DB51T 1203-2011 馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒檢疫鑒定技術(shù)規(guī)程　

DB51/T1203—20112011-01-25發(fā)布2011-03-01實(shí)施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 1 15試劑與材料 16儀器及用具 3 38實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn) 39結(jié)果判定 410樣品保存 4附錄A(資料性附錄)馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒基本信息 5附錄B(資料性附錄)馬鈴薯M病毒DAS-ELISA檢驗(yàn)程序 6附錄C(資料性附錄)馬鈴薯S病毒DAS-ELISA檢驗(yàn)程序 8附錄D(資料性附錄)馬鈴薯M病毒RT-PCR檢驗(yàn)程序 附錄E(資料性附錄)馬鈴薯S病毒RT-PCR檢驗(yàn)程序 本標(biāo)準(zhǔn)分為范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、原理、試劑與材料、儀器及用具、取樣、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、結(jié)果判斷、樣品保存等部分。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：寧紅、萬(wàn)佳、劉可、郭迪金、吳志平、黃玲、李耄11范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬鈴薯M病毒(見(jiàn)附錄A)、馬鈴薯S病毒(見(jiàn)附錄A)的取樣、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、結(jié)果判斷2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB15569-2009農(nóng)業(yè)植物調(diào)運(yùn)檢疫規(guī)程DB51/T868-2009馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯A病毒檢驗(yàn)鑒定技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1注：改寫DB51/T868-2009,定義3.6。4原理兩種病毒田間通過(guò)蚜蟲和農(nóng)事操作進(jìn)行傳播，遠(yuǎn)距離主要通過(guò)人為的引種、商品流通等途徑傳播，帶毒塊莖和種苗是該病毒遠(yuǎn)距離傳播的主要載體，兩種病毒具有潛隱性，根據(jù)病害癥狀很難確定馬鈴薯M病毒和馬鈴薯S病毒的病毒種類，薯塊上一般不表現(xiàn)癥狀。5試劑與材料除非另有說(shuō)明，在本標(biāo)準(zhǔn)中僅使用確認(rèn)的分析純?cè)噭┖驼麴s水或去離子水或相當(dāng)純度的水。5.1免疫學(xué)檢驗(yàn)試劑5.1.1.1馬鈴薯M病毒免疫球蛋白，抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行。貯藏于4℃條件下備用。25.1.1.2馬鈴薯S病毒免疫球蛋白，抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行。貯藏于4℃條件下備用。5.1.2.1用堿性磷酸酶標(biāo)記的馬鈴薯M病毒的免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行稀釋，貯藏于4℃條件下備用。5.1.2.2用堿性磷酸酶標(biāo)記的馬鈴薯S病毒的免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行稀釋，貯藏于4℃條件下備用。5.1.3包被緩沖液(Coatingbuffer)取2.93g碳酸氫鈉(NaHCOs)水磷酸二氫鉀(KH?PO?)、8.0g氯化鈉(NaCl)、0.5g吐溫-20,用1000mL蒸餾水溶解，并調(diào)整pH值到7.4。24-4000)、0.2g疊氮化鈉(NaN?)、2.0gⅡ級(jí)雞蛋清白蛋白粉、20.0g吐溫-20,用1000mL洗滌液溶解，并調(diào)整pH值到7.4,貯藏于4℃條件下備用。5.1.6酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液(ECIBuffer)取0.2g牛血清白蛋白(或脫脂奶粉)、2.0g聚乙烯吡藏于4℃條件下備用。5.1.7底物緩沖液(PNPBuffer)用80mL滅菌值到9.8,定容到100mL,貯藏于4℃條件下物溶液制備需在孵育結(jié)束前15min內(nèi)，避光條件下制備。5.2.35×RT緩沖液(5xRTBuffer)50mMTis-HClPH7.5,100mMNaC1,0.1mMEDTA,10mMDTT,0.01%NP-40,50%甘油。5.2.410×PCR緩沖液100mMTr5.2.5MgCl?25mM。5.2.6RNA酶抑制劑(RNasin)10U/μ1。5.2.7RT增強(qiáng)劑(RTEhancer)。5.2.11Taq酶2.5U/μ1。5.2.14雙蒸水(ddH?O)。5.2.16液氮(N?)。35.2.17.1PVM上游引物(P1)堿基序列：5'-下游引物(P2)堿基序列：5'-用雙蒸水稀釋至20μM。下游引物(P2)堿基用雙蒸水稀釋至20μM。5.2.19溴酚藍(lán)(Bromophenolblue)C??H??Br?O?S。5.2.20瓊脂糖凝膠稱取1.5g瓊脂糖緩緩倒入250mL三角瓶?jī)?nèi)，加入100mL1×TAE,在微波爐中小心拔出梳齒。