，相應(yīng)的塔板數(shù)就高；柱子粗，上樣后樣品的原點(diǎn)就小（反映在柱子上就是樣品層比較?。?，這樣相對(duì)地減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有兩厘米，那么分離的難度可想而知，而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當(dāng)然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑，不過(guò)這些成本相對(duì)于產(chǎn)品來(lái)說(shuō)也許就不算什么。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開(kāi)（是指在所需組分Rf在0.2~0.4,雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子。在柱層析分離中流動(dòng)相(淋洗劑)的選擇尤為關(guān)鍵，直接影響到柱層析的分離效果，如果選擇不當(dāng)常常導(dǎo)致幾十毫克樣品，用了幾百毫升淋洗劑都還沒(méi)有完全分離，甚至不能分離。以硅膠柱為例，具體選擇哪種流動(dòng)相以及流動(dòng)相的極性，多是通過(guò)薄層色譜(TLC)來(lái)確定。一般來(lái)說(shuō)流動(dòng)相采用TLC分析得到的展開(kāi)劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄層板不同，即使兩者使用的硅膠都相同，但是在把TLC分析得到的展開(kāi)劑用在柱層析時(shí)，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了靠擴(kuò)散作用來(lái)分離，效果也不會(huì)好。在用TLC選擇流動(dòng)相時(shí)一般先根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的該中植物分離用什么樣的流動(dòng)相，就首先嘗試使用該類(lèi)展開(kāi)劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個(gè)分離效果好的展開(kāi)劑。很多時(shí)候，展開(kāi)劑的選擇要靠自己不斷變換展開(kāi)劑的組成來(lái)達(dá)到最佳效果，一般把兩種溶劑混合時(shí)，采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑，如果有分開(kāi)的跡象，再調(diào)整比例，達(dá)到最佳效果，如果沒(méi)有分開(kāi)的跡象，最好是換溶劑。此外在采用TLC選擇洗脫劑時(shí)還應(yīng)注意：第一，某種樣品在這種展開(kāi)劑中只顯示一個(gè)點(diǎn)，并不等于在別的展開(kāi)劑中也只顯示一個(gè)點(diǎn)。因此在尋找展開(kāi)劑時(shí)，多嘗試幾種比例不同，成分不同的展開(kāi)劑。展開(kāi)劑的極性太小，點(diǎn)分不開(kāi)；極性太大，也分不開(kāi)。第二，點(diǎn)不能點(diǎn)得太濃，否則容易重疊，不易判斷，因?yàn)槿绻麅蓚€(gè)點(diǎn)相近的話，一濃就變成一個(gè)點(diǎn)了。但也不能太淡，否則含量較少的成分可能斑點(diǎn)模糊或不顯出斑點(diǎn)。點(diǎn)樣時(shí)還應(yīng)避免損傷薄層。第三，薄層板上點(diǎn)的展開(kāi)的清晰程度和溶劑的極性和物質(zhì)在該溶劑中的溶解性有關(guān)，只有兩者比較合適了，才能有一個(gè)較好的分離效果。在選擇流動(dòng)相時(shí)還應(yīng)考慮到經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保。所以大多選用石油醚，乙酸乙酯。氯仿也是一種常用溶劑，但是要注意其毒性較大，所以要保持實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好。二氯甲烷也有用，但是它和硅膠的吸附是一個(gè)放熱過(guò)程，所以夏天的時(shí)候經(jīng)常會(huì)在柱子里產(chǎn)生氣泡，天氣冷的時(shí)候會(huì)好一些。甲醇能溶解部分的硅膠，產(chǎn)品最好經(jīng)過(guò)后繼處理，如重結(jié)晶等。其他的溶劑用的相對(duì)較少，要依據(jù)不同的需要選擇。還有，在使用混合溶劑時(shí)，使用的兩種溶劑的沸點(diǎn)應(yīng)該相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚（60~90），而乙醚卻要選擇沸程為30-60的石油醚。一般用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜），應(yīng)注意這些工業(yè)品的純度較低，經(jīng)常能從送來(lái)的大桶底部看見(jiàn)有色的雜質(zhì)，所以在比較嚴(yán)格的柱分時(shí)要對(duì)溶劑重蒸。進(jìn)行粗分時(shí)就不必，反正下面還要提純，以節(jié)省時(shí)間和精力。一般在過(guò)柱同時(shí)要進(jìn)行減壓旋蒸，流動(dòng)相為混和溶劑時(shí)（如石油醚和乙酸乙酯），流動(dòng)相的比例由于揮發(fā)度的不同會(huì)有所改變，從而導(dǎo)致極性的變化（一般會(huì)使得極性變大），在梯度淋洗時(shí)比較合適，正好所需流動(dòng)相的極性也是越來(lái)越大。3.3裝柱和上樣3.3.1裝柱在柱層析分離中柱子裝的質(zhì)量好與差也是能否成功分離純化物質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。柱子應(yīng)裝的要嚴(yán)實(shí)（均勻），不能分層等，否則重新裝柱。裝柱分為干法和濕法，不論干法還是濕法，硅膠（固定相）的上表面一定要平整。