DB51T 1420-2012 動物細粒刺球蚴檢疫技術(shù)規(guī)范 全血金標免疫滲濾法

動物細粒棘球蚴檢疫技術(shù)規(guī)范——全血金標免疫滲濾法2012-03-30發(fā)布2012-05-01實施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14檢測方法 2附錄A(資料性附錄)試劑的配制方法 4附錄B(資料性附錄)細粒棘球蚴囊液粗抗原制備 5 6工DB51/T14本標準由四川出入境檢驗檢疫局提出并歸口。本標準由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準發(fā)布。本標準起草單位：四川出入境檢驗檢疫局、四川農(nóng)業(yè)大學。本標準主要起草人：余華、楊光友、嚴玉寶、胡娟、崔鵬博、周岷江。1動物細粒棘球蚴檢疫技術(shù)規(guī)范——全血金標免疫滲濾法本標準規(guī)定了動物細粒棘球蚴的檢疫技術(shù)方法。本標準適用于動物細粒棘球蚴的全血金標免疫滲濾法檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T541動物疫病實驗室檢驗采樣方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標準細粒棘球蚴Echinococcosisgranulosa指細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的中絳期幼蟲，它寄生于牛、羊等動物及人的肝臟和肺臟等部位，可引起動物和人的嚴重寄生蟲病，即棘球蚴病(Hydatidosis)或稱包蟲病。全血金標免疫滲濾法DIGFA是一種檢測全血標本的棘球蚴現(xiàn)場快速檢測方法，它以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。全血金標免疫滲濾法方法是采用土豆凝集素與全血混合達到快速凝血的目的。4檢測方法4.1試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T6682規(guī)定的二級水。2氯金酸；抗檢測動物IgG二抗；三羥甲基氨基甲烷(Tris);塑料小盒；吸水墊料；硝酸纖維素膜(NC膜);碳酸鉀；土豆凝集素；5%的BSA封閉液，配制見附錄A.5;PBS緩沖液，配制見附錄A.6;PBST洗滌液，配制見附錄A.7;受檢動物細粒棘球蚴抗體陽性血清；受測動物細粒棘球蚴抗體陰性血清；硫酸銨沉淀法純化的細粒棘球蚴囊液抗原(0.2mg/mL),配制見附錄B。4.2儀器和設(shè)備高速冷凍離心機；移液槍；核酸蛋白儀；紫外分光光度計；金標噴點儀。4.3檢測步驟4.3.1待檢血樣按照NY/T541“樣品的采集”有關(guān)章節(jié)要求，采集每頭待檢動物全血5mL,加入0.01%的土豆凝集素(50μL),室溫(20℃~26℃條件下操作)備用。4.3.2膠體金-抗抗體制備試劑配制0.01%氯金酸溶液配制見A.1;1%的檸檬酸三鈉溶液配制見A.2;0.1moL/HCL配制見A.3。制備方法取0.01%氯金酸溶液100mL加熱煮沸后，在劇烈攪拌下加入1%的檸檬酸三鈉溶液3mL。待溶液變成葡萄酒紅色后繼續(xù)煮10min,冷卻后以0.1moL/HCL調(diào)節(jié)pH至6.0,將抗抗體按照1:40的濃度加入膠體金中。迅速混勻10min后，加入1%的PEG(MV10000)使其濃度為0.05%,3000r/min離心5min,取上清12000r/min離心20min,棄上清，沉淀混懸于含1%BSA的PBS中，即為膠體金抗抗體結(jié)合物。34.3.3診斷膜制備硝酸纖維素膜(NC膜)(孔徑0.3μm)用超純水浸泡30min,取出晾干后用鉛筆在膜上畫出1cm見方的方格，用pH7.2的Tris-HCL緩沖液(配制見附錄A.4)浸泡30min晾干后，根據(jù)需要剪成一定大小，將1μL制備好的棘球蚴囊液抗原(0.2mg/mL)點于NC膜膜片上方格中央，待室溫下干燥后，用含5%的BSA的封閉液進行封閉，37℃干燥后置4℃冰箱保存。4.3.4滲濾裝置組裝將處理好的硝酸纖維素膜(NC膜)下墊一層吸水墊料，并壓縮于塑料小盒內(nèi)。4.3.5金標免疫滲濾操作將檢測裝置置于平板上，在NC膜中央滴加5μL的PBS緩沖液(0.02mol/LpH7.4)。待PBS緩沖液滲入，加5μL待測全血樣本。待全血樣本滲入，加10μLPBST洗滌液(pH7.4,含0.05%Tween-20的0.01molPBS)洗液洗去未結(jié)合抗體。待PBS緩沖液滲入，加膠體金標記抗IgG結(jié)合物1滴。待膠體金標記抗IgG結(jié)合物滲入，加10μLPBST洗滌液(pH7.4,含0.05%Tween-20的0.01molPBS)洗去未結(jié)合抗抗體。靜置，肉眼觀察結(jié)果。4.3.6結(jié)果判定肉眼觀察，每次試驗時均須設(shè)立陽性、陰性血樣對照，對照成立方可判定結(jié)果。完成上述操作后，室溫下(20℃~26℃條件下操作)靜置10min后觀察結(jié)果，直到硝酸纖維素膜(NC膜)抗原點顯示出紫紅色斑點。根據(jù)斑點顏色深淺可以標記為：+++深度為強陽性，艸深度為陽性，+深度為弱陽性，未出現(xiàn)斑點則為陰性。