微生物學檢驗實驗指導手冊

微生物學檢驗實驗指導

一、《微生物學檢驗》實驗目的要求

1.通過實驗驗證理論知識，并掌握比較全面的微生物學基本操作技術。

2.在微生物學實驗過程中建立無菌觀念，掌握無菌操作技術。

3.通過實驗進一步掌握臨床常見病原微生物的生物學性狀、分離培養(yǎng)和鑒定的方

法、各種臨床標本的微生物學檢驗程序和方法。

4.在實驗過程中逐漸培養(yǎng)獨立思考問題、分析問題和解決問題的能力。

二、微生物學實驗室規(guī)則及實驗室意外處理方法

1.微生物學實驗室規(guī)則

由于微生物學實驗是以病原微生物為研究對象,在實驗過程中任何疏忽大意都有可

能引起實驗人員的自身感染或?qū)嶒炇液椭車h(huán)境的污染。因此，實驗中應嚴格遵守實驗

規(guī)則，建立無菌觀念，嚴格無菌操作，防止丈驗過程中出現(xiàn)意外情況，并確保變驗結(jié)果

的準確。

（1）試驗前須預習實驗內(nèi)容，了解實驗目的、方法和注意事項，做到心中有數(shù)，

避免發(fā)生錯誤，提高實驗效率。

（2）進入實驗室必須穿工作服，必要時還須戴口罩、帽子和手套，并做好實驗前

的各項準備工作。

（3）非必需物品禁止帶入實驗室，帶入實驗室的物品應遠離操作區(qū)，放在指定的

區(qū)域。

（4）實驗室內(nèi)不準大聲喧嘩、嬉戲，應保持實驗室的安靜、整潔和有序。不準在

實驗室內(nèi)吸煙、飲水和進食，盡量避免用手觸摸頭、面部，防止感染，盡量減少室內(nèi)活

動，以免引起風動。

（5）實驗中注意節(jié)約試劑，愛護儀器，避免有菌材料的污染，如有傳染性材料污

染桌面、地面、手、衣服或發(fā)生其他意外情況，應立即報告老師及時作適當處理。

（6）用過的污染物品應放到指定的地點，經(jīng)專人消毒滅菌之后再進行清洗，切勿

亂丟或沖入水池中。禁止將本實驗室的物品帶出實驗室外。需送溫箱培養(yǎng)的物品，應標

記清楚后送到指定地點。

（7）實驗完畢后應將桌面整理清潔，試劑、儀器放回原處，并用浸有消毒液的抹

布將操作臺擦拭干凈，打掃衛(wèi)生，關好水、電、門窗。

（8）離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2%來蘇液中浸泡5min

左右，再用肥皂、清水洗凈，方可離開實驗室。

2.實驗室意外的緊急處理方法

(1)發(fā)生皮膚破損或刺傷：首先用肥皂和水沖洗傷口，盡量擠出損傷處的血液，

并用7()%乙醇或其他皮膚消毒劑進行消毒，立即進行醫(yī)療處理。

(2)化學藥品腐蝕傷：若為強酸，用大量清水沖洗后再以5%碳酸氫鈉溶液中和;

若為強堿，用大量清水沖洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受傷處是眼部，經(jīng)

上述方法處理后，再滴入橄欖油或液體石蠟1~2滴。

(3)燒傷：局部涂凡士林、5%鞅酸或2%苦味酸。

(4)菌液誤入口中：立即將菌液吐入消毒容器中，再用1：1000高鎰酸鉀或3%

過氧化氫漱口，根據(jù)菌種服用適當抗生素預防感染。

(5)菌液污染環(huán)境:將適量2~3%來蘇或0.1%新潔爾滅浸泡污染面半小時后除去,

如手上有菌污染，也可浸泡于上述消毒液中3~5min,之后用肥皂和清水洗凈。

三、生物安全防護知識簡介

醫(yī)學檢驗工作人員長期接觸有潛在傳染性的血液、糞便、體液等標本，這些標本往

往是各種細菌、病毒等病原微生物的傳播載體，無論是實驗人員感染，還是造成實驗室

和周I韋I環(huán)境的污染，都將導致嚴重的后果。因此實驗室工作人員在實驗過程中必須高度

重視實驗室生物安全防護，強化生物安全意識，熟悉生物安全防護有關知識，嚴格無菌

操作。

1.微生物的分類等級

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)出版的《實驗室生物安全手冊》，將微生物分為四個

不同危險度等級：危險度1級是指不能引起人或動物致病的微生物，此類微生物無或僅

具有極低的個體和群體危檢；危險度2級的病原體具有中度個體危險，低度群體危險，

能引起人或動物致病，但對實驗室工作人員、社區(qū)、家畜或環(huán)境不易導致嚴重危害，所

引起的感染具有有效的預防和治療措施，并且疾病傳播的危險有限；危險度3級的病原

體具有高度個體危險，低度群體危險，通常能引起人或動物的嚴重疾病，但一般不會發(fā)

生感染的播散，并且對感染具有有效的預防和治療措施；危險度4級的病原體具有高度

的個體危險和群體危險，通常能引起人或生物的嚴重疾病，并且很容易發(fā)生個體之間的

直接或間接傳播，對感染一般沒有有效的預防和治療措施。

基于以上劃分標準，結(jié)合微生物的致病性、傳播方式、目前所具有的預防和治療

措施等因素，我國衛(wèi)生部于2006年制定了《人間傳染的病原微生物名錄》，對各種病

原微生物的危害程度及其相關實驗活動需要達到的生物安全實驗室級別做了詳細分類，

各實驗室進行有關實驗均需參照此標準。

2.生物安全實驗室分級與要求

由于各種病原微生物的危險度等級不同，因此實驗室必須達到相應的生物防護等

級才能開展有關實驗。根據(jù)WHO《實驗室生物安全手冊》和我國衛(wèi)生部2002年頒布

的《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》，實驗室從生物安全防護的角度共分

為四級：一級生物安全防護實驗室（BSL-1）為實驗室結(jié)構(gòu)設施、安全操作規(guī)程、安全

設備適用于危險度1級的微生物，依據(jù)標準操作程序可進行開放性操作，如用于教學的

普通微生物實驗室即屬此類。二級生物安全防護實驗室（BSL-2）適用于對人或環(huán)境具

有中等潛在危害的微生物，即危險度2級的病原體，該級別實驗室應具備生物安全柜和

密封的離心管，以免發(fā)生泄漏和產(chǎn)生氣溶膠。三級生物安全防護實驗室（BSL-3）適用

于有明顯危害、可以通過空氣傳播的病原微生物（婦結(jié)核桿菌、伯氏立克次體等），通

常已有預防傳染的疫苗，該級別實驗室除了有嚴格的一級和二級安全設施要求外，還需

具備合適的空氣凈化系統(tǒng)。四級生物安全防護實驗室（BSL-4）適用于對人體具有高度

的危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致

病微生物及其毒素。BSL-4實驗室必須與其他實驗室隔離，并具備特殊的空氣和廢物處

理系統(tǒng)，實驗操作須在IH級生物安全柜內(nèi)或全身穿戴特制的正壓防護服。

根據(jù)以上定義，醫(yī)院內(nèi)的臨床實驗室因接觸可能含有致病微生物的標本，通常應

達到二級生物安全防護實驗室要求。根據(jù)《實驗室生物安全認可準則》，二級生物安全

實驗室結(jié)構(gòu)設施需符合以下兒點：（1）實驗室需具有防止節(jié)肢動物和嚙齒動物進入的設

計，有可開啟的窗戶，有紗窗，實驗室門有可視窗帶鎖并能自動關閉。（2）每個實驗室

均應設置洗手池，宜設置在靠近出口處。（3）實驗室工作區(qū)域外有足夠的存儲空間及擺

放個人衣物的設施。（4）實驗室內(nèi)墻壁、地面應平整、防滑、易于清潔，不適宜用地毯。

（5）實驗臺面應能防水、耐腐蝕、耐熱。（6）實驗室內(nèi)應保證工作照明，避免反光和

強光。（7）在實驗室內(nèi)應穿戴隔離衣、帽、手套，必要時戴防護眼鏡。實驗室應備有生

物安全柜。（8）有適當?shù)南驹O施，如高壓蒸汽滅菌器，并設置洗眼裝置、應急噴淋裝

置、急救藥箱、滅火器等。（9）有可靠的電力供應和應急照明。（10）在實驗室出口處

設有在黑暗中可明確辨認方向、通道的標識。（11）在實驗室入口處和裝有傳染性物質(zhì)

