微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)

微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

一、《微生物學(xué)檢驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?/p>

1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論知識(shí)，并掌握比較全面的微生物學(xué)基本操作技術(shù)。

2.在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中建立無(wú)菌觀念，掌握無(wú)菌操作技術(shù)。

3.通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步掌握臨床常見(jiàn)病原微生物的生物學(xué)性狀、分離培養(yǎng)和鑒定的方

法、各種臨床標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法。

4.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中逐漸培養(yǎng)獨(dú)立思考問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。

二、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則及實(shí)驗(yàn)室意外處理方法

1.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

由于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是以病原微生物為研究對(duì)象,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中任何疏忽大意都有可

能引起實(shí)驗(yàn)人員的自身感染或?qū)嶒?yàn)室和周?chē)h(huán)境的污染。因此，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)

規(guī)則，建立無(wú)菌觀念，嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止丈驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)意外情況，并確保變驗(yàn)結(jié)果

的準(zhǔn)確。

（1）試驗(yàn)前須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法和注意事?xiàng)，做到心中有數(shù)，

避免發(fā)生錯(cuò)誤，提高實(shí)驗(yàn)效率。

（2）進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿工作服，必要時(shí)還須戴口罩、帽子和手套，并做好實(shí)驗(yàn)前

的各項(xiàng)準(zhǔn)備工作。

（3）非必需物品禁止帶入實(shí)驗(yàn)室，帶入實(shí)驗(yàn)室的物品應(yīng)遠(yuǎn)離操作區(qū)，放在指定的

區(qū)域。

（4）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)大聲喧嘩、嬉戲，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室的安靜、整潔和有序。不準(zhǔn)在

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吸煙、飲水和進(jìn)食，盡量避免用手觸摸頭、面部，防止感染，盡量減少室內(nèi)活

動(dòng)，以免引起風(fēng)動(dòng)。

（5）實(shí)驗(yàn)中注意節(jié)約試劑，愛(ài)護(hù)儀器，避免有菌材料的污染，如有傳染性材料污

染桌面、地面、手、衣服或發(fā)生其他意外情況，應(yīng)立即報(bào)告老師及時(shí)作適當(dāng)處理。

（6）用過(guò)的污染物品應(yīng)放到指定的地點(diǎn)，經(jīng)專人消毒滅菌之后再進(jìn)行清洗，切勿

亂丟或沖入水池中。禁止將本實(shí)驗(yàn)室的物品帶出實(shí)驗(yàn)室外。需送溫箱培養(yǎng)的物品，應(yīng)標(biāo)

記清楚后送到指定地點(diǎn)。

（7）實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)將桌面整理清潔，試劑、儀器放回原處，并用浸有消毒液的抹

布將操作臺(tái)擦拭干凈，打掃衛(wèi)生，關(guān)好水、電、門(mén)窗。

（8）離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2%來(lái)蘇液中浸泡5min

左右，再用肥皂、清水洗凈，方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。

2.實(shí)驗(yàn)室意外的緊急處理方法

(1)發(fā)生皮膚破損或刺傷：首先用肥皂和水沖洗傷口，盡量擠出損傷處的血液，

并用7()%乙醇或其他皮膚消毒劑進(jìn)行消毒，立即進(jìn)行醫(yī)療處理。

(2)化學(xué)藥品腐蝕傷：若為強(qiáng)酸，用大量清水沖洗后再以5%碳酸氫鈉溶液中和;

若為強(qiáng)堿，用大量清水沖洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受傷處是眼部，經(jīng)

上述方法處理后，再滴入橄欖油或液體石蠟1~2滴。

(3)燒傷：局部涂凡士林、5%鞅酸或2%苦味酸。

(4)菌液誤入口中：立即將菌液吐入消毒容器中，再用1：1000高鎰酸鉀或3%

過(guò)氧化氫漱口，根據(jù)菌種服用適當(dāng)抗生素預(yù)防感染。

(5)菌液污染環(huán)境:將適量2~3%來(lái)蘇或0.1%新潔爾滅浸泡污染面半小時(shí)后除去,

如手上有菌污染，也可浸泡于上述消毒液中3~5min,之后用肥皂和清水洗凈。

三、生物安全防護(hù)知識(shí)簡(jiǎn)介

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作人員長(zhǎng)期接觸有潛在傳染性的血液、糞便、體液等標(biāo)本，這些標(biāo)本往

往是各種細(xì)菌、病毒等病原微生物的傳播載體，無(wú)論是實(shí)驗(yàn)人員感染，還是造成實(shí)驗(yàn)室

和周I韋I環(huán)境的污染，都將導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。因此實(shí)驗(yàn)室工作人員在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須高度

重視實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)，強(qiáng)化生物安全意識(shí)，熟悉生物安全防護(hù)有關(guān)知識(shí)，嚴(yán)格無(wú)菌

操作。

1.微生物的分類等級(jí)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)出版的《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》，將微生物分為四個(gè)

不同危險(xiǎn)度等級(jí)：危險(xiǎn)度1級(jí)是指不能引起人或動(dòng)物致病的微生物，此類微生物無(wú)或僅

具有極低的個(gè)體和群體危檢；危險(xiǎn)度2級(jí)的病原體具有中度個(gè)體危險(xiǎn)，低度群體危險(xiǎn)，

能引起人或動(dòng)物致病，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員、社區(qū)、家畜或環(huán)境不易導(dǎo)致嚴(yán)重危害，所

引起的感染具有有效的預(yù)防和治療措施，并且疾病傳播的危險(xiǎn)有限；危險(xiǎn)度3級(jí)的病原

體具有高度個(gè)體危險(xiǎn)，低度群體危險(xiǎn)，通常能引起人或動(dòng)物的嚴(yán)重疾病，但一般不會(huì)發(fā)

生感染的播散，并且對(duì)感染具有有效的預(yù)防和治療措施；危險(xiǎn)度4級(jí)的病原體具有高度

的個(gè)體危險(xiǎn)和群體危險(xiǎn)，通常能引起人或生物的嚴(yán)重疾病，并且很容易發(fā)生個(gè)體之間的

直接或間接傳播，對(duì)感染一般沒(méi)有有效的預(yù)防和治療措施。

基于以上劃分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合微生物的致病性、傳播方式、目前所具有的預(yù)防和治療