儀器及用具包括：——聚乙烯微量滴定板根據(jù)樣品數(shù)量選用40孔和96孔兩種規(guī)格；規(guī)格及配套吸頭；——天平1/100g,1/1000g;——培養(yǎng)箱；——臺(tái)式高速離心機(jī)；——酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；——水平電泳儀；——凝膠成像系統(tǒng)；——PCR擴(kuò)增儀；——EP管；——冰箱；——超低溫冰箱；——渦旋混勻器。取樣方法按DB51/T868-20097.2和DB51/T868-20097.3的規(guī)定。7.2種薯(塊莖)取樣按GB15569-20096.2的規(guī)定進(jìn)行抽樣。48.1.1馬鈴薯M病毒檢驗(yàn)方法見(jiàn)附錄B。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說(shuō)明操作。8.1.2馬鈴薯S病毒檢驗(yàn)方法見(jiàn)附錄C。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說(shuō)明操作。8.2.1馬鈴薯M病毒樣品的制備與檢驗(yàn)方法見(jiàn)附錄D。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說(shuō)明操作。8.2.2馬鈴薯S病毒樣品的制備與檢驗(yàn)方法見(jiàn)附錄E。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說(shuō)明操作。9.1DAS-ELISA在陰性對(duì)照OD值≤0.1,且陽(yáng)性對(duì)照OD值大于陰性對(duì)照OD值2倍的前提下，樣品孔OD值大于陰性對(duì)照OD值2倍時(shí)，判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品帶相應(yīng)的被檢病毒；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品不帶相應(yīng)的被檢病毒。在陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶，且陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)630bp目標(biāo)條帶的前提下，樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果在630bp處出現(xiàn)目標(biāo)條帶，判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品帶PVM病毒；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品不帶PVM病毒。在陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶，且陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)435bp目標(biāo)條帶的前提下，樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果在435bp處出現(xiàn)目標(biāo)條帶，判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品帶PVS病毒；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品不帶PVS病毒。10樣品保存經(jīng)檢疫鑒定后的樣品，應(yīng)在-80℃~-20℃保存三個(gè)月，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲裁，保存期滿后，需進(jìn)行滅活處理。5(資料性附錄)馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒基本信息A.1.1馬鈴薯M病毒potatovirusM簡(jiǎn)稱PVM。屬香石竹潛隱病毒屬。病毒粒體微曲線狀，大小650×12nm,致死溫度65～71℃,稀釋限點(diǎn)100～1000倍，20℃體外存活期幾天。引起馬鈴薯小葉病。A.1.2馬鈴薯S病毒potatovirusS病汁液稀釋限點(diǎn)1~10倍，鈍化溫度55~60℃,體外存活期3～4天。在馬鈴薯上引起輕度皺縮花葉或不顯癥，其寄主范圍較窄，系統(tǒng)侵染的植物僅限于茄科的少數(shù)植物A.2為害A.2.1馬鈴薯M病毒為害癥狀產(chǎn)生明顯花葉，葉片嚴(yán)重變形，并很快黃化至干枯；病株嚴(yán)重萎縮和矮化，其株高只相當(dāng)于健株的1/3度在24℃以上，病癥隱蔽。該病毒是馬鈴薯上常見(jiàn)的病害，可引起較大的產(chǎn)量損失，在東歐引起的產(chǎn)量A.2.2馬鈴薯S病毒為害癥狀馬鈴薯S病毒單獨(dú)侵染時(shí)常常不表現(xiàn)癥狀，可持續(xù)存在馬鈴薯薯塊中，并通過(guò)薯塊作遠(yuǎn)距離傳播。在田間該病毒傳播很快，傳播范圍廣，既可通過(guò)葉片接觸傳播，也可通過(guò)蚜蟲傳播，種植一季后感染率可高達(dá)70%,可使馬鈴薯減產(chǎn)10-20%。當(dāng)與馬鈴薯X病毒混合侵染時(shí)，可減產(chǎn)20-30%。A.3傳播途徑兩種病毒田間通過(guò)蚜蟲和農(nóng)事操作進(jìn)行傳播，遠(yuǎn)距離傳播主要通過(guò)人為的引種、商品流通等，帶毒塊莖和種苗是該病毒傳播的主要載體。