的設備表面貼有生物危險標志。

3.實驗室生物安全管理制度

實驗室生物安全制度建設對于臨床實驗室而言是生物安全防護的核心，實驗室生

物安全管理制度應包括?：實驗室準入制度、生物安全培訓制度、生物安全責任制和責任

追究制度、生物防護與安全制度、安全檢查制度、個人防護制度、實驗室管理制度、清

潔消毒制度、安全計劃審核制度、廢棄物處理制度、事故報告制度、生物安全防護應急

預案、標準操作程序等。

建立健全了各項生物安全制度，還應成立生物安全管理領導小組，加強生物安全

制度實施情況的監(jiān)督管理，實驗室入口處須粘貼生物安全標志，注明危險因素，生物安

全級別，負責人姓名和電話，進入實驗室的特殊要求及離開程序，禁止非工作人員進入

實驗室，如需參觀實驗室等特殊行為需經(jīng)實驗室負責人的批準后方可進入。

4.實驗室常見生物危險

實驗室生物污染的途徑包括：空氣傳播（臨床標本中的污染源在空氣中傳播、微生

物氣溶膠的吸入）、直接轉(zhuǎn)播（工作中偶然刺傷、割傷，碎玻璃劃傷直接感染）、皮膚

粘膜接觸（臨床標本中的傳染源通過破損皮膚粘膜接觸造成的感染）、其他不明原因的

實驗室相關感染。

實驗室傷害以及與工作有關的感染主要是由于人為失誤、不良實驗技術以及儀器

使用不當造成的。因此，實驗室人員必須提高生物安全意識，認真學習生物安全相關的

各種法規(guī)和文件，定期進行生物安全防護知識培訓，熟悉生物防護有關知識，加強基本

技能的培養(yǎng)，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程。實驗室管理者應對實驗室的風險級別進行分析，尤其

對風險級別較高的、接觸高危標本幾率較大的區(qū)域如微生物和分子生物學室予以高度重

視，保護實驗室工作人員和環(huán)境的安全。

5.生物廢棄材料的管理

實驗室內(nèi)所有用過的樣本、培養(yǎng)物及其他生物性材料等廢棄物，嚴禁未經(jīng)處理就隨

意丟棄，應置于貼有生物危害標志的專用廢棄物處理容器內(nèi)，注意容器的充滿量不能超

過其設計容量，利器（如針頭、小刀、玻璃等）應置于耐扎銳器盒內(nèi)，在去污染或最終

處置前應存放在指定的安全地方，經(jīng)過高壓滅菌或其他無害化處理后再安全運出實驗

室；有害氣體、氣溶膠、污水、廢液等均需經(jīng)無害化處理后排放；動物尸體、組織的處

置和焚化應符合國家相關要求。處理危險廢棄物的人員需經(jīng)過專'業(yè)培訓，并使用適當?shù)?/p>

防護設備。

第一章微生物學檢驗基本技術

實驗一細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及顯微鏡油鏡的使用

【目的和要求】

1,熟悉微生物實驗室規(guī)則并自覺遵守。

2.掌握細菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)的觀察方法。

3.掌握光學顯微鏡油鏡的使用和維護方法，了解熒光顯微鏡和暗視野顯微鏡的構(gòu)

造和使用方法。

【試劑與器材】

1.示教片：各種球菌、桿菌、弧菌、莢膜、鞭毛、芽胞的示教片。

2.器材及其他：光學顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、香柏油、脫油劑等。

【實驗內(nèi)容】

一、細菌基本形態(tài)和特殊構(gòu)造的觀察

1.細菌的基本形態(tài)（各種球菌、桿菌、弧菌等）

觀察要點：注意細菌的染色性、相對大小、形狀及排列方式。

2.特殊結(jié)構(gòu)的觀察［莢膜、芽胞、鞭毛）

觀察要點：注意這些特殊結(jié)構(gòu)的大小、形狀及其在菌體中的位置，均有助于細菌的

鑒定。

二、光學顯微鏡油鏡的使用

1.光學顯微鏡的構(gòu)迨

光學顯微鏡是觀察細菌形態(tài)最常用的種儀器，其構(gòu)造分為機械部分和光學部分，

機械部分包括：鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、鏡頭轉(zhuǎn)換器、調(diào)焦裝置等；光學部分包括:

接物鏡、接目鏡、反光鏡、聚光器、光圈等（見圖l-l）o

,■東雙?

圖1-1光學顯微鏡的構(gòu)造

顯微鏡的接物鏡有低倍鏡、高倍鏡、油鏡三種，放大倍數(shù)依次增高，其識別方法為:

（1）低倍鏡：鏡頭標志為10x或10/0.25,鏡頭最短，其上?？逃悬S色環(huán)圈。

（2）高倍鏡：鏡頭標志為40x或40/0.65,鏡頭較長，其上?？逃兴{色環(huán)圈。

（3）油鏡:鏡頭標志為100x或100/1.30,鏡頭最長,其上?？逃邪咨h(huán)圈,或“oil”

字樣。

2.油鏡的使用原理

圖1-2顯微鏡油鏡的使用原理

油鏡的放大倍數(shù)高而透鏡很小，自標本片透過的光線，因玻片和空氣的折光率不同

（玻璃n=1.52,空氣n=1.0）,部分光線經(jīng)載玻片進入空氣后發(fā)生折射，不能進入接物

鏡，致使射入光線較少，物象不清晰。在油鏡和載玻片之間滴加和玻璃折光率相近的香

柏油（n-1.515）,則使進入油鏡的光線增多，視野光亮度增強，物象清晰（見圖1-2）。

3.使用方法

（1）采光：使用顯微鏡時必須端坐，將顯微鏡放在胸前適當位置。將低倍鏡轉(zhuǎn)到

中央并對準下面的聚光器，打開光圈，轉(zhuǎn)動反光鏡，使光線集中于聚光器（以燈光為光

源時，使用凹面反光鏡，以自然光為光源時用平面反光鏡）。根據(jù)所觀察的標本，通過

升降聚光器和縮放光圈以獲得最佳光度。當用低倍鏡或高倍鏡觀察時，應適當縮小光圈，

下降聚光器；當用油鏡觀察時，光線宜強，應把光圈完全打開，并將聚光器上升到最高

位置。

（2）低倍鏡調(diào)焦：將欲觀察的標本置載物臺上，用彈簧夾和推進器固定，將待檢

部位移至視野正中央，上升載物臺至不能升高為止。用左眼觀察接目鏡，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)

節(jié)器，使載物臺下降，待看到模糊的圖像時，再調(diào)節(jié)細調(diào)節(jié)器，直至看到清晰的圖像為

止。

（3）油鏡的使用：低倍鏡找到物象并調(diào)至清晰之后，轉(zhuǎn)開物鏡頭，在玻片的標本

上滴加1滴香柏油，將油鏡頭轉(zhuǎn)換至中央，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使鏡頭浸入油中，當油

鏡頭幾乎接觸玻片時停止轉(zhuǎn)動（從側(cè)面觀察），邊觀察接目鏡邊輕輕轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器（此

時只能上升鏡頭，不能下降，防止壓壞玻片及損壞物鏡），待看到模糊物象時改調(diào)細調(diào)