措施等因素，我國(guó)衛(wèi)生部于2006年制定了《人間傳染的病原微生物名錄》，對(duì)各種病

原微生物的危害程度及其相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)需要達(dá)到的生物安全實(shí)驗(yàn)室級(jí)別做了詳細(xì)分類，

各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)均需參照此標(biāo)準(zhǔn)。

2.生物安全實(shí)驗(yàn)室分級(jí)與要求

由于各種病原微生物的危險(xiǎn)度等級(jí)不同，因此實(shí)驗(yàn)室必須達(dá)到相應(yīng)的生物防護(hù)等

級(jí)才能開(kāi)展有關(guān)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)WHO《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》和我國(guó)衛(wèi)生部2002年頒布

的《微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》，實(shí)驗(yàn)室從生物安全防護(hù)的角度共分

為四級(jí)：一級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室（BSL-1）為實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全

設(shè)備適用于危險(xiǎn)度1級(jí)的微生物，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序可進(jìn)行開(kāi)放性操作，如用于教學(xué)的

普通微生物實(shí)驗(yàn)室即屬此類。二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）適用于對(duì)人或環(huán)境具

有中等潛在危害的微生物，即危險(xiǎn)度2級(jí)的病原體，該級(jí)別實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備生物安全柜和

密封的離心管，以免發(fā)生泄漏和產(chǎn)生氣溶膠。三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）適用

于有明顯危害、可以通過(guò)空氣傳播的病原微生物（婦結(jié)核桿菌、伯氏立克次體等），通

常已有預(yù)防傳染的疫苗，該級(jí)別實(shí)驗(yàn)室除了有嚴(yán)格的一級(jí)和二級(jí)安全設(shè)施要求外，還需

具備合適的空氣凈化系統(tǒng)。四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室（BSL-4）適用于對(duì)人體具有高度

的危險(xiǎn)性，通過(guò)氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無(wú)有效的疫苗或治療方法的致

病微生物及其毒素。BSL-4實(shí)驗(yàn)室必須與其他實(shí)驗(yàn)室隔離，并具備特殊的空氣和廢物處

理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)操作須在IH級(jí)生物安全柜內(nèi)或全身穿戴特制的正壓防護(hù)服。

根據(jù)以上定義，醫(yī)院內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)室因接觸可能含有致病微生物的標(biāo)本，通常應(yīng)

達(dá)到二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室要求。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室生物安全認(rèn)可準(zhǔn)則》，二級(jí)生物安全

實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)施需符合以下兒點(diǎn)：（1）實(shí)驗(yàn)室需具有防止節(jié)肢動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物進(jìn)入的設(shè)

計(jì)，有可開(kāi)啟的窗戶，有紗窗，實(shí)驗(yàn)室門(mén)有可視窗帶鎖并能自動(dòng)關(guān)閉。（2）每個(gè)實(shí)驗(yàn)室

均應(yīng)設(shè)置洗手池，宜設(shè)置在靠近出口處。（3）實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域外有足夠的存儲(chǔ)空間及擺

放個(gè)人衣物的設(shè)施。（4）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)墻壁、地面應(yīng)平整、防滑、易于清潔，不適宜用地毯。

（5）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)能防水、耐腐蝕、耐熱。（6）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保證工作照明，避免反光和

強(qiáng)光。（7）在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)穿戴隔離衣、帽、手套，必要時(shí)戴防護(hù)眼鏡。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)備有生

物安全柜。（8）有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)施，如高壓蒸汽滅菌器，并設(shè)置洗眼裝置、應(yīng)急噴淋裝

置、急救藥箱、滅火器等。（9）有可靠的電力供應(yīng)和應(yīng)急照明。（10）在實(shí)驗(yàn)室出口處

設(shè)有在黑暗中可明確辨認(rèn)方向、通道的標(biāo)識(shí)。（11）在實(shí)驗(yàn)室入口處和裝有傳染性物質(zhì)

的設(shè)備表面貼有生物危險(xiǎn)標(biāo)志。

3.實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度

實(shí)驗(yàn)室生物安全制度建設(shè)對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室而言是生物安全防護(hù)的核心，實(shí)驗(yàn)室生

物安全管理制度應(yīng)包括?：實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)入制度、生物安全培訓(xùn)制度、生物安全責(zé)任制和責(zé)任

追究制度、生物防護(hù)與安全制度、安全檢查制度、個(gè)人防護(hù)制度、實(shí)驗(yàn)室管理制度、清

潔消毒制度、安全計(jì)劃審核制度、廢棄物處理制度、事故報(bào)告制度、生物安全防護(hù)應(yīng)急

預(yù)案、標(biāo)準(zhǔn)操作程序等。

建立健全了各項(xiàng)生物安全制度，還應(yīng)成立生物安全管理領(lǐng)導(dǎo)小組，加強(qiáng)生物安全

制度實(shí)施情況的監(jiān)督管理，實(shí)驗(yàn)室入口處須粘貼生物安全標(biāo)志，注明危險(xiǎn)因素，生物安

全級(jí)別，負(fù)責(zé)人姓名和電話，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的特殊要求及離開(kāi)程序，禁止非工作人員進(jìn)入

實(shí)驗(yàn)室，如需參觀實(shí)驗(yàn)室等特殊行為需經(jīng)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人的批準(zhǔn)后方可進(jìn)入。

4.實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)生物危險(xiǎn)

實(shí)驗(yàn)室生物污染的途徑包括：空氣傳播（臨床標(biāo)本中的污染源在空氣中傳播、微生

物氣溶膠的吸入）、直接轉(zhuǎn)播（工作中偶然刺傷、割傷，碎玻璃劃傷直接感染）、皮膚

粘膜接觸（臨床標(biāo)本中的傳染源通過(guò)破損皮膚粘膜接觸造成的感染）、其他不明原因的

實(shí)驗(yàn)室相關(guān)感染。

實(shí)驗(yàn)室傷害以及與工作有關(guān)的感染主要是由于人為失誤、不良實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及儀器