裝完的柱子都應(yīng)該要適度的緊密，柱子下面的活塞一定不要涂潤(rùn)滑劑，會(huì)被淋洗劑帶到產(chǎn)品中，可以采用四氟節(jié)門(mén)的。柱子不要開(kāi)裂，無(wú)論怎樣的開(kāi)裂都會(huì)影響分離效果，甚至使柱層析分離作廢。干法裝柱是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后用油泵直接抽，這樣就會(huì)使得柱子裝的很結(jié)實(shí)（抽真空時(shí)間不要太長(zhǎng)，以免柱子裝的過(guò)實(shí)，流速過(guò)慢而導(dǎo)致擴(kuò)散），接著是用淋洗劑“走柱子”。干法裝柱較方便、快速且溶劑耗量少，但是其分辨率低、柱效差，故適于大量樣品的粗步分離。在干發(fā)裝柱時(shí)應(yīng)注意：不要過(guò)分劇烈地震動(dòng)和敲打側(cè)壁，過(guò)分劇烈地震動(dòng)和敲打側(cè)壁會(huì)使得硅膠因自身粒徑的不均勻性而產(chǎn)生柱子整體的不均勻。濕法裝柱是先把硅膠用適當(dāng)?shù)娜軇ㄒ话阌昧芟磩┌鑴?，在硅膠顆粒還沒(méi)有沉降前裝入層析柱中。此法最大的優(yōu)點(diǎn)是柱子裝的比較結(jié)實(shí)，沒(méi)有氣泡，柱效高。在用濕法裝柱時(shí)，先在層析柱中裝入一定量的淋洗劑，放空一部分以排走所有的氣泡，關(guān)閉柱子活塞，在柱中留1~2cm的淋洗劑，然后裝入勻漿后，再用淋洗劑“走柱子”，直至硅膠界面不再下降為止。此時(shí)也可輕輕地敲打柱側(cè)，以加速硅膠的沉降和排走帶入的氣泡。3.3.2上樣上樣量的多少也直接影響到分離效果，一般講，加樣量盡量少些，這樣分離效果比較好，但是具體情況應(yīng)根據(jù)分離目的和分離難度而定，比如進(jìn)行粗分時(shí)上樣量可以多些。上樣也分干法和濕法：干法就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，再加入硅膠，拌勻，再揮干溶劑后裝入柱中。樣品和硅膠用量有個(gè)說(shuō)法是1:1，但是硅膠用量應(yīng)越少越好，只要保證在揮干溶劑后，看不到明顯的固體顆粒（說(shuō)明樣品完全吸附在硅膠上）這樣的硅膠量就合適了。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是初始淋洗劑，如果淋洗劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，用膠頭滴管沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入，然后用少量溶劑洗滌后，再加入。濕法較方便，省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒(méi)關(guān)系?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會(huì)析出，這一般都是比較大量的樣品才會(huì)出現(xiàn)，是因?yàn)楣枘z對(duì)樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會(huì)發(fā)生，這可以先重結(jié)晶，得到大部分的產(chǎn)品后再柱分，如果不能重結(jié)晶，也不用管，直接過(guò)柱就是了，樣品隨著淋洗劑流動(dòng)會(huì)溶解。3.4洗脫和收集3.4.1洗脫洗脫的方式可分為簡(jiǎn)單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。簡(jiǎn)單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過(guò)程結(jié)束為止。如果被分離物質(zhì)對(duì)固定相的親合力差異不大，其區(qū)帶的洗脫時(shí)間間隔（或洗脫體積間隔）也不長(zhǎng)，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數(shù)較大。分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進(jìn)行逐級(jí)洗脫。它主要對(duì)混合物組成簡(jiǎn)單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離時(shí)適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來(lái)。梯度洗脫：當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時(shí)，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強(qiáng)度或pH值等。最常用的是濃度梯度。洗脫時(shí)的流速也應(yīng)控制好，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。流速太快，各組分在固液兩相中平衡時(shí)間短，相互分不開(kāi)，仍以混合組分流出。速度太慢，將增大物質(zhì)的擴(kuò)散，同樣達(dá)不到理想的分離效果。在洗脫過(guò)程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)氣泡，一是和使用的溶劑有關(guān)，如果是易揮發(fā)的溶劑（如乙醚、二氯甲烷等），在室溫稍高的情況下，很容易出現(xiàn)這種現(xiàn)象，因此，在室溫高的時(shí)候，可以選擇沸點(diǎn)較高，揮發(fā)相對(duì)小的溶劑。二是不論是用帶砂板的還是塞棉花的層析柱，在裝柱之前，都要將空氣排干，這樣就可避免柱中有空氣。此外，在整個(gè)洗脫過(guò)程中，最好保持洗脫不間斷，若不得不停止洗脫過(guò)程，一定要保持整個(gè)柱子充滿淋洗液，千萬(wàn)不能讓柱子走干，否則分離純化將會(huì)前功盡棄。3.4.2收集一份收集量的多少要以樣品量和樣品的性質(zhì)而定，分離樣品量多收集多一點(diǎn)，量少收