節(jié)器，直至找到清晰物象。

鏡檢時應將標本按一定方向呈“弓”形移動，直至整個標本觀察完畢，以防漏檢。觀

察時應將兩只眼睛同時睜開，左眼觀察，右眼用于繪圖或記錄。標本觀察完畢后，先將

物鏡頭移開，再轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使載物臺下降，取下載玻片，立即用擦鏡紙將鏡頭上的香

柏油擦凈。

4.注意事項

（1）顯微鏡是精密光學儀器，在搬放時應右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，平端在

胸前，輕拿輕放。

（2）顯微鏡放到實驗臺上時，先放鏡座的一端，再將鏡座全部放穩(wěn)，切不可使鏡

座全面同時與臺面接觸，這樣震動過大，透鏡和微調(diào)節(jié)器的裝置易損壞。

（3）避免強酸、強堿、氯仿、乙醛、酒精等化學藥品與顯微鏡接觸，避免日光直

射，顯微鏡須經(jīng)常保持清潔，勿使油污和灰塵附著。

（4）接目鏡和接物鏡不要隨便卸下，必須抽取接目鏡時，須將鏡筒上口用布遮蓋,

避免灰塵落入鏡筒內(nèi)。更換接物鏡時，卸下后應倒置在清潔的臺面上，并隨即裝入木箱

的置放接物鏡的管內(nèi)。

（5）細調(diào)節(jié)器是顯微鏡最精細而脆弱的部分，不要向一個方向連續(xù)轉(zhuǎn)動數(shù)周，應

輕微地來回旋轉(zhuǎn)。

（6）鏡頭必須保持涓潔，油鏡使用完后應立即用擦鏡紙拭去香柏油。若油鏡鏡頭

上的油跡木擦干凈，應先將1:1醒醴混合液或二甲茶滴在擦鏡紙上擦拭鏡頭，再用干凈

擦鏡紙將鏡頭上殘留的醇縫混合液或二甲苯擦凈。

（7）顯微鏡擦凈后，取下標本片，下降聚光器，再將物鏡轉(zhuǎn)成"品”字形，送至顯

微鏡室放入鏡箱內(nèi)。

三、暗視野顯微鏡

1.構(gòu)造與原理：在顯微鏡上安裝一個特制的聚光器一暗視野聚光器。此聚光器中

央為一黑板所遮，光線不能直接通向鏡筒，使視野背景黑喑。這樣，從聚光器周邊斜射

到載玻片上細菌等微粒上的光線，就因散射作用而發(fā)出亮光，反射到鏡筒內(nèi)。故在強光

照射下，可在黑色的背景中看到發(fā)亮的菌體。正如我們在暗室內(nèi)，能看到從隙縫漏入的

陽光內(nèi)，有無數(shù)顆塵埃微粒跳躍飛舞一樣。

2.使用方法：

（1）將顯微鏡聚光器御下，裝上暗視野聚光器，置暗室，使用人工光源。

（2）先用低倍物鏡觀察，調(diào)節(jié)光環(huán)置中央后，在暗視野聚光器表面滴上香柏油（或

水），再將標本夾在移動尺上。

（3）調(diào)節(jié)暗視野聚光器，使之油滴（或水滴）與鏡臺上的載玻片底面接觸，

（4）其余操作同光學顯微鏡。

四、熒光顯微鏡

1.構(gòu)造：

（I）熒光顯微鏡光源：能發(fā)射豐富的紫外線光和紫蘭光，常用15（）~200瓦高壓汞

燈。

（2）濾光片：

1）激發(fā)濾光片裝于光源與聚光器之問，可選擇性使紫外光及紫蘭光通過，激發(fā)熒

光素發(fā)出熒光；

2）吸收濾光片裝于物鏡與目鏡之間，可吸收紫外光及紫蘭光，僅讓熒光通過，以

便觀察標本和保護眼睛。

2.熒光顯微鏡的使用方法：

（1）將熒光顯微鏡置暗室，開啟光源，待光源穩(wěn)定并達到一定亮度（約5~10min）

后，對準光軸。

（2）裝好配對的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察。操作同光學顯微鏡。

3.注意事項

（1）熒光顯微鏡如用高壓汞燈作光源，使用時一經(jīng)開啟不宜中斷，斷電后需待汞

燈冷卻后（約15min）方能再啟用。

（2）使用熒光顯微鏡觀察標本時間不宜太長.因標本在高壓汞燈下照射超過3min,

即有熒光減弱現(xiàn)象。

【結(jié)果記錄和報告】

實驗二細菌的形態(tài)學檢查

【目的和要求】

1.熟悉細菌染色的常用染料和一般程序。

2.掌握革蘭染色的方法、原理、結(jié)果觀察及意義。

3.熟悉不染色標本檢查法（壓滴法和懸滴法）的方法與結(jié)果觀察。

4.熟悉細菌的特殊染色法。

【試劑與器材】

1.菌種：葡萄球菌、大腸埃希菌。

2.試劑：革蘭染色液、細胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理鹽水等。

3.其他：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、香柏油、蠟筆、擦鏡紙、脫油劑等。

【實驗內(nèi)容】

一、細菌染色的一般程序

細菌染色法分單染法和復染法。單染法是用一種染料去染，所有細菌都染成一種顏

色；復染法是用多種染料對細菌進行染色，不同細函可染成不同的顏色。

大部分細菌染色的基本程序相同，即：涂片一干燥—固定-染色，根據(jù)實驗目的選

擇不同的染色方法，在實際工作中，應用最廣泛的是革蘭染色法。

二、革蘭染色

1.染色原理

（1）等電點學說：革蘭陽性菌的等電點（“2?3）比革蘭陰性菌（pI4?5）低，

在同一pH條件下革蘭陽性菌帶負電荷比革蘭陰性菌要多，與帶正電荷的堿性染料（結(jié)

晶紫）結(jié)合性牢固，不易脫色。

（2）化學學說：革蘭陽性菌含有大量的核糖核酸鎂鹽，與進入胞漿內(nèi)的結(jié)晶紫和

碘牢固結(jié)合成大分子復合物，不易被95%酒精脫色；而革蘭陰性菌含此種物質(zhì)少，故

易被乙醇脫色。

（3）通透性學說：革蘭陽性菌細胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層較厚，含脂質(zhì)少，脫

色時，乙醇不易進入，而且95%乙醇可使細胞壁脫水，細胞壁間隙縮小，通透性降低,

阻礙結(jié)晶紫和碘復合物滲出。而革蘭陰性菌細胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層較薄，含脂質(zhì)

多，易被乙醇溶解，致使細胞壁通透性增高，細胞內(nèi)的結(jié)晶紫與碘無合物易被溶出而脫

色。

2.方法

（1）涂片：取清潔無油跡的載玻片1張，用蠟筆劃線將其分成左右兩格。用接種

環(huán)先挑取生理鹽水1?2環(huán)于載玻片每格中央,再分別挑取大腸桿菌和葡萄球菌少許菌落

與生理鹽水研勻，涂成直徑約1.5cm的菌膜。

（2）干燥：讓涂片自然干燥，也可在酒精燈火焰較遠處微微加熱烘干，但切勿靠

近火焰。

（3）固定：干燥后的標本片在酒精燈火焰上來回通過3次（以鐘擺的速度），冷卻

后染色。固定的目的在于殺死細菌，并使菌膜與玻片牢固粘附，避免染色過程中被水沖

洗掉，通過固定還可凝固細胞質(zhì)，改變細菌對染料的通透性，使細菌易與染料結(jié)合而著

色。

（4）染色：分以下四步：

Imin.水洗Imin,水洗Z勺0.5min,水洗0.5min.水洗

結(jié)晶紫〔-----?!盧戈碘液|------由5%乙醉I---------M稀釋石炭酸復玩|-----麻午干、鏡檢

（初染）（媒染）（脫色）（復染）

3.結(jié)果：革蘭陽性菌染成紫色；革蘭陰性菌染成紅色。

4.注意事項：

（1）涂片厚薄要適宜，以菌膜剛好能透過字跡為宜（半透明）。如果涂片太厚有可

能將革蘭陰性菌染成紫色，涂片太薄則可能將革蘭陽性菌染成紅色。

（2）脫色時間長短要適宜，如果涂片較厚應相應的延長脫色時間，如涂片較薄則

相應的縮短脫色時間，脫色時應不斷旋轉(zhuǎn)玻片搖勻，使其充分脫色，通常脫到乙醇中沒

有紫色流下即可。

（3）水洗時，水流不能過大，防止水流直接對準菌膜沖洗。

（4）所有染液應防止因蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后失去

媒染作用；涂片上積水過多會降低染液濃度，影響染色效果。

（5）因細菌的菌齡不同染色結(jié)果也有差異，一般以18?24h培養(yǎng)物染色結(jié)果最好。

5.醫(yī)學意義：通過革蘭染色有助丁?細菌的初步鑒別，并可作為選擇藥物的參考，

了解細菌的致病性。

三、特殊染色法

細菌的細胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和細菌的特殊結(jié)構(gòu)如芽胞、莢膜、鞭毛等，必須用

