《基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間核酸質(zhì)譜法體細(xì)胞突變檢測(cè)通則》

Q/LB.□XXXXX-XXXX基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間核酸質(zhì)譜法體細(xì)胞突變檢測(cè)通則范圍本文件為實(shí)驗(yàn)室利用飛行時(shí)間核酸質(zhì)譜平臺(tái)進(jìn)行腫瘤個(gè)體化用藥基因或腫瘤良惡性輔助診斷基因的體細(xì)胞突變檢測(cè)提供技術(shù)指導(dǎo)。本文件適用的樣本類型包括新鮮腫瘤組織、腫瘤組織或者細(xì)胞石蠟包埋切片。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。T/ZZB2482-2021飛行時(shí)間核酸質(zhì)譜儀術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。引物（Primer）結(jié)合于模板鏈上，引導(dǎo)聚合酶進(jìn)行延伸的起始位點(diǎn)或終止位點(diǎn)的，具有一定長(zhǎng)度和順序的寡核苷酸。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainCeaction）聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)是一種在體外對(duì)模板DNA或RNA的特定片段進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，包含變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟。單堿基延伸（SingleBaseExtension）適宜的反應(yīng)體系中，在延伸引物引導(dǎo)下，聚合酶以ddNTP或者acyNTP為底物僅延伸單個(gè)堿基，常用于DNAsequencing和SNP檢測(cè)。體細(xì)胞突變（SomaticMutation）體細(xì)胞突變是相對(duì)于胚系突變而言的，發(fā)生在體細(xì)胞中的突變，即在體細(xì)胞發(fā)生了基因突變或染色體畸變，突變性狀一般不能傳給下一代個(gè)體，卻可以引起當(dāng)代某些細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的突變。此文的體細(xì)胞突變指單堿基突變。縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）SAP：蝦堿性磷酸酶（shrimpalkalinephosphatase）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）dUTP：脫氧尿苷三磷酸（2'-deoxyuridine5'-triphosphate）ddATP：2',3'–二脫氧腺苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-adenosine-5'-triphosphate）ddGTP：2',3'-二脫氧鳥苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-guanosine-5'-triphosphate）ddCTP：2',3'-二脫氧胞苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-cytidine-5'-triphosphate）ddTTP：2',3'-二脫氧胸苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-thymidine-5'-triphosphate）UDG：尿嘧啶DNA糖基酶（Uracil-DNAGlycosylase）原理提取純化獲得DNA模板，通過PCR擴(kuò)增出含有突變位點(diǎn)的一段靶序列，經(jīng)SAP消化去除擴(kuò)增產(chǎn)物中多余的dNTP，加入序列特異性延伸引物（其3’端堿基緊挨突變位點(diǎn)）和突變位點(diǎn)特異性的末端終止堿基,這樣，突變位點(diǎn)在延伸酶的作用下進(jìn)行單堿基延伸，而野生型位點(diǎn)得不到延伸，富集突變含量，延伸產(chǎn)物經(jīng)過脫鹽純化后，轉(zhuǎn)移至帶有基質(zhì)的載體上，使用MALDI-TOF對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，通過質(zhì)荷比信號(hào)分析確定模板中是否存在突變?；诒驹?，可檢測(cè)出10ngDNA樣品中含量低至1%的突變。試劑與耗材除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純。也可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)需求，選擇其他型號(hào)的同等功能的耗材和試劑。推薦試劑與耗材如下：10xPCR緩沖液；50mmol/L氯化鎂溶液；25mmol/LdNTP/dUTPMix；5U/μLDNA聚合酶；5U/μLUDG；18MΩ*cm@25℃的純化水；10xSAP緩沖液；1.7U/μLSAP酶；10x延伸緩沖液；ddATPMix；ddGTPMix；ddCTPMix；ddTTPMix；單堿基延伸引物；延伸酶；3Pt校準(zhǔn)品；質(zhì)譜芯片。儀器與設(shè)備包含但不限于以下設(shè)備：超凈工作臺(tái)；純水儀；渦旋震蕩儀；高速離心機(jī)；掌式離心機(jī)；全排生物安全柜；紫外可見分光光度計(jì)；PCR擴(kuò)增儀；飛行時(shí)間核酸質(zhì)譜儀。操作步驟樣本的預(yù)處理新鮮組織樣本，根據(jù)組織大小剪碎、用玻璃勻漿器將組織徹底研磨；蠟塊樣本，則需切成5片4μm厚度的連續(xù)切片，其中1片進(jìn)行HE染色，確保含有腫瘤病變細(xì)胞比例不低于20%，用于核酸提取的則需3～5張連續(xù)性的切片。核酸提取及要求使用核酸提取試劑盒提取或同類方法；提取的核酸純度通過A260/A280比率判定，DNA的A260/A280的比值建議在1.8～2.0之間。PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)試劑配制、PCR反應(yīng)程序詳見附錄A。SAP消化反應(yīng)根據(jù)附錄B配制SAP反應(yīng)混合液，分裝到微孔管中，每孔2μL。從PCR擴(kuò)增儀上取出8.3的擴(kuò)增產(chǎn)物，放入掌式離心機(jī)，5000rpm，離心30s。在核酸擴(kuò)增區(qū)的生物安全柜里，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分裝到已加了SAP混合液的微孔中，每孔分裝5μL，使總體積達(dá)到7μL；完成分裝后蓋緊反應(yīng)管，在渦旋儀上充分混勻30s，放入掌式離心機(jī)，5000rpm，離心30s。各反應(yīng)管按一定順序放入PCR儀上，按照附錄B的SAP程序進(jìn)行消化反應(yīng)。單堿基延伸反應(yīng)根據(jù)附錄C配制單堿基延伸反應(yīng)混合液；從PCR儀上取出8.4的SAP產(chǎn)物，放入掌式離心機(jī)，5000rpm，離心30s。取2μL的延伸混合液加入上述步驟的PCR/SAP產(chǎn)物中，完成分裝后，蓋緊反應(yīng)管，在渦旋儀上充分混勻30s，放入掌式離心機(jī)，5000rpm，離心30s。將各反應(yīng)管按一定順序放入PCR儀上，按照附錄C的延伸反應(yīng)程序進(jìn)行延伸反應(yīng)。飛行時(shí)間核酸質(zhì)譜儀器分析要求應(yīng)符合T/ZZB2482-2021中的規(guī)定。質(zhì)量控制在實(shí)驗(yàn)過程中，同時(shí)加上陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照的檢測(cè)。結(jié)果分析利用質(zhì)譜分析軟件，分析陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照的檢出情況，分析擴(kuò)增子的信號(hào)峰和突變位點(diǎn)的信號(hào)峰。結(jié)果表述根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，對(duì)突變位點(diǎn)結(jié)果判斷為基因突變、野生型。實(shí)驗(yàn)室要求對(duì)于采用本標(biāo)準(zhǔn)開展飛行時(shí)間核酸質(zhì)譜平臺(tái)用于腫瘤個(gè)體化用藥基因或腫瘤良惡性輔助診斷基因的體細(xì)胞突變檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)具備基因擴(kuò)增檢測(cè)相關(guān)資質(zhì)，并需經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)提出方的評(píng)價(jià)和許可。