使用不當(dāng)造成的。因此，實(shí)驗(yàn)室人員必須提高生物安全意識(shí)，認(rèn)真學(xué)習(xí)生物安全相關(guān)的

各種法規(guī)和文件，定期進(jìn)行生物安全防護(hù)知識(shí)培訓(xùn)，熟悉生物防護(hù)有關(guān)知識(shí)，加強(qiáng)基本

技能的培養(yǎng)，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程。實(shí)驗(yàn)室管理者應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別進(jìn)行分析，尤其

對(duì)風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別較高的、接觸高危標(biāo)本幾率較大的區(qū)域如微生物和分子生物學(xué)室予以高度重

視，保護(hù)實(shí)驗(yàn)室工作人員和環(huán)境的安全。

5.生物廢棄材料的管理

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有用過(guò)的樣本、培養(yǎng)物及其他生物性材料等廢棄物，嚴(yán)禁未經(jīng)處理就隨

意丟棄，應(yīng)置于貼有生物危害標(biāo)志的專用廢棄物處理容器內(nèi)，注意容器的充滿量不能超

過(guò)其設(shè)計(jì)容量，利器（如針頭、小刀、玻璃等）應(yīng)置于耐扎銳器盒內(nèi)，在去污染或最終

處置前應(yīng)存放在指定的安全地方，經(jīng)過(guò)高壓滅菌或其他無(wú)害化處理后再安全運(yùn)出實(shí)驗(yàn)

室；有害氣體、氣溶膠、污水、廢液等均需經(jīng)無(wú)害化處理后排放；動(dòng)物尸體、組織的處

置和焚化應(yīng)符合國(guó)家相關(guān)要求。處理危險(xiǎn)廢棄物的人員需經(jīng)過(guò)專'業(yè)培訓(xùn)，并使用適當(dāng)?shù)?/p>

防護(hù)設(shè)備。

第一章微生物學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)

實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及顯微鏡油鏡的使用

【目的和要求】

1,熟悉微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)則并自覺(jué)遵守。

2.掌握細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)的觀察方法。

3.掌握光學(xué)顯微鏡油鏡的使用和維護(hù)方法，了解熒光顯微鏡和暗視野顯微鏡的構(gòu)

造和使用方法。

【試劑與器材】

1.示教片：各種球菌、桿菌、弧菌、莢膜、鞭毛、芽胞的示教片。

2.器材及其他：光學(xué)顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、香柏油、脫油劑等。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一、細(xì)菌基本形態(tài)和特殊構(gòu)造的觀察

1.細(xì)菌的基本形態(tài)（各種球菌、桿菌、弧菌等）

觀察要點(diǎn)：注意細(xì)菌的染色性、相對(duì)大小、形狀及排列方式。

2.特殊結(jié)構(gòu)的觀察［莢膜、芽胞、鞭毛）

觀察要點(diǎn)：注意這些特殊結(jié)構(gòu)的大小、形狀及其在菌體中的位置，均有助于細(xì)菌的

鑒定。

二、光學(xué)顯微鏡油鏡的使用

1.光學(xué)顯微鏡的構(gòu)迨

光學(xué)顯微鏡是觀察細(xì)菌形態(tài)最常用的種儀器，其構(gòu)造分為機(jī)械部分和光學(xué)部分，

機(jī)械部分包括：鏡座、鏡臂、載物臺(tái)、鏡筒、鏡頭轉(zhuǎn)換器、調(diào)焦裝置等；光學(xué)部分包括:

接物鏡、接目鏡、反光鏡、聚光器、光圈等（見(jiàn)圖l-l）o

,■東雙?

圖1-1光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造

顯微鏡的接物鏡有低倍鏡、高倍鏡、油鏡三種，放大倍數(shù)依次增高，其識(shí)別方法為:

（1）低倍鏡：鏡頭標(biāo)志為10x或10/0.25,鏡頭最短，其上?？逃悬S色環(huán)圈。

（2）高倍鏡：鏡頭標(biāo)志為40x或40/0.65,鏡頭較長(zhǎng)，其上?？逃兴{(lán)色環(huán)圈。

（3）油鏡:鏡頭標(biāo)志為100x或100/1.30,鏡頭最長(zhǎng),其上?？逃邪咨h(huán)圈,或“oil”

字樣。

2.油鏡的使用原理

圖1-2顯微鏡油鏡的使用原理

油鏡的放大倍數(shù)高而透鏡很小，自標(biāo)本片透過(guò)的光線，因玻片和空氣的折光率不同

（玻璃n=1.52,空氣n=1.0）,部分光線經(jīng)載玻片進(jìn)入空氣后發(fā)生折射，不能進(jìn)入接物

鏡，致使射入光線較少，物象不清晰。在油鏡和載玻片之間滴加和玻璃折光率相近的香

柏油（n-1.515）,則使進(jìn)入油鏡的光線增多，視野光亮度增強(qiáng)，物象清晰（見(jiàn)圖1-2）。

3.使用方法

（1）采光：使用顯微鏡時(shí)必須端坐，將顯微鏡放在胸前適當(dāng)位置。將低倍鏡轉(zhuǎn)到

中央并對(duì)準(zhǔn)下面的聚光器，打開(kāi)光圈，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡，使光線集中于聚光器（以燈光為光

源時(shí)，使用凹面反光鏡，以自然光為光源時(shí)用平面反光鏡）。根據(jù)所觀察的標(biāo)本，通過(guò)

升降聚光器和縮放光圈以獲得最佳光度。當(dāng)用低倍鏡或高倍鏡觀察時(shí)，應(yīng)適當(dāng)縮小光圈，

下降聚光器；當(dāng)用油鏡觀察時(shí)，光線宜強(qiáng)，應(yīng)把光圈完全打開(kāi)，并將聚光器上升到最高

位置。

（2）低倍鏡調(diào)焦：將欲觀察的標(biāo)本置載物臺(tái)上，用彈簧夾和推進(jìn)器固定，將待檢

部位移至視野正中央，上升載物臺(tái)至不能升高為止。用左眼觀察接目鏡，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)

節(jié)器，使載物臺(tái)下降，待看到模糊的圖像時(shí)，再調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)器，直至看到清晰的圖像為