相應的特殊染色法才能染上顏色。

1.細胞壁染色法

（1）涂片、干燥：同革蘭染色法。

（2）固定：滴加100g/L糅酸固定標本15min,水洗。

（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5min,水洗，待干、鏡檢。

結(jié)果：有細胞壁的細菌僅菌體周邊染成紫色，成體內(nèi)部無色；無細胞壁的細菌（如

L型細菌）整個菌體都染成紫色。

2.鞭毛染色法（改良Ryu法）

鞭毛染色可從平板上直接挑取菌落，也可從斜面培養(yǎng)基上刮取菌苔涂片，必須注意

動作盡量輕，以免鞭毛脫落。培養(yǎng)基應為營養(yǎng)較好的瓊脂平板（如血平板、營養(yǎng)瓊脂）,

不可用含抑制劑的選擇培養(yǎng)基（如SS、中國藍、MAC等）。

（1）玻片的處理：要求用新的載玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用時從

酒精中取出，用干凈的紗布擦干使用。若水滴向周圍流散而不形成水珠表示玻片處理良

好。

（2）在玻片上加蒸儲水1滴，用接種針蘸取菌落少許，將細菌點在蒸儲水滴的頂

部（一般只需點一下，僅允許極少量細菌進入水滴），使其自然流散成薄膜，不可攪動,

以免鞭毛脫落。

（3）室溫自然干燥，不可在火焰上烘干。

（4）滴加染液（配方見附錄二），染色約10?15min后，將玻片微傾斜，用蒸儲水

緩慢滴加在玻片頂端無菌膜處洗去染液，注意洗凈染液表面的金屬光澤液膜。

（5）玻片自然干燥后鏡檢。觀察時應從細菌較少的地方尋找鞭毛。

結(jié)果：鞭毛染成紅色。

3.芽胞染色法

（1）涂片、干燥、固定：同革蘭染色法。

（2）染色：分為以下三步。

1）初染：在菌膜上加石炭酸復紅染液，用微火加熱使染液冒蒸氣5min,注意不能

煮沸或燒干，加熱過程中應隨時添加染液，冷卻后水洗。

2）脫色：用95%乙醇脫色1?2min,水洗。

3）復染：用堿性美藍染Imin,水洗，待干、鏡檢。

結(jié)果：菌體呈藍色，芽胞染成紅色。

4.莢膜染色法

（1）黑斯氏法

1）涂片，自然干燥，加熱固定。

2）滴加結(jié)晶紫染液，在火焰上微微加熱至染液冒蒸氣為止。

3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水紙吸干后鏡檢。

結(jié)果：菌體及背景均染成紫色，莢膜染成淡紫色或無色。

（2）密爾氏法

1）涂片.：提前數(shù)日于小鼠腹腔注射肺炎鏈球菌0.2ml,小鼠死亡后取腹腔液印片，

自然干燥，加熱固定。

2）滴加石炭酸復紅染液，微火加熱染色Imin,水洗。

3）加媒染劑染0.5min,水洗。

4）加堿性美藍染色Imin,水洗，待干，鏡檢。

結(jié)果：菌體染成鮮紅色，莢膜染成藍色。

5.異染顆粒染色

細菌經(jīng)涂片、干燥、固定，加甲液（見附錄二）染色3?5min,水洗后加乙液染色

1min,水洗，待干、鏡檢。

結(jié)果：菌體染成藍綠色，異染顆粒染成藍黑色。

四、不染色標本檢查法

細菌未經(jīng)過染色呈無色透明，在顯微鏡下為有折光性的小點，不能判斷細菌的形態(tài)

和結(jié)構(gòu)特征。因此，不染色標本檢查法主要用于觀察細菌的動力，常用的方法有以下幾

種。

1.壓滴法

用接種環(huán)分別取菌液2?3環(huán)，置于潔凈裁玻片中央。用小鎮(zhèn)子挾一蓋玻片，先使

蓋玻片一邊接觸菌液，然后緩緩放下，覆蓋于菌液上，避免菌液中產(chǎn)生氣泡。先用低倍

鏡找到觀察部位，再換高倍鏡觀察細菌的運動。

2.懸滴法

取一潔凈凹玻片，在凹窩四周涂少許凡士林。取一環(huán)菌液于蓋玻片中央，將凹玻片

凹窩對準蓋玻片上的菌液，迅速翻轉(zhuǎn)教玻片，用小銀子輕壓蓋玻片，使之與凹玻片粘緊

封閉（見圖2-1）,置顯微鏡下觀察。

圖2-1懸滴法

3.暗視野顯微鏡觀察

將上述經(jīng)壓滴法制成的標本片，置于暗視野顯微鏡下觀察，有鞭毛的細菌運動活潑,

在黑色的背景下閃閃發(fā)亮，有明顯的位置移動。

觀察要點：有鞭毛的細菌運動活潑，可向不同方向迅速運動，位置移動明顯。無鞭

毛細菌不能做真正的運動，但受水分子的撞擊而呈分子運動（布朗運動），即在一定范

圍內(nèi)作來回顫動，位置移動不大，注意與細菌的鞭毛運動相鑒別。

【結(jié)果記錄和報告】

實驗三滅菌前的準備與基礎培養(yǎng)基的制備

【目的和要求】

1.熟悉常用玻璃器皿的清洗、滅菌前的包裝準備。

2.熟悉培養(yǎng)基的種類、主要成分及用途。

3.掌握基礎培養(yǎng)基的制備程序、方法和注意事項。

【試劑與器材】

1.試劑：牛肉膏、蛋白陳、氯化鈉、瓊脂粉、Imol/LNaOH、Imol/LHCl等。

2.器材：試管、吸管、平皿、錐形瓶、量筒、吸管、精密PH試紙、天平、濾紙

等。

【實驗內(nèi)容】

一、常用玻璃器材的洗滌和準備

1.玻璃器材的洗滌

玻璃器材若不清潔，?？捎绊憣嶒灲Y(jié)果，如影響培養(yǎng)基的pH值，甚至由于某些化

學物質(zhì)的存在可抑制微生物的生長；試管不清潔也可影響血清學反應的結(jié)果，如在pH<3

時可發(fā)生酸凝集。因此，微生物實驗所用的各種玻璃器材必須清洗干凈后才能使用。

（1）新的玻璃器材：

先用肥皂水煮沸半小時，再用自來水沖洗多次，晾干水后浸于2%HC1內(nèi)數(shù)小時，

將游離的雜質(zhì)除去，最后用自來水反復沖洗除盡殘余HC1后，晾干備用。

（2）用過的玻璃器材：

1）凡含有培養(yǎng)基或病原微生物的玻璃器材，均應先用煮沸或高壓蒸汽滅菌法滅菌,

然后趁熱倒山培養(yǎng)基，用5%肥皂水刷洗，再用自來水沖凈后倒置架上，晾干備用。

2）試管：作血清反應的試管若不含病原微生物，可先用5%熱肥皂水刷洗，再用

自來水沖洗；若不夠清潔，可先用清潔液（配制法見附錄二）浸泡數(shù)小時，然后用自來

水沖洗7次以上，晾干備用。

3）吸管：吸過病原微生物的吸管，應插入盛有消毒液（3?5%來蘇）的玻璃筒中（筒

底應墊紗布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液蓋過吸管，浸泡24h后，用5%肥皂

水洗滌，再用自來水沖洗（若無病原微生物污染，則可用自來水浸泡或直接用自來水沖

洗），晾干水后，用清潔液浸泡數(shù)小時，最后用自來水沖洗7次以上，隙干備用。

4）載玻片及蓋玻片：用后分別浸入3?5%的來蘇液中，浸泡24h后，用5%肥皂水

煮沸l(wèi)（）min,再用自來水沖洗，晾干后于清潔液中浸泡數(shù)小時，最后用自來水洗凈，晾

干備用。

5）注射器：用后若無病原微生物污染，立即用自來水將注射器及針頭等抽洗干凈;