（資料性）

PCR反應(yīng)液配方表及反應(yīng)程序PCR反應(yīng)液配方表試劑名稱濃度用量/μLPCR緩沖液10×2.0氯化鎂溶液50mmol/L1.6dNTP/dUTPmix25mmol/L0.1DNA聚合酶5U/μL0.2UDG1U/μL0.2F/R引物10μmol/L0.6純化水/13.4DNA≥5ng/μL2.0總量/20.0PCR反應(yīng)程序步驟溫度/℃時(shí)間循環(huán)數(shù)1372min129510min139520s556530s44*∞1PCR產(chǎn)物暫時(shí)不進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作，可4℃保存不超過12h。

（資料性）

SAP反應(yīng)混合液配方表及反應(yīng)程序SAP反應(yīng)混合液配方表試劑名稱濃度用量/μL10xSAP緩沖液10×0.17SAP1.7U/μL0.3水/1.53總量/2.0SAP反應(yīng)程序步驟溫度/℃時(shí)間循環(huán)數(shù)13740min12855min134∞1建議SAP反應(yīng)產(chǎn)物及時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作，若暫不進(jìn)行下一步操作，可2～8℃保存不超過24h。

（資料性）

單堿基延伸反應(yīng)混合液配方表及反應(yīng)程序單堿基延伸反應(yīng)混合液配方表試劑名稱濃度用量/μL10x延伸緩沖液10×0.2ddATPmix/ddGTPmix/ddCTPmix/ddTTPmix/0.2單堿基延伸引物5μmol/L～15μmol/L0.94延伸酶32U/μL0.04純化水/0.62總量/2.0單堿基延伸反應(yīng)程序步驟溫度/℃時(shí)間循環(huán)數(shù)19530s12955s140525s5805s3723min144∞1延伸產(chǎn)物暫不