止。

（3）油鏡的使用：低倍鏡找到物象并調(diào)至清晰之后，轉(zhuǎn)開(kāi)物鏡頭，在玻片的標(biāo)本

上滴加1滴香柏油，將油鏡頭轉(zhuǎn)換至中央，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使鏡頭浸入油中，當(dāng)油

鏡頭幾乎接觸玻片時(shí)停止轉(zhuǎn)動(dòng)（從側(cè)面觀察），邊觀察接目鏡邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器（此

時(shí)只能上升鏡頭，不能下降，防止壓壞玻片及損壞物鏡），待看到模糊物象時(shí)改調(diào)細(xì)調(diào)

節(jié)器，直至找到清晰物象。

鏡檢時(shí)應(yīng)將標(biāo)本按一定方向呈“弓”形移動(dòng)，直至整個(gè)標(biāo)本觀察完畢，以防漏檢。觀

察時(shí)應(yīng)將兩只眼睛同時(shí)睜開(kāi)，左眼觀察，右眼用于繪圖或記錄。標(biāo)本觀察完畢后，先將

物鏡頭移開(kāi)，再轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使載物臺(tái)下降，取下載玻片，立即用擦鏡紙將鏡頭上的香

柏油擦凈。

4.注意事項(xiàng)

（1）顯微鏡是精密光學(xué)儀器，在搬放時(shí)應(yīng)右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，平端在

胸前，輕拿輕放。

（2）顯微鏡放到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上時(shí)，先放鏡座的一端，再將鏡座全部放穩(wěn)，切不可使鏡

座全面同時(shí)與臺(tái)面接觸，這樣震動(dòng)過(guò)大，透鏡和微調(diào)節(jié)器的裝置易損壞。

（3）避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氯仿、乙醛、酒精等化學(xué)藥品與顯微鏡接觸，避免日光直

射，顯微鏡須經(jīng)常保持清潔，勿使油污和灰塵附著。

（4）接目鏡和接物鏡不要隨便卸下，必須抽取接目鏡時(shí)，須將鏡筒上口用布遮蓋,

避免灰塵落入鏡筒內(nèi)。更換接物鏡時(shí)，卸下后應(yīng)倒置在清潔的臺(tái)面上，并隨即裝入木箱

的置放接物鏡的管內(nèi)。

（5）細(xì)調(diào)節(jié)器是顯微鏡最精細(xì)而脆弱的部分，不要向一個(gè)方向連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)周，應(yīng)

輕微地來(lái)回旋轉(zhuǎn)。

（6）鏡頭必須保持涓潔，油鏡使用完后應(yīng)立即用擦鏡紙拭去香柏油。若油鏡鏡頭

上的油跡木擦干凈，應(yīng)先將1:1醒醴混合液或二甲茶滴在擦鏡紙上擦拭鏡頭，再用干凈

擦鏡紙將鏡頭上殘留的醇縫混合液或二甲苯擦凈。

（7）顯微鏡擦凈后，取下標(biāo)本片，下降聚光器，再將物鏡轉(zhuǎn)成"品”字形，送至顯

微鏡室放入鏡箱內(nèi)。

三、暗視野顯微鏡

1.構(gòu)造與原理：在顯微鏡上安裝一個(gè)特制的聚光器一暗視野聚光器。此聚光器中

央為一黑板所遮，光線不能直接通向鏡筒，使視野背景黑喑。這樣，從聚光器周邊斜射

到載玻片上細(xì)菌等微粒上的光線，就因散射作用而發(fā)出亮光，反射到鏡筒內(nèi)。故在強(qiáng)光

照射下，可在黑色的背景中看到發(fā)亮的菌體。正如我們?cè)诎凳覂?nèi)，能看到從隙縫漏入的

陽(yáng)光內(nèi)，有無(wú)數(shù)顆塵埃微粒跳躍飛舞一樣。

2.使用方法：

（1）將顯微鏡聚光器御下，裝上暗視野聚光器，置暗室，使用人工光源。

（2）先用低倍物鏡觀察，調(diào)節(jié)光環(huán)置中央后，在暗視野聚光器表面滴上香柏油（或

水），再將標(biāo)本夾在移動(dòng)尺上。

（3）調(diào)節(jié)暗視野聚光器，使之油滴（或水滴）與鏡臺(tái)上的載玻片底面接觸，

（4）其余操作同光學(xué)顯微鏡。

四、熒光顯微鏡

1.構(gòu)造：

（I）熒光顯微鏡光源：能發(fā)射豐富的紫外線光和紫蘭光，常用15（）~200瓦高壓汞

燈。

（2）濾光片：

1）激發(fā)濾光片裝于光源與聚光器之問(wèn)，可選擇性使紫外光及紫蘭光通過(guò)，激發(fā)熒

光素發(fā)出熒光；

2）吸收濾光片裝于物鏡與目鏡之間，可吸收紫外光及紫蘭光，僅讓熒光通過(guò)，以

便觀察標(biāo)本和保護(hù)眼睛。

2.熒光顯微鏡的使用方法：

（1）將熒光顯微鏡置暗室，開(kāi)啟光源，待光源穩(wěn)定并達(dá)到一定亮度（約5~10min）

后，對(duì)準(zhǔn)光軸。

（2）裝好配對(duì)的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察。操作同光學(xué)顯微鏡。

3.注意事項(xiàng)

（1）熒光顯微鏡如用高壓汞燈作光源，使用時(shí)一經(jīng)開(kāi)啟不宜中斷，斷電后需待汞

燈冷卻后（約15min）方能再啟用。

（2）使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本時(shí)間不宜太長(zhǎng).因標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min,

即有熒光減弱現(xiàn)象。

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查

【目的和要求】

1.熟悉細(xì)菌染色的常用染料和一般程序。

2.掌握革蘭染色的方法、原理、結(jié)果觀察及意義。

3.熟悉不染色標(biāo)本檢查法（壓滴法和懸滴法）的方法與結(jié)果觀察。

4.熟悉細(xì)菌的特殊染色法。

【試劑與器材】

1.菌種：葡萄球菌、大腸埃希菌。

2.試劑：革蘭染色液、細(xì)胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理鹽水等。

3.其他：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、香柏油、蠟筆、擦鏡紙、脫油劑等。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一、細(xì)菌染色的一般程序