若有病原微生物污染，則立即進行煮沸消毒（含有芽胞菌，則應用高壓蒸汽滅菌）。在

消毒或滅菌之前，均應先將清水抽入針頭及注射器內(nèi)反復抽洗幾次，并連同洗出水一起

消毒或滅菌，以免加熱時有蛋白質(zhì)凝固而阻塞針頭或注射器。若用上述方法不能洗凈，

可再置清潔液中浸泡數(shù)小時（針頭不能用清潔液泡），取出用自來水沖洗7次以上，干

燥后備用。

2.常用無菌器材的準備

（1）包裝

1）平皿：用紙包好，或盛入金屬盒內(nèi)。

2）試管和錐形瓶：空的或盛有培養(yǎng)基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚紙包于

棉塞外。若是盛有液體培養(yǎng)基的試管，應直立并扎成捆，以免滅菌時傾倒。

3）吸管：于吸口端先墊入少許棉花（不可太松或太緊），然后每支分別用紙包好，

或以數(shù)支放入金屬筒內(nèi)。

4）注射器：最好將內(nèi)芯取出，與外套一起用紙或紗布包好；針頭最好裝入小試管

內(nèi)（管底墊有少量棉花），管口塞上棉塞。

（2）滅菌

上述玻璃器材可用高壓蒸汽滅菌法，也可用干烤法進行滅菌。如用干烤法應注意控

制溫度和時間在16（）?17（）C2h,以免燒焦棉塞及外包的紙張等。

注意：任何已滅菌的器材。在使用前不能隨意打開，一經(jīng)打開則不再認為是無菌的。

二、基礎培養(yǎng)基的制備程序和方法

培養(yǎng)基是用人工方法將細菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)按一定比例配制而成的營養(yǎng)基

質(zhì)。按照物理性狀分為：液體、半固體和固體培養(yǎng)基三類，其區(qū)別主要是凝固劑的有無

和多少；按用途分為：基礎、營養(yǎng)、選擇、鑒別、增菌、特殊培養(yǎng)基等。

培養(yǎng)基的成分因種類不同而異，其中基礎培養(yǎng)基含有般細菌生K所需耍的基本營

養(yǎng)成分，如：蛋白陳、肉浸液（或牛肉膏）、氯化鈉和水，這些營養(yǎng)物質(zhì)能為細菌提供

生命所需的碳源、氮源、無機鹽、水分，并能調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外的滲透壓，為細菌提供能量。

其他培養(yǎng)基大多是在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊成分（如：營養(yǎng)物質(zhì)、抑菌劑、檢測基

質(zhì)、指示劑等）配制而成。

1.培養(yǎng)基配制的基本程序

包括：調(diào)配、溶化、矯正pH、過濾澄清、分裝、滅菌、鑒定等幾個主要步驟。

（1）調(diào)配：先在錐形瓶或燒杯2加入少量蒸翎水（事先量好），按照培養(yǎng)基的配方

準確稱取各種成分加入瓶中混合，再將剩余的水沖洗瓶壁。

（2）溶化：將調(diào)配好的混合物置電爐上隔水加熱，使其完全溶解，注意隨時攪拌,

防止溶液外溢，溶解完畢，應補足失去的水分。

（3）矯正PH：用PH比色計、比色法或精密PH試紙矯正溶液的PH,一般矯正

至7.2?7.6左右。其中PH試紙矯正法操作簡便，快速，但誤差較大；用PH匕色計和

比色法測定PH較為準確，后者無需特殊儀器。

比色法：取3支與標準管口徑相同的試管，按下表加樣。

試管號培養(yǎng)基蒸儲水0.2g/L酚紅

1（測試管）5ml—0.25ml

2（蒸儲水管）—5ml—

3（培養(yǎng)基管）5ml——

第4管為標準PH比色管（配方見附錄二）。

將4支試管按圖3-1所示插入比色架中進行比色。

①0

③①

_______I_______________目測方向

圖3-1比色法

若測定管偏酸或偏堿，可分別加入O.lmol/LNaOH、0.1mol/LHC1矯正，直到測定

管的顏色與標準管相同為止，注意：在加酸或加堿矯正時要緩慢，并準確記錄加入的量，

按下式計算培養(yǎng)基中需加入的量。

計算：設5ml培養(yǎng)基矯正PH至7.4需加入0.15mlNaOH,現(xiàn)配制1000ml培養(yǎng)基,

需加入NuOH的量為：

5：1000=0.15：X,則X=（0.15x1000）/5=30ml

為防止培養(yǎng)基因矯正PH而加入過多的水，可將0.1mol/LNaOH換算成lmol/L

NaOH,則需3ml。在培養(yǎng)基中加入NaOH后需再測一次PH,如仍未達到所需PH,再

按上述方法進行矯正。

（4）過濾澄清若培養(yǎng)基有混濁或沉淀，則需過濾。液體或半固體培養(yǎng)基用濾紙

過濾，固體培養(yǎng)基在加熱溶化后用絨布或雙層紗布加脫脂棉過濾。

（5）分裝根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同的容器中，并進行包孔。

1）基礎培養(yǎng)基：一般分裝于錐形瓶，滅菌后備用，便于隨時分裝傾注平板或制備

營養(yǎng)培養(yǎng)基。滅菌后的基礎培養(yǎng)基在傾注平板前應冷卻至50℃左右，以無菌操作分裝

于無菌平皿內(nèi)（直徑9cm的平皿分裝量約13?15ml）,待培養(yǎng)基冷卻后將平皿翻轉(zhuǎn)，即

為瓊脂平板。

2）瓊脂斜面：分裝于試管，分裝量約為試管高度的1/4?1/3,滅菌后趁熱放置成斜

面，斜面長度占試管長度的2/3左右，斜面下方保持1cm高。

3）半固體培養(yǎng)基：分裝于試管，量約為試管高度的1/4?1/3,滅菌后趁熱將試管直

立凝固。

4）瓊脂高層培養(yǎng)基：分裝于試管，量為試管高度的2/3,滅菌后趁熱將試管直立凝

固。

（6）滅菌根據(jù)培養(yǎng)基的成分、性質(zhì)采用不同的滅菌方法。

1）高壓蒸汽滅菌法：用于基礎培養(yǎng)基等耐高溫培養(yǎng)基的滅菌。

2）間歇滅菌法：用于含糖、明膠、血清、牛乳、雞蛋等不耐高溫物質(zhì)配制的培養(yǎng)

基滅菌。

3）水浴低溫滅菌法：將血清、腹水、組織液等配制的培養(yǎng)基在水浴中加熱56?57℃

維持lh,以保持液體狀態(tài)，連續(xù)5~7天，此法較少用。

4）血清凝固器滅菌：用于富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基（如含血清、雞蛋清的培養(yǎng)基）滅

菌，方法是：將分裝好的培養(yǎng)基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75°C30min,