4(資料性附錄)試劑的配制方法A.10.01%氯金酸溶液將1g氯金酸溶于100mL蒸餾水(氯金酸極易潮解)配成高濃度溶液，取1mL高濃度氯金酸溶液混合99mL蒸餾水配制成0.01%氯金酸溶液，置4℃保存。A.21%的檸檬酸三鈉溶液1g檸檬酸三鈉，溶于99mL蒸餾水，配制成1%的檸檬酸三鈉溶液，置4℃保存。0.1mol/L的鹽酸由36～37%的濃鹽酸9mL,注入1000mL水搖勻，密閉儲存。A.4pH7.2的Tris-HCL緩沖液Tris(三羥甲基氨基甲烷)2.4228g、800mL蒸餾水，再也HCl調(diào)節(jié)pH至7.2,再定容至1000mL,置于4℃保存。A.55%的BSA封閉液(100mL)取5gBSA(牛血清白蛋白),加PBS緩沖液定容至100mL,置于4℃保存。A.6PBS(pH7.4)緩沖液取KH?PO?·2H?O0.2g,Na?HPO?·12H?O2.9g,NaCl8.0g,KC10.2g,加蒸餾水至800mL,調(diào)節(jié)pH至7.4,加蒸餾水定容至1000mL,置于4℃保存。A.7PBST洗滌液取0.5mLTween-20加入1000mLPBS(pH7.4),攪拌混勻，置4℃保存。5(資料性附錄)細粒棘球蚴囊液粗抗原制備從動物屠宰場采集寄生于動物(綿羊或牛)肝臟和肺臟的細粒棘球蚴包囊，在無菌條件下抽取囊液，除去上層脂類，反復凍融3次。并在冰浴中用9.5mm探頭23KHZ超聲粉碎兩次，每次30sec。然后將抗原4000r/min離心30min,取上清液，經(jīng)硫酸銨鹽析，再用PBS(pH7.4,0.02mol/mL)透析。經(jīng)核酸蛋白儀測定蛋白濃度為2.7mg/mL,冷凍保存。6[1]EckertJ,EpizooticsIO.WHO/OIEmanhealthproblemofglobalconcern.WorldOrganisationforAnimalHealthParis,2[2]郭志宏，彭毛，李永壽，等.青海省部分地區(qū)人包蟲病的流行調(diào)查.中國動物檢疫，2008,25[3]JiangC.Today'sregionaldistrib[4]楊炬，劉天錫.包蟲病流行病學研究進展.寧夏醫(yī)學雜志，2008,30(4):378-379.[5]ZhenghuanW,XiaomingW,XiaoqingL.EchinococcosisinChina,aReviewofthEchinococcusspp.Ecohealth,2008,5(2):115-126.[6]TorgersonP,DeplazesP.Echinococcosis:distudies.Trendsparasitol,2009,25(4):164-170.[7]賈紅，劉丹，侯紹華，等.羊細粒棘球蚴病抗體間接ELISA檢測方法的建立.畜牧獸醫(yī)學報，2011,42(1):65-70.[8]ZhangW,LiJ,McManusDP.ConceptsinimmunologyanddiagnosisofhyMicrobiolRev,2003,16(1):18.[9]彭毛.玉樹縣放牧羊棘球蚴病感染情況調(diào)查.中國動物檢疫，2009,(12):43-43.[10]BiavaM-P,M.F.,DaoM,AHU,A.,FortierM,PU-PH,B.Laboratorydiagnosisofcystichydaticdisease.Worldjournalofsurgery,2001,25(1):10-14.[11]康金鳳，劉文杰小鼠細粒棘球蚴不育囊的超微結(jié)構(gòu)觀察.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，[12]Al-YamanFM,KnoblochJ.Isolationandpartialcharacterizationofcross-reactiveantigensofEchinococcusgranulosus[13]KanwarJ,KaushikS,SawhneyI,etal.Specificantibodiesinserumofpatientsrecognisedbyimmunoblotting.JMedmicrobio,1992,36(1):46.[14]EckertJ,DeplazesP.Biological,epidemiological,andclinicalaspectsofechinococcosis,azoofincreasingconcern.ClinMicrobiolRev,2004,17(1):107.[15]韓秀敏.國內(nèi)包蟲病免疫診斷技術(shù)進展.地方病通報，1997,12(3):87-90.antigensforrapidserodiagnosisofhu7[17]何金戈，邱加閩.純化抗原和粗抗原診斷包蟲病的效果比較.實用寄生蟲病雜志，2002,10[18]邵錫如，肖樂義.固相金斑免疫試驗檢測包蟲病血清抗體技術(shù)的初步建立.中國人獸共患病雜志，1998,14(2):51-51.[19]CarmenaD,BenitoA,ErasoE.Antigensfortheimmunodiagnosisinfection:Anupdate.Acttrop,2006,98(1):74-86.[20]聶華明，余華，嚴玉寶，楊光友，古小彬.棘球蚴病與棘球絳蟲病診斷與檢疫方法研究進展.中國動物檢疫，2011,28:(10):69-74.[21]SiavashiMR,TaherkhaniH,RezaeiK,e