細(xì)菌染色法分單染法和復(fù)染法。單染法是用一種染料去染，所有細(xì)菌都染成一種顏

色；復(fù)染法是用多種染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，不同細(xì)函可染成不同的顏色。

大部分細(xì)菌染色的基本程序相同，即：涂片一干燥—固定-染色，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x

擇不同的染色方法，在實(shí)際工作中，應(yīng)用最廣泛的是革蘭染色法。

二、革蘭染色

1.染色原理

（1）等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)：革蘭陽(yáng)性菌的等電點(diǎn)（“2?3）比革蘭陰性菌（pI4?5）低，

在同一pH條件下革蘭陽(yáng)性菌帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌要多，與帶正電荷的堿性染料（結(jié)

晶紫）結(jié)合性牢固，不易脫色。

（2）化學(xué)學(xué)說(shuō)：革蘭陽(yáng)性菌含有大量的核糖核酸鎂鹽，與進(jìn)入胞漿內(nèi)的結(jié)晶紫和

碘牢固結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被95%酒精脫色；而革蘭陰性菌含此種物質(zhì)少，故

易被乙醇脫色。

（3）通透性學(xué)說(shuō)：革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層較厚，含脂質(zhì)少，脫

色時(shí)，乙醇不易進(jìn)入，而且95%乙醇可使細(xì)胞壁脫水，細(xì)胞壁間隙縮小，通透性降低,

阻礙結(jié)晶紫和碘復(fù)合物滲出。而革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層較薄，含脂質(zhì)

多，易被乙醇溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫與碘無(wú)合物易被溶出而脫

色。

2.方法

（1）涂片：取清潔無(wú)油跡的載玻片1張，用蠟筆劃線將其分成左右兩格。用接種

環(huán)先挑取生理鹽水1?2環(huán)于載玻片每格中央,再分別挑取大腸桿菌和葡萄球菌少許菌落

與生理鹽水研勻，涂成直徑約1.5cm的菌膜。

（2）干燥：讓涂片自然干燥，也可在酒精燈火焰較遠(yuǎn)處微微加熱烘干，但切勿靠

近火焰。

（3）固定：干燥后的標(biāo)本片在酒精燈火焰上來(lái)回通過(guò)3次（以鐘擺的速度），冷卻

后染色。固定的目的在于殺死細(xì)菌，并使菌膜與玻片牢固粘附，避免染色過(guò)程中被水沖

洗掉，通過(guò)固定還可凝固細(xì)胞質(zhì)，改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性，使細(xì)菌易與染料結(jié)合而著

色。

（4）染色：分以下四步：

Imin.水洗Imin,水洗Z勺0.5min,水洗0.5min.水洗

結(jié)晶紫〔-----?!盧戈碘液|------由5%乙醉I---------M稀釋石炭酸復(fù)玩|-----麻午干、鏡檢

（初染）（媒染）（脫色）（復(fù)染）

3.結(jié)果：革蘭陽(yáng)性菌染成紫色；革蘭陰性菌染成紅色。

4.注意事項(xiàng)：

（1）涂片厚薄要適宜，以菌膜剛好能透過(guò)字跡為宜（半透明）。如果涂片太厚有可

能將革蘭陰性菌染成紫色，涂片太薄則可能將革蘭陽(yáng)性菌染成紅色。

（2）脫色時(shí)間長(zhǎng)短要適宜，如果涂片較厚應(yīng)相應(yīng)的延長(zhǎng)脫色時(shí)間，如涂片較薄則

相應(yīng)的縮短脫色時(shí)間，脫色時(shí)應(yīng)不斷旋轉(zhuǎn)玻片搖勻，使其充分脫色，通常脫到乙醇中沒(méi)

有紫色流下即可。

（3）水洗時(shí)，水流不能過(guò)大，防止水流直接對(duì)準(zhǔn)菌膜沖洗。

（4）所有染液應(yīng)防止因蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后失去

媒染作用；涂片上積水過(guò)多會(huì)降低染液濃度，影響染色效果。

（5）因細(xì)菌的菌齡不同染色結(jié)果也有差異，一般以18?24h培養(yǎng)物染色結(jié)果最好。

5.醫(yī)學(xué)意義：通過(guò)革蘭染色有助丁?細(xì)菌的初步鑒別，并可作為選擇藥物的參考，

了解細(xì)菌的致病性。

三、特殊染色法

細(xì)菌的細(xì)胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)如芽胞、莢膜、鞭毛等，必須用

相應(yīng)的特殊染色法才能染上顏色。

1.細(xì)胞壁染色法

（1）涂片、干燥：同革蘭染色法。

（2）固定：滴加100g/L糅酸固定標(biāo)本15min,水洗。

（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5min,水洗，待干、鏡檢。

結(jié)果：有細(xì)胞壁的細(xì)菌僅菌體周邊染成紫色，成體內(nèi)部無(wú)色；無(wú)細(xì)胞壁的細(xì)菌（如

L型細(xì)菌）整個(gè)菌體都染成紫色。

2.鞭毛染色法（改良Ryu法）

鞭毛染色可從平板上直接挑取菌落，也可從斜面培養(yǎng)基上刮取菌苔涂片，必須注意

動(dòng)作盡量輕，以免鞭毛脫落。培養(yǎng)基應(yīng)為營(yíng)養(yǎng)較好的瓊脂平板（如血平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂）,

不可用含抑制劑的選擇培養(yǎng)基（如SS、中國(guó)藍(lán)、MAC等）。

（1）玻片的處理：要求用新的載玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用時(shí)從

酒精中取出，用干凈的紗布擦干使用。若水滴向周?chē)魃⒍恍纬伤楸硎静Ｆ幚砹?/p>

好。

（2）在玻片上加蒸儲(chǔ)水1滴，用接種針蘸取菌落少許，將細(xì)菌點(diǎn)在蒸儲(chǔ)水滴的頂

部（一般只需點(diǎn)一下，僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴），使其自然流散成薄膜，不可攪動(dòng),