第二天80℃30min,第三天85℃30min,在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育過

夜。

5）過濾除菌：用于血清、細胞培養(yǎng)液的滅菌。

（7）鑒定包括兩項內(nèi)容：

1）無菌試驗：將滅前后的培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育24h,無菌生長為合格。

2）效果檢驗：將已知菌種接種于培養(yǎng)基上，觀察細菌的生長情況、生化反應等是

否符合。

（8）保存制備好的培養(yǎng)基需注明制備日期、名稱，置4℃冰箱或冷暗處保存，

但不宜放置過久。

2.常用培養(yǎng)基的配制和用途（見附錄一）

3.培養(yǎng)基配制的注意事項

（1）在進行調(diào)配時應在瓶中先加入少量水，再加入各種固體成分，以免固體成分

粘附在瓶壁上。裝培養(yǎng)基的容器不能用鐵、銅等材質(zhì)的容器，若鐵進入培養(yǎng)基中，含量

超過0.14mg/L時可抑制細菌毒素的產(chǎn)生；含銅量超過O.3mg/L時可抑制細菌的生長。

某些特殊成分（如染料、膽鹽、指示劑等）應在矯正PH后加入。

（2）如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法：取一個雞蛋的卵蛋

白加水20mL攪拌至出現(xiàn)泡沫，倒入1000ml液體或溶化的固體培養(yǎng)基，混勻，流通蒸

汽加熱3（）?6（）min,使培養(yǎng)基中的不溶性物質(zhì)附著于凝固蛋白，取出后用紗布加脫脂棉

（固體培養(yǎng)基）或濾紙（液體或半固體培養(yǎng)基）過濾。

（3）滅菌后的培養(yǎng)基在進行分裝時應注意無菌操作，傾注平板時培養(yǎng)基的溫度不

能過高，否則冷凝水多，影響細菌的分離并易造成污染；也不能溫度過低，否則瓊脂過

早凝固，使平板表面高低不平。

（4）在加熱溶化時注意溶液不能溢出瓶外，否則會影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，若水

分蒸發(fā)，應補足失去的水分。

【結(jié)果記錄和報告】

實驗四細菌的接種培養(yǎng)法與生長現(xiàn)象的觀察

【目的和要求】

1.掌握無菌技術，建立無菌觀念；明確無菌操作時注意要點。

2.掌握細菌的接種、分離培養(yǎng)方法和接種環(huán)的制作方法。

3.熟悉細菌生長現(xiàn)象的觀察方法。

【試劑與器材】

1.菌種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等。

2.培養(yǎng)基：固體、半固體、液體培養(yǎng)基。

3.其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機、記號筆等。

【實驗內(nèi)容】

一、細菌的接種工具

1.接種環(huán)和接種針：其結(jié)構(gòu)包括環(huán)（針）、金屬柄、絕緣柄三部分（見圖4-1）o

其中環(huán)（針）部分最佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且

經(jīng)久耐用，但因為價格昂貴而限制了其應用。目前實驗室常用的是經(jīng)濟費用的

30（）~5（）（）W電熱銀絡絲。一般要求接種環(huán)長5?8cm,直徑為2?4mm,定量接種環(huán)的容

量為0.001ml。

相約22cm

2——5mm

5——8cm觸柄約14.5m鬃2

安裝環(huán)（針）的螺口【約8mm）

圖4-1接種環(huán)和接種針

接種環(huán)（針）在使用之前需檢查銀金各絲是否呈直線，若有彎曲，需用吸管或接種環(huán)

的另一端將其壓直；若環(huán)不圓，可將鍥路絲前端放在吸管尖部纏繞一圈，再將鍥谿絲突

出的部分朝內(nèi)壓緊。

接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。

2.L形玻棒：由直徑2?3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。在使用之前用厚紙包扎

后置高壓蒸汽滅菌，或沾取無水乙醇后在火焰上燒灼滅菌。主要用于液體標本涂布接種。

二、細菌的接種方法

1.液體培養(yǎng)基的接種

該法主要用于細菌的增菌培養(yǎng)或進行細菌的生化反應。

方法：（圖4-2）

（1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許細菌。

（2）左手拿試管，右手持接種環(huán)，用右手其余手指將試管塞打開，試管口通過火

焰燒灼滅菌。

（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數(shù)次，使細菌均勻分布于培養(yǎng)基中。

（4）將試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。

（5）在試管上做好標記，經(jīng)35°。培養(yǎng)18?24h后觀察結(jié)果。

圖4-2液體培養(yǎng)基接種法

2.半固體培養(yǎng)基的接種

該法可用于保存菌種、觀察細菌的動力或進行細菌的生化反應。

方法：（圖4-3）

（1）先將接種針在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。

（2）左手拿試管，右手持接種針，將試管塞打開后，試管口通過火焰滅菌，將接

種針從培養(yǎng)基的中心向下垂直穿刺接種至試管底上方約5mm處（勿穿至管底），然后由

原穿刺線退出，

（3）將試管口滅菌后加塞，接種針燒灼滅菌后放回原處。

（4）在試管上做好標記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18?24h后觀察結(jié)果。

圖4-3半固體培養(yǎng)基接種法

3.平板劃線接種法

該法可將標本中的多種細菌分散成單個菌落，有利于細菌的分純和進一步鑒定。

方法：

（1）連續(xù)劃線法（圖4-4）

1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。

2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在泗精燈旁以拇指、

食指和中指將平板蓋撐開大約30?45。角，將已挑取細菌的接種環(huán)先在平板一側(cè)邊緣均

勻涂布，然后運用腕力將接種環(huán)在平板上自上而下，來回劃線。劃線要密，但不能重疊,

充分利用平板的面積，不能劃破瓊脂表面，并注意無菌操作，避免空氣中的細菌污染。

3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。

4）在平板底上做好標記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。

圖4.4固體培養(yǎng)基連續(xù)劃線法

（2）分區(qū)劃線法（圖4-5）

1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。

2）同上法將平板蓋打開約30?45。角，將已挑取細菌的接種環(huán)在平板一端（1區(qū)）

內(nèi)作來回劃線，再在2、3、4區(qū)依次劃線，每區(qū)的劃線須有數(shù)條線與上區(qū)交叉接觸，每

劃完區(qū)是否需耍燒灼接種環(huán)依標本中的菌量多少而定，每區(qū)線間需保持定距離，線

條要密而不重復。

3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。

4）在平板底上做好標記，經(jīng)35c培養(yǎng)18?24h后觀察結(jié)果。

圖4-5固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法

4.斜面培養(yǎng)基接種法（圖4-6）

斜面培養(yǎng)基主要用于細菌的純培養(yǎng)，以進一步鑒定細菌或保存菌種。

（1）將接種環(huán)（或接種針）在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后以無菌操作挑取少許菌

落。

（2）左手拿試管，打開試管塞后，試管口通過火焰滅菌，再將取有細菌的接種環(huán)

由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作出線劃線。

（3）試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。

（4）在試管上做好標記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18?24h后觀察結(jié)果。

圖4-6斜面培養(yǎng)基接種法

5.涂布接種法

本法主要用于活菌計數(shù)和藥敏試驗。

（1）活菌計數(shù)：取一定稀釋度的菌液0.1ml滴在平板上，用無菌L型玻璃棒將液

滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后計數(shù)菌落，則每亳升所含活菌數(shù)二菌

落數(shù)xlOx稀釋倍數(shù)。

（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗。先配制一定濃度的菌液，用

無菌棉簽蘸取菌液后，在管壁上將多余的液體擠去，在MH瓊脂平板上按三個方向均

勻涂布3次，最后沿平板邊緣涂一周。蓋上平板蓋，置室溫放置5min使平板表面稍干,

然后用無菌鍛子將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，或向豎在平板表面的牛津小杯內(nèi)加入不同

濃度的藥物，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果，測定抑菌圈直徑，按判斷標準判定結(jié)果。

6.傾注培養(yǎng)法

此法常用于標本或樣品中活菌計數(shù)。

（1）方法：

1）將標本用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度:10\IO-'10-3、ICT1、10-5等。

