DB51T 1843-2014 豬A群輪狀簿RT-PCR檢測技術規(guī)范　

豬A群輪狀病毒RT-PCR檢測技術規(guī)范2014-09-19發(fā)布2014-10-01實施四川省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14設備和試劑 1 26反轉錄 37PCR擴增 3 39結果判定 310廢棄物無害化處理 3附錄A(規(guī)范性附錄)相關試劑的配制 5本標準的附錄A為規(guī)范性附錄。本標準由四川省農業(yè)廳提出并歸口。本標準由四川省質量技術監(jiān)督局批準。本標準起草單位：西南民族大學。本標準主要起草人：任玉鵬、岳華、湯承、張斌、張煥容、楊發(fā)龍、王遠微。1豬A群輪狀病毒RT-PCR檢測技術規(guī)范本標準規(guī)定了豬A群輪狀病毒RT-PCR檢測方法。本標準適用于豬只感染豬A群輪狀病毒的檢測、診斷和流行病學調查。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB16548病害動物和病害動物產品生物安全處理規(guī)程《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》(2003農業(yè)部公告第302號)3術語和定義本標準采用下列術語和定義。豬A群輪狀病毒groupAporcinerotavirus,GAR豬輪狀病毒(porcinerotavirus,PRV)是呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬成員，基因組由11個節(jié)段的雙股正鏈RNA組成；PRV主要包括A、B、E、C四個血清型，臨床上豬只感染以豬A群輪狀病毒(group豬A群輪狀病毒病以豬A群輪狀病毒為主要病原，引起劇烈嘔吐、腹瀉和脫水等為特征的人畜共患胃腸道傳染病。4設備和試劑4.1主要儀器和設備4.1.1PCR擴增儀4.1.2電泳儀、水平電泳槽4.1.3凝膠成像系統(tǒng)4.1.4冷凍高速離心機4.1.5微量高速離心機(適合于對PCR反應管進行離心操作)4.1.6高壓蒸汽滅菌鍋4.1.7渦旋儀24.1.8恒溫水浴鍋4.1.9移液器(0.1μL～2.5μL、0.1μL~10μL、20μL～200μL、200μL～1000μL)4.2主要試劑4.2.1引物(10μmol/L)P1:5'-TCAAGCACGATTTGP2:5'-GCCTGGTGGAAATACT擴增片段長度274bp。4.2.2變性液：見附錄A.1。4.2.32mol/L醋酸鈉溶液(pH4.0):見附錄A.2。4.2.4水飽和酚(pH4.0)。4.2.5氯仿/異戊醇(49/1)混合溶液。4.2.6PrimescriptTMRT試劑盒4.2.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)。4.2.81.0%瓊脂糖凝膠：見附錄A.3。4.2.950×TAE緩沖液：見附錄A.4。4.2.10核酸染料(Goldview)。4.2.11DEPC處理的滅菌雙蒸水：見附錄A.5。4.2.12異丙醇。4.2.13DEPC處理的滅菌雙蒸水配置的75%乙醇：見附錄A.6。4.2.1510×PCR緩沖液。4.2.166×上樣緩沖液(6×LoadingBuffer)。4.2.17DNA分子量標準DL600。4.2.18水：所用水應符合GB/T6682中三級水(三蒸水)規(guī)格。4.2.19陽性對照：豬A群輪狀病毒CVCCAV69株購自國家獸醫(yī)微生物菌種保存中心。4.2.20陰性對照：用符合GB/T6682中的三級水代替RT-PCR擴增模板。5.1樣本處理5.1.1腸內容物：選擇疑似病癥的豬只，無菌采集小腸內容物1g,用10mmol/LPBS緩沖液稀釋10倍；在渦旋儀上振蕩混勻后反復凍融2次，10000r/min離心10min,取上清液備用。5.1.2肛門拭子：將肛門拭子等棉拭子浸入1mL的10mmol/LPBS緩沖液中30min,充分混勻后反復凍融2次，12000r/min離心10min,取上清液備用。5.1.3腹瀉糞便：采集病豬新腹瀉糞便1g,用10mmol/LPBS緩沖液將糞便稀釋10倍，在渦旋儀上振蕩混勻后反復凍融2次，10000r/min離心10min,取上清液備用。5.1.4對照樣本：陰陽性樣本處理與檢測樣本處理方法相同。5.2異硫氰酸胍一步法抽提RNA5.2.1每次試驗前應設立陽性和陰性對照。35.2.2取處理后待檢樣品上清液100μL,加入變性液300μL顛倒混勻，加入30μL2mol/L乙并取上清。5.2.3依次加入150μL飽和酚、150μL氯仿-異戊醇，反復顛倒混勻5次，冰浴15min。5.2.412000r/min、4℃離心20min,將上層含RNA的水相移入一新管中，不應吸取水相的最下層。5.2.5加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，冰浴靜置10min沉淀RNA。5.2.612000r/min、4℃離心10min,棄上清。5.2.7加入1mL用DEPC水配制的75%乙醇顛倒混勻洗滌沉淀，12000r/min、4℃離心10min,棄上清。5.2.8將含有RNA沉淀的離心管靜置干燥沉淀5min~10min,用20μLDEPC處理水將沉淀充分溶解，在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?反轉錄6.1cDNA的合成：將溶解的RNA按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。增儀中進行反轉錄(RT)反應。6.3cDNA的合成條件為：37℃15min,85℃5s,4℃5min。反轉錄后得到的cDNA置于-20℃保存。7PCR擴增7.1PCR反應體系：10×PCRBuffer2.5μL、MgCl2(25mM)2μL、dNTP(2.5mM)2μL、TaqDNAμL、模板cDNA2μL,總體系25μL。7.2PCR反應條件：94℃預變性5min,94℃30s,51℃30s,72℃30s的循環(huán)，進行35個循8PCR產物的電泳檢測8.1用TAE電泳緩沖液配制成2%瓊脂糖凝膠(見附錄A)。8.2取5μLPCR產物與1μL6×上樣緩沖液混合，分別加入樣品孔，同時在一加樣孔中加入DNA分子量標準(DL600),以5V/cm恒壓電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)判定核酸片段大小。9結果判定9.1陽性對照出現(xiàn)一條274bp大小的條帶，且陰性對照樣本不出現(xiàn)條帶。9.2在滿足10.1條件下，被檢樣品的PCR產物經(jīng)電泳后出現(xiàn)一條約274bp的條帶判定為核酸陽性(+);被檢樣品的PCR產物經(jīng)電泳后不出現(xiàn)274bp的條帶判定為核酸陰性(-)。10廢棄物無害化處理4A.1變性液鈉溶293mL水中。65℃攪拌混勻，溶解充分。室溫下保存，使用前按每50mL變性液加0.36mL14.4在100mL容量瓶中，加入16.4g乙酸鈉，加入適量滅菌雙蒸水，用冰乙酸調pH至4.0后定容。用瓊脂糖1.0g,1×TAE電泳緩沖液100mL,混勻后在微波爐中完全融化，待冷卻至50℃~60℃時，加核酸染料10μL,搖勻倒入凝膠板，待凝固后取下梳齒，備用。在100mL容量瓶中，加入EDTA18.61g,加入適量滅菌雙蒸水，用氫氧化鈉調pH至8.0時定容。A.4.2TAE電泳緩沖液(50×)