以免鞭毛脫落。

（3）室溫自然干燥，不可在火焰上烘干。

（4）滴加染液（配方見(jiàn)附錄二），染色約10?15min后，將玻片微傾斜，用蒸儲(chǔ)水

緩慢滴加在玻片頂端無(wú)菌膜處洗去染液，注意洗凈染液表面的金屬光澤液膜。

（5）玻片自然干燥后鏡檢。觀察時(shí)應(yīng)從細(xì)菌較少的地方尋找鞭毛。

結(jié)果：鞭毛染成紅色。

3.芽胞染色法

（1）涂片、干燥、固定：同革蘭染色法。

（2）染色：分為以下三步。

1）初染：在菌膜上加石炭酸復(fù)紅染液，用微火加熱使染液冒蒸氣5min,注意不能

煮沸或燒干，加熱過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)添加染液，冷卻后水洗。

2）脫色：用95%乙醇脫色1?2min,水洗。

3）復(fù)染：用堿性美藍(lán)染Imin,水洗，待干、鏡檢。

結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽胞染成紅色。

4.莢膜染色法

（1）黑斯氏法

1）涂片，自然干燥，加熱固定。

2）滴加結(jié)晶紫染液，在火焰上微微加熱至染液冒蒸氣為止。

3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水紙吸干后鏡檢。

結(jié)果：菌體及背景均染成紫色，莢膜染成淡紫色或無(wú)色。

（2）密爾氏法

1）涂片.：提前數(shù)日于小鼠腹腔注射肺炎鏈球菌0.2ml,小鼠死亡后取腹腔液印片，

自然干燥，加熱固定。

2）滴加石炭酸復(fù)紅染液，微火加熱染色I(xiàn)min,水洗。

3）加媒染劑染0.5min,水洗。

4）加堿性美藍(lán)染色I(xiàn)min,水洗，待干，鏡檢。

結(jié)果：菌體染成鮮紅色，莢膜染成藍(lán)色。

5.異染顆粒染色

細(xì)菌經(jīng)涂片、干燥、固定，加甲液（見(jiàn)附錄二）染色3?5min,水洗后加乙液染色

1min,水洗，待干、鏡檢。

結(jié)果：菌體染成藍(lán)綠色，異染顆粒染成藍(lán)黑色。

四、不染色標(biāo)本檢查法

細(xì)菌未經(jīng)過(guò)染色呈無(wú)色透明，在顯微鏡下為有折光性的小點(diǎn)，不能判斷細(xì)菌的形態(tài)

和結(jié)構(gòu)特征。因此，不染色標(biāo)本檢查法主要用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力，常用的方法有以下幾

種。

1.壓滴法

用接種環(huán)分別取菌液2?3環(huán)，置于潔凈裁玻片中央。用小鎮(zhèn)子挾一蓋玻片，先使

蓋玻片一邊接觸菌液，然后緩緩放下，覆蓋于菌液上，避免菌液中產(chǎn)生氣泡。先用低倍

鏡找到觀察部位，再換高倍鏡觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。

2.懸滴法

取一潔凈凹玻片，在凹窩四周涂少許凡士林。取一環(huán)菌液于蓋玻片中央，將凹玻片

凹窩對(duì)準(zhǔn)蓋玻片上的菌液，迅速翻轉(zhuǎn)教玻片，用小銀子輕壓蓋玻片，使之與凹玻片粘緊

封閉（見(jiàn)圖2-1）,置顯微鏡下觀察。

圖2-1懸滴法

3.暗視野顯微鏡觀察

將上述經(jīng)壓滴法制成的標(biāo)本片，置于暗視野顯微鏡下觀察，有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑,

在黑色的背景下閃閃發(fā)亮，有明顯的位置移動(dòng)。

觀察要點(diǎn)：有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑，可向不同方向迅速運(yùn)動(dòng)，位置移動(dòng)明顯。無(wú)鞭

毛細(xì)菌不能做真正的運(yùn)動(dòng)，但受水分子的撞擊而呈分子運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)動(dòng)），即在一定范

圍內(nèi)作來(lái)回顫動(dòng)，位置移動(dòng)不大，注意與細(xì)菌的鞭毛運(yùn)動(dòng)相鑒別。

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

實(shí)驗(yàn)三滅菌前的準(zhǔn)備與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備

【目的和要求】

1.熟悉常用玻璃器皿的清洗、滅菌前的包裝準(zhǔn)備。

2.熟悉培養(yǎng)基的種類、主要成分及用途。

3.掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備程序、方法和注意事項(xiàng)。

【試劑與器材】

1.試劑：牛肉膏、蛋白陳、氯化鈉、瓊脂粉、Imol/LNaOH、Imol/LHCl等。

2.器材：試管、吸管、平皿、錐形瓶、量筒、吸管、精密PH試紙、天平、濾紙

等。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一、常用玻璃器材的洗滌和準(zhǔn)備

1.玻璃器材的洗滌

玻璃器材若不清潔，?？捎绊憣?shí)驗(yàn)結(jié)果，如影響培養(yǎng)基的pH值，甚至由于某些化

學(xué)物質(zhì)的存在可抑制微生物的生長(zhǎng)；試管不清潔也可影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，如在pH<3

時(shí)可發(fā)生酸凝集。因此，微生物實(shí)驗(yàn)所用的各種玻璃器材必須清洗干凈后才能使用。

（1）新的玻璃器材：

先用肥皂水煮沸半小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗多次，晾干水后浸于2%HC1內(nèi)數(shù)小時(shí)，

將游離的雜質(zhì)除去，最后用自來(lái)水反復(fù)沖洗除盡殘余HC1后，晾干備用。

（2）用過(guò)的玻璃器材：

1）凡含有培養(yǎng)基或病原微生物的玻璃器材，均應(yīng)先用煮沸或高壓蒸汽滅菌法滅菌,

然后趁熱倒山培養(yǎng)基，用5%肥皂水刷洗，再用自來(lái)水沖凈后倒置架上，晾干備用。

2）試管：作血清反應(yīng)的試管若不含病原微生物，可先用5%熱肥皂水刷洗，再用

自來(lái)水沖洗；若不夠清潔，可先用清潔液（配制法見(jiàn)附錄二）浸泡數(shù)小時(shí)，然后用自來(lái)