2）取不同稀釋度的標本各1ml分別注入直徑90mm無菌平皿，迅速加入溶化并冷

卻至約5（）℃的營養(yǎng)瓊脂15mL輕輕轉(zhuǎn)動平板使之充分混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平板。

3）置35℃溫箱孵育18?24h,計數(shù)菌落形成單位（colonyformingunit,CFU）,按

下式算出每ml標本中的細菌數(shù)：

1ml標本中的活菌數(shù)=全平板CFUX稀釋倍數(shù)

7.細菌接種的注意事項

（1）細菌接種過程中需注意無菌操作，避免污染，因此每一步操作均需嚴格按要

求進行。操作時不宜說話或?qū)⒖诒强拷囵B(yǎng)基表面，以免呼吸道排出的細菌污染培養(yǎng)基。

（2）所有操作均需在酒精燈火焰附近進行，平皿蓋、試管塞、瓶塞均應拿在手上

打開（具體見前述），禁止將蓋或塞事先取下放置在桌面上。

（3）取菌種前灼燒接種針（環(huán)）時要將銀路絲燒紅，燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷

卻再取菌種，以免燒死菌種。

（4）取菌時注意菌落不要取得太多，應蘸取而不宜刮取，否則平板劃線很難分離

出單個菌落。

（5）平板劃線時注意掌握好劃線的力度和角度，用力不能過重，接種環(huán)和培養(yǎng)基

表面大約呈30?40°角，劃線要密而不重復，充分利用培養(yǎng)基，并注意不能劃破平板。

半固體培養(yǎng)基接種時注意穿刺線要直，并沿原穿刺線退出。

（6）接種完畢后，需在培養(yǎng)基上做好標記再放置溫箱孵育。廢棄的有菌材料（如

玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需滅菌后再清洗。發(fā)生有菌材料污染應及時進行

消毒處理。

三、細菌的培養(yǎng)方法

1.需氧培養(yǎng)法

該法適用于需氧菌和兼性厭氧菌。將接種后的培養(yǎng)基（試管放試管架上，平板底上

蓋下）置35c培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18-24ho大多數(shù)細菌生長速度快，在孵育18~24h后即可見

到生長現(xiàn)象，但若標本中的菌量少或生長速度慢的細菌（如結(jié)核分支桿菌），則需培養(yǎng)

3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長現(xiàn)象。

2.CO2培芥法

（l）CCh孵育箱：能自動調(diào)節(jié)箱內(nèi)CO2的濃度和溫度，使用方便。

（2）燭缸法：取一有蓋磨口標本缸或玻璃干燥器，在蓋及磨口處上涂上凡士林。

將接種后的培養(yǎng)基放入缸中，并在缸內(nèi)放一支點燃的蠟燭，加蓋密封。隨著缸內(nèi)蠟燭燃

燒產(chǎn)生的CO2增加，蠟燭逐漸自行熄滅，此時缸內(nèi)的CO2濃度約為5?10%,置35℃培

養(yǎng)箱孵育18~24h后觀察結(jié)果。（見圖4-7）

圖4-7燭缸法

（3）化學法（重碳酸鈉-鹽酸法）：按每升容積重碳酸鈉0.4g與lmol/L鹽酸0.35ml

比例，分別將二種試劑置于容器內(nèi)，將容器放置在標本缸中，密封后傾斜容器，使二種

試劑接觸混合產(chǎn)生CO2o該法適用于奈瑟菌和布魯菌等苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。

3.微需氧培養(yǎng)：先用真空泵將容器內(nèi)的空氣排盡，再注入5%。2、10%CO2、85%N2

的混合氣體，然后置于35℃培養(yǎng)箱孵育后觀察結(jié)果。該法適用于空腸彎曲菌、幽門螺

桿菌等微需氧菌的分離培養(yǎng)。

4.厭氧培養(yǎng)法：

（1）厭氧罐培養(yǎng)法：用理化方法使容器內(nèi)形成無氧環(huán)境，用于專性厭氧菌培養(yǎng)。

常用的方法有抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。

1）抽氣換氣法：將已接種的培養(yǎng)基放入真空干燥缸或厭氧罐中，再放入催化劑把

粒和指示劑美藍。先用真空泵將缸內(nèi)抽成負壓99.99kPa（750mmHg）,再充入無氧氮氣,

反復三次，最后充入80%N2、10%以和10%CO2混合氣體，若缸內(nèi)呈無氧狀態(tài)，則指

示劑美藍為無色。每次觀察標本后需重新抽氣換氣，用過的鈿粒經(jīng)160℃2h干烤后可重

復使用。

2）氣體發(fā)生袋法（Gas-pak法）：該法需以下二種容器：厭氧罐一一是由透明聚碳

酸酯或不銹鋼制成，蓋內(nèi)有金屬網(wǎng)狀容器，其內(nèi)裝有厭氧指示劑美藍和用鋁箔包裹的催

化劑把粒；氣體發(fā)生袋一一是一種鋁箔袋，其內(nèi)裝有硼氫化鈉-氯化鉆合劑、碳酸氫鈉-

檸檬酸合劑各1丸和1張濾紙條，使用時剪去特定部位，注入10ml水，水沿濾紙滲入

到二種試劑中，發(fā)生下列化學反應，產(chǎn)生H?和CCh。立即將氣體發(fā)生袋放入罐內(nèi)，密

封嶙蓋，使氣體釋放到罐中。

C6H8Ch+3NaHCO3fNa3（C6H5O7）+3H2O+3CO2t

NaBHH2H2OfNaBCh+4H2t

（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無毒透明、不透氣的復合塑料薄膜制成。袋中裝有催

化劑把粒和2支安甑，分別裝有Hz、CO?發(fā)生器（化學藥品，成分同上）、指示劑美藍。

使用時將接種細菌的平板放入袋中，密封袋口，先將袋中裝有化學藥品的安甑折斷，幾

分鐘后再折斷裝有美藍的安甑，若美藍為無色則表示袋內(nèi)己處于無氧狀態(tài)，置35c溫

箱孵育。

（3）需氧菌共生法：將已知專性需氧菌（如枯草芽胞桿菌）和待檢厭氧菌分別接

種到2個大小相同的平板上，將兩者合攏，縫隙用透明膠密封，置35℃溫箱培養(yǎng)，需

氧菌生長過程中消耗氧氣，待氧氣耗盡后，厭氧菌即開始生長。

（4）平皿焦性沒食子酸法:按每100ml容積加入焦性沒食子酸1g和2.5moKLNaOH

10ml（也可用Na2co3）的比例，先將焦性沒食子酸放入平皿蓋背面的滅菌紗右中，再

滴入NaOH,立即將接種細菌的平板扣上，用熔化的石蠟密封平皿和平皿蓋的縫隙，置

35℃溫箱培養(yǎng)。

（5）庖肉培養(yǎng)基法：將庖肉培養(yǎng)基上面的石蠟熔化，用毛細管吸取標本后接種于

培養(yǎng)基中，待石蠟凝固后置37℃孵育。用于培養(yǎng)基中的肉渣可吸收氧氣，石蠟凝固后

起隔絕空氣的作用，從而使培養(yǎng)基內(nèi)呈無氧狀態(tài)。

（6）厭氧手套箱培養(yǎng)法：厭氧手套箱是目前國際上公認的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之

一。它是一個密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個透明面板，板上裝有兩個手套，可通

過手套在箱內(nèi)進行操作。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關著。使用時

將物品放入箱內(nèi)，先打開外門，放入交換室，關上外門進行抽氣、換氣（H2,CO2,N2）

使之達到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門打開，將物品移入箱內(nèi)，關上內(nèi)門。

箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，是利用充氣中的氫在鋼的催化下和箱中殘余氧化合成水的原理。該

箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或?qū)⒎跸涓皆谄鋬?nèi)。該法適于作厭氧菌的大量培養(yǎng)研究。