6DB51/T1203—2011(資料性附錄)馬鈴薯M病毒DAS-ELISA檢驗(yàn)程序B.1包被抗體B.1.1包被B.1.2洗板吸干反應(yīng)孔中殘留液體。B.2點(diǎn)樣B.2.1樣品制備將待測(cè)樣品剪碎，取0.3g于研缽中，加入1mL樣品提取液充分研磨后，再加入2mL樣品提取液充分研磨至均勻。剩余樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)洳?，在制樣時(shí)應(yīng)注意防止樣品的交叉污染。B.2.2點(diǎn)樣馬鈴薯健康組織研磨液陰性對(duì)照和包被緩沖液空白對(duì)照。加樣完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室B.2.3洗板在每個(gè)反應(yīng)孔加滿洗滌液，迅速倒出，再加滿洗滌液，靜置3min后將洗滌液迅速倒出。重復(fù)3次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中殘留液體。B.3結(jié)合酶標(biāo)抗體B.3.1加酶標(biāo)抗體B.4顯色7DB51/T1203—2011B.5終止反應(yīng)8(資料性附錄)C.1包被抗體C.1.1包被向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入100μL用包被緩沖液稀釋的PVS捕捉抗體，將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室溫孵育4h或4℃冰箱過(guò)夜。C.1.2洗板向每個(gè)反應(yīng)孔中加入200μL洗滌液，迅速倒出，重復(fù)2次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中殘留液體。C.2.1樣品制備將待測(cè)樣品剪碎，取0.3g于研缽中，加入1mL樣品提取液充分研磨后，再加入2mL樣品提取液充分研磨至均勻。剩余樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)洳?，在制樣時(shí)應(yīng)注意防止樣品的交叉污染。C.2.2點(diǎn)樣用微量進(jìn)樣器將制備好的樣品加入酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)，每個(gè)樣品三次重復(fù)，每孔100μL。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、馬鈴薯健康組織研磨液陰性對(duì)照和包被緩沖液空白對(duì)照。加樣完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室溫孵育2h或4℃冰箱12h。C.2.3洗板在每個(gè)反應(yīng)孔加滿洗滌液，迅速倒出，再加滿洗滌液，靜置3min后將洗滌液迅速倒出。重復(fù)3次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中殘留液體。C.3結(jié)合酶標(biāo)抗體C.3.1加酶標(biāo)抗體向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入100μL用PVS酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液按比例稀釋的酶標(biāo)抗體溶液。置于保濕容器中室溫孵育2h。C.4顯色每孔加入100μL底物溶液。25℃避光孵育30min～60min,至陽(yáng)性對(duì)照顯色。9DB51/T1203—2011C.5終止反應(yīng)DB51/T1203—2011(資料性附錄)馬鈴薯M病毒RT-PCR檢驗(yàn)程序D.1PVM模板RNA的制備采用TIANGENRNAprepPlantKit試劑盒(給出該試劑盒信息是為了方便標(biāo)準(zhǔn)使用者，如果等效產(chǎn)品具有相同效果，則可使用這些等效產(chǎn)品)提取馬鈴薯卷葉病毒RNA。稱取50mg~100mg的馬鈴薯葉片或莖桿(薯塊需經(jīng)發(fā)芽后切取幼芽),在液氮中迅速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移粉末至預(yù)冷的1.5mL的EP管中，加入500μL的RL裂解液(使用前按RL裂解液1mL加入2-巰基乙醇10μL),渦旋劇烈震蕩5min使其混的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。緩慢加入上清液0.5倍體積無(wú)水乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入CR吸附柱中，12000rpm離心1min,棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入700μL去蛋白液RW1,12000rpm離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500μL漂洗液RW,12000rpm離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)漂洗一次。漂洗完后，將吸附柱在12000rpm離心2min,,去除殘余液體，并在室溫下放置片刻。將吸D.2RT-PCR擴(kuò)增D.2.1反轉(zhuǎn)錄D.2.1.1反應(yīng)體系RT反應(yīng)體系見(jiàn)表D.1。表D.1馬鈴薯M病毒RT反應(yīng)體系反應(yīng)物模板RNAP2RNasinRTEhancer5×RTbufferMMLV無(wú)RNA酶的加入量(μL)41D.2.1.2程序反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?