水沖洗7次以上，晾干備用。

3）吸管：吸過(guò)病原微生物的吸管，應(yīng)插入盛有消毒液（3?5%來(lái)蘇）的玻璃筒中（筒

底應(yīng)墊紗布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液蓋過(guò)吸管，浸泡24h后，用5%肥皂

水洗滌，再用自來(lái)水沖洗（若無(wú)病原微生物污染，則可用自來(lái)水浸泡或直接用自來(lái)水沖

洗），晾干水后，用清潔液浸泡數(shù)小時(shí)，最后用自來(lái)水沖洗7次以上，隙干備用。

4）載玻片及蓋玻片：用后分別浸入3?5%的來(lái)蘇液中，浸泡24h后，用5%肥皂水

煮沸l(wèi)（）min,再用自來(lái)水沖洗，晾干后于清潔液中浸泡數(shù)小時(shí)，最后用自來(lái)水洗凈，晾

干備用。

5）注射器：用后若無(wú)病原微生物污染，立即用自來(lái)水將注射器及針頭等抽洗干凈;

若有病原微生物污染，則立即進(jìn)行煮沸消毒（含有芽胞菌，則應(yīng)用高壓蒸汽滅菌）。在

消毒或滅菌之前，均應(yīng)先將清水抽入針頭及注射器內(nèi)反復(fù)抽洗幾次，并連同洗出水一起

消毒或滅菌，以免加熱時(shí)有蛋白質(zhì)凝固而阻塞針頭或注射器。若用上述方法不能洗凈，

可再置清潔液中浸泡數(shù)小時(shí)（針頭不能用清潔液泡），取出用自來(lái)水沖洗7次以上，干

燥后備用。

2.常用無(wú)菌器材的準(zhǔn)備

（1）包裝

1）平皿：用紙包好，或盛入金屬盒內(nèi)。

2）試管和錐形瓶：空的或盛有培養(yǎng)基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚紙包于

棉塞外。若是盛有液體培養(yǎng)基的試管，應(yīng)直立并扎成捆，以免滅菌時(shí)傾倒。

3）吸管：于吸口端先墊入少許棉花（不可太松或太緊），然后每支分別用紙包好，

或以數(shù)支放入金屬筒內(nèi)。

4）注射器：最好將內(nèi)芯取出，與外套一起用紙或紗布包好；針頭最好裝入小試管

內(nèi)（管底墊有少量棉花），管口塞上棉塞。

（2）滅菌

上述玻璃器材可用高壓蒸汽滅菌法，也可用干烤法進(jìn)行滅菌。如用干烤法應(yīng)注意控

制溫度和時(shí)間在16（）?17（）C2h,以免燒焦棉塞及外包的紙張等。

注意：任何已滅菌的器材。在使用前不能隨意打開(kāi)，一經(jīng)打開(kāi)則不再認(rèn)為是無(wú)菌的。

二、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備程序和方法

培養(yǎng)基是用人工方法將細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按一定比例配制而成的營(yíng)養(yǎng)基

質(zhì)。按照物理性狀分為：液體、半固體和固體培養(yǎng)基三類，其區(qū)別主要是凝固劑的有無(wú)

和多少；按用途分為：基礎(chǔ)、營(yíng)養(yǎng)、選擇、鑒別、增菌、特殊培養(yǎng)基等。

培養(yǎng)基的成分因種類不同而異，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有般細(xì)菌生K所需耍的基本營(yíng)

養(yǎng)成分，如：蛋白陳、肉浸液（或牛肉膏）、氯化鈉和水，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能為細(xì)菌提供

生命所需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水分，并能調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外的滲透壓，為細(xì)菌提供能量。

其他培養(yǎng)基大多是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊成分（如：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抑菌劑、檢測(cè)基

質(zhì)、指示劑等）配制而成。

1.培養(yǎng)基配制的基本程序

包括：調(diào)配、溶化、矯正pH、過(guò)濾澄清、分裝、滅菌、鑒定等幾個(gè)主要步驟。

（1）調(diào)配：先在錐形瓶或燒杯2加入少量蒸翎水（事先量好），按照培養(yǎng)基的配方

準(zhǔn)確稱取各種成分加入瓶中混合，再將剩余的水沖洗瓶壁。

（2）溶化：將調(diào)配好的混合物置電爐上隔水加熱，使其完全溶解，注意隨時(shí)攪拌,

防止溶液外溢，溶解完畢，應(yīng)補(bǔ)足失去的水分。

（3）矯正PH：用PH比色計(jì)、比色法或精密PH試紙矯正溶液的PH,一般矯正

至7.2?7.6左右。其中PH試紙矯正法操作簡(jiǎn)便，快速，但誤差較大；用PH匕色計(jì)和

比色法測(cè)定PH較為準(zhǔn)確，后者無(wú)需特殊儀器。

比色法：取3支與標(biāo)準(zhǔn)管口徑相同的試管，按下表加樣。

試管號(hào)培養(yǎng)基蒸儲(chǔ)水0.2g/L酚紅

1（測(cè)試管）5ml—0.25ml

2（蒸儲(chǔ)水管）—5ml—

3（培養(yǎng)基管）5ml——

第4管為標(biāo)準(zhǔn)PH比色管（配方見(jiàn)附錄二）。

將4支試管按圖3-1所示插入比色架中進(jìn)行比色。

①0

③①

_______I_______________目測(cè)方向

圖3-1比色法

若測(cè)定管偏酸或偏堿，可分別加入O.lmol/LNaOH、0.1mol/LHC1矯正，直到測(cè)定

管的顏色與標(biāo)準(zhǔn)管相同為止，注意：在加酸或加堿矯正時(shí)要緩慢，并準(zhǔn)確記錄加入的量，

按下式計(jì)算培養(yǎng)基中需加入的量。

計(jì)算：設(shè)5ml培養(yǎng)基矯正PH至7.4需加入0.15mlNaOH,現(xiàn)配制1000ml培養(yǎng)基,

需加入NuOH的量為：

5：1000=0.15：X,則X=（0.15x1000）/5=30ml

為防止培養(yǎng)基因矯正PH而加入過(guò)多的水，可將0.1mol/LNaOH換算成lmol/L

NaOH,則需3ml。在培養(yǎng)基中加入NaOH后需再測(cè)一次PH,如仍未達(dá)到所需PH,再

按上述方法進(jìn)行矯正。

（4）過(guò)濾澄清若培養(yǎng)基有混濁或沉淀，則需過(guò)濾。液體或半固體培養(yǎng)基用濾紙

過(guò)濾，固體培養(yǎng)基在加熱溶化后用絨布或雙層紗布加脫脂棉過(guò)濾。

（5）分裝根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同的容器中，并進(jìn)行包孔。

1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：一般分裝于錐形瓶，滅菌后備用，便于隨時(shí)分裝傾注平板或制備