四、細菌生長現(xiàn)象的觀察

1.液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：

渾濁生長（如葡萄球菌）、沉淀生長（如鏈球菌）、菌膜生長（如枯草桿菌）。

觀察要點：注意觀察培養(yǎng)基的透明度、管底和液面上是否有細菌生長。

2.半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：

（1）無鞭毛的細菌：僅沿穿刺線生長，穿刺線清嘶，周圍培養(yǎng)基透明（如葡萄球

菌）。

（2）有鞭毛的細菌：沿穿刺線向四周擴散生長，穿刺線邊緣呈羽毛狀，周圍培養(yǎng)

基變渾濁（如大腸埃希菌）。

觀察耍點：注意觀察穿刺線是否清晰、周圍的培養(yǎng)基是否混濁。

3.固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：

菌落：由一個細菌生長繁殖而形成的一個肉眼可見的細菌集團。因來源相同，同一

個菌落的細菌為純種細菌。不同細菌菌落的形態(tài)學特征不同，可以鑒別細菌。

菌苔：由多個菌落融合而成，可能含有雜菌。

菌落性狀的描述：大小、形狀、顏色、凸扁、表面光滑度、濕潤度、光澤、透明度、

邊緣、粘度、溶血（血平板）、氣味等。

【結(jié)果記錄和報告】

實驗五細菌的生化反應

【目的和要求】

1.掌握細菌生化反應的概念。

2.掌握常用生化反應的原理和方法。

3.了解生化反應在細菌鑒定及診斷中的重要意義。

【試劑與器材】

1.菌種：大腸埃希菌、傷寒沙門菌、產(chǎn)氣腸桿菌。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白陳水、葡萄糖發(fā)酵管、蛋白膿水、硫酸亞鐵（或醋酸鉛）

半固體培養(yǎng)基、西蒙氏或柯氏培養(yǎng)基等。

3.試劑：甲基紅試劑、40%KOH、靛基質(zhì)試劑、3%H2O”1%鹽酸四甲基對苯二

胺（或1%鹽酸二甲基對苯二胺）。

4.其他：接種環(huán)（針）、酒精燈、毛細滴管、生物安全柜、培養(yǎng)箱、水浴箱、濾紙

條等。

【實驗內(nèi)容】

不同細菌具有不同的酶，對同一種基質(zhì)（糖、蛋白質(zhì)等）分解代謝的能力不同而可

得到不同的代謝產(chǎn)物，檢查這些代謝產(chǎn)物就可幫助鑒別細菌，這類試驗稱為細菌的生化

反應。生化反應在細菌的鑒定中起著重要的作用，因而為臨床細菌檢驗所常用。

細菌的生化反應很多，本次實驗著重介紹一些最常用、最基本的試驗，其余部分可

參見附錄。

、糖（醇、甘）的分解代謝試驗

1.葡萄糖發(fā)酵試驗

（1）原理：將大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種于半固體的葡萄糖發(fā)酵管中，經(jīng)

37℃18-24h培養(yǎng)，大腸埃希菌因為分解其中的葡萄糖最終產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。產(chǎn)酸使培養(yǎng)基

中的pH下降因而指示劑顯紅色，產(chǎn)氣，則半固體中有氣泡出現(xiàn)；而傷寒沙門菌分解葡

萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基雖變紅但其中無氣泡。通過觀察培養(yǎng)基顏色變化以及氣體的有

無即可鑒別細菌。

（2）方法:

1）葡萄糖發(fā)酵管的制備：取經(jīng)高壓滅菌并經(jīng)加熱融化的半固體瓊脂100mL以無

菌操作加入經(jīng)煮沸消毒的20%葡萄糖水溶液5ml、1%酸性復紅指示劑0.5ml,混勻之后，

趁熱倒入小試管并冷卻凝固。

2）細菌接種、培養(yǎng)：用接種針挑取大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別穿刺接種于半固

體糖發(fā)酵管中，將試管放35℃18~24h培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)基變紅者為細菌產(chǎn)酸，半固體中有氣泡即產(chǎn)氣。

（4）注意事項：

1）發(fā)酵管的制備、細菌的接種均應嚴格無菌操作。

2）將其中的葡萄糖換成其他的糖（或醇），就可以做成其他糖（或醇）的發(fā)酵管。

3）發(fā)酵管也可以制成液體的，但需在試管中加入一支小倒管以觀察產(chǎn)氣情況，并

可以選用不同的指示劑。

4）培養(yǎng)基的pH應控制在7.2?7.4為宜。

臨床應用：可用于多種細菌的鑒別。

2.甲基紅試驗（MR試驗）

（1）原理：某些細菌如大腸桿菌能將葡萄糖分解成丙酮酸，并進一步將丙酮酸分

解成大量有機酸（甲酸、乙酸、乳酸等）使pH下降至4.4以下，加入甲基紅指示劑后

顯紅色為試驗陽性。而另一些細菌如產(chǎn)氣腸桿菌則分解葡萄糖產(chǎn)酸少，并將酸分解生成

醇、酮、醛等，培養(yǎng)基的pH在5.4以上，使甲基紅試劑顯黃色，為試驗陰性。

（2）方法：

1）用接種環(huán)挑取大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于葡萄糖蛋白陳水中，置35℃

培養(yǎng)箱，經(jīng)18~24h培養(yǎng)。

2）取出培養(yǎng)物，于試管中滴加幾滴甲基紅試劑，輕輕搖動試管，培養(yǎng)液立即顯紅

色者為試驗陽性，黃色者為陰性。

臨床應用：該試驗主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別，前者為陽性，后者為

陰性。

3.V-P（Voges-Proskauer）試驗（伏普試驗）

（1）原理：某些細菌（如產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌）將葡萄糖分解成丙酮酸之后，

能進一步使丙酮酸脫竣生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在堿性環(huán)境中被空氣中的氧氧化

成二乙酰，二乙酰與蛋白族中所含精氨酸的呱基發(fā)生反應生成紅色的化合物。故在培養(yǎng)

基中加入含股基的化合物（如肌酸或肌酎等），可加速該反應。

（2）方法：

1）接種環(huán)取細菌接種于葡萄糖蛋白陳水，置35℃培養(yǎng)48h°

2）取出，按每毫升加入含0.3的肌酸或肌酊的40%KOH溶液0.1ml,放48?50

C水浴2h（或37-C4h）,充分搖動后，觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)液變紅色為陽性。

臨床應用：主要用于產(chǎn)氣腸桿菌和大腸埃希菌的鑒別，產(chǎn)氣腸桿菌V-P試驗陽性，

后者為陰性。

二、蛋白質(zhì)（或氨基酸）代謝試驗

1.靛基質(zhì)（口引喙）試驗

（1）原理：某些細菌（如大腸埃希菌等）能分解蛋白月東中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)（咧

咪），當加入靛基質(zhì)試劑（對二甲氨基苯甲醛）之后，靛基質(zhì)與對二甲氨基苯甲醛作用

生成紅色化合物一玫瑰靛基質(zhì)。

（2）方法：

1）將細菌種于蛋白膿水培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24?48h。

2）取出，滴加數(shù)滴旋基質(zhì)試劑于培養(yǎng)基的液面上，靜置半分鐘觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果觀察：液面的試劑變紅色為試驗陽性，黃色為陰性。

（4）注意事項：靛基質(zhì)試劑具有較強的腐蝕性，使用時應小心，勿滴落至皮膚、

衣服或其他物品上。

臨床應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒別。

2.硫化氫試驗

（1）原理：某些細菌（如變形桿菌）能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半

胱氨酸等），產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇到培養(yǎng)基中的重金屬離子如Pb?+或Fe2+等，形成硫

化鉛或硫化亞鐵黑色沉淀。

（2）方法；將待測細菌穿刺接種于含硫酸亞鐵（或醋酸鉛）的半固體培養(yǎng)基中，

35℃培養(yǎng)24-48小時后觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果觀察：穿刺線周圍出現(xiàn)黑色者為陽性.

臨床應用：常用于腸桿菌科屬間的鑒別，沙門菌屬（甲型副傷寒沙門菌除外）、愛

德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸掾酸桿菌屬和變形桿的屬等