營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在傾注平板前應(yīng)冷卻至50℃左右，以無(wú)菌操作分裝

于無(wú)菌平皿內(nèi)（直徑9cm的平皿分裝量約13?15ml）,待培養(yǎng)基冷卻后將平皿翻轉(zhuǎn)，即

為瓊脂平板。

2）瓊脂斜面：分裝于試管，分裝量約為試管高度的1/4?1/3,滅菌后趁熱放置成斜

面，斜面長(zhǎng)度占試管長(zhǎng)度的2/3左右，斜面下方保持1cm高。

3）半固體培養(yǎng)基：分裝于試管，量約為試管高度的1/4?1/3,滅菌后趁熱將試管直

立凝固。

4）瓊脂高層培養(yǎng)基：分裝于試管，量為試管高度的2/3,滅菌后趁熱將試管直立凝

固。

（6）滅菌根據(jù)培養(yǎng)基的成分、性質(zhì)采用不同的滅菌方法。

1）高壓蒸汽滅菌法：用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基等耐高溫培養(yǎng)基的滅菌。

2）間歇滅菌法：用于含糖、明膠、血清、牛乳、雞蛋等不耐高溫物質(zhì)配制的培養(yǎng)

基滅菌。

3）水浴低溫滅菌法：將血清、腹水、組織液等配制的培養(yǎng)基在水浴中加熱56?57℃

維持lh,以保持液體狀態(tài)，連續(xù)5~7天，此法較少用。

4）血清凝固器滅菌：用于富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基（如含血清、雞蛋清的培養(yǎng)基）滅

菌，方法是：將分裝好的培養(yǎng)基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75°C30min,

第二天80℃30min,第三天85℃30min,在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育過(guò)

夜。

5）過(guò)濾除菌：用于血清、細(xì)胞培養(yǎng)液的滅菌。

（7）鑒定包括兩項(xiàng)內(nèi)容：

1）無(wú)菌試驗(yàn)：將滅前后的培養(yǎng)基置35℃溫箱孵育24h,無(wú)菌生長(zhǎng)為合格。

2）效果檢驗(yàn)：將已知菌種接種于培養(yǎng)基上，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況、生化反應(yīng)等是

否符合。

（8）保存制備好的培養(yǎng)基需注明制備日期、名稱，置4℃冰箱或冷暗處保存，

但不宜放置過(guò)久。

2.常用培養(yǎng)基的配制和用途（見(jiàn)附錄一）

3.培養(yǎng)基配制的注意事項(xiàng)

（1）在進(jìn)行調(diào)配時(shí)應(yīng)在瓶中先加入少量水，再加入各種固體成分，以免固體成分

粘附在瓶壁上。裝培養(yǎng)基的容器不能用鐵、銅等材質(zhì)的容器，若鐵進(jìn)入培養(yǎng)基中，含量

超過(guò)0.14mg/L時(shí)可抑制細(xì)菌毒素的產(chǎn)生；含銅量超過(guò)O.3mg/L時(shí)可抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

某些特殊成分（如染料、膽鹽、指示劑等）應(yīng)在矯正PH后加入。

（2）如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法：取一個(gè)雞蛋的卵蛋

白加水20mL攪拌至出現(xiàn)泡沫，倒入1000ml液體或溶化的固體培養(yǎng)基，混勻，流通蒸

汽加熱3（）?6（）min,使培養(yǎng)基中的不溶性物質(zhì)附著于凝固蛋白，取出后用紗布加脫脂棉

（固體培養(yǎng)基）或?yàn)V紙（液體或半固體培養(yǎng)基）過(guò)濾。

（3）滅菌后的培養(yǎng)基在進(jìn)行分裝時(shí)應(yīng)注意無(wú)菌操作，傾注平板時(shí)培養(yǎng)基的溫度不

能過(guò)高，否則冷凝水多，影響細(xì)菌的分離并易造成污染；也不能溫度過(guò)低，否則瓊脂過(guò)

早凝固，使平板表面高低不平。

（4）在加熱溶化時(shí)注意溶液不能溢出瓶外，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，若水

分蒸發(fā)，應(yīng)補(bǔ)足失去的水分。

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的接種培養(yǎng)法與生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察

【目的和要求】

1.掌握無(wú)菌技術(shù)，建立無(wú)菌觀念；明確無(wú)菌操作時(shí)注意要點(diǎn)。

2.掌握細(xì)菌的接種、分離培養(yǎng)方法和接種環(huán)的制作方法。

3.熟悉細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察方法。

【試劑與器材】

1.菌種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等。

2.培養(yǎng)基：固體、半固體、液體培養(yǎng)基。

3.其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機(jī)、記號(hào)筆等。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一、細(xì)菌的接種工具

1.接種環(huán)和接種針：其結(jié)構(gòu)包括環(huán)（針）、金屬柄、絕緣柄三部分（見(jiàn)圖4-1）o

其中環(huán)（針）部分最佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且

經(jīng)久耐用，但因?yàn)閮r(jià)格昂貴而限制了其應(yīng)用。目前實(shí)驗(yàn)室常用的是經(jīng)濟(jì)費(fèi)用的

30（）~5（）（）W電熱銀絡(luò)絲。一般要求接種環(huán)長(zhǎng)5?8cm,直徑為2?4mm,定量接種環(huán)的容

量為0.001ml。

相約22cm

2——5mm

5——8cm觸柄約14.5m鬃2

安裝環(huán)（針）的螺口【約8mm）

圖4-1接種環(huán)和接種針

接種環(huán)（針）在使用之前需檢查銀金各絲是否呈直線，若有彎曲，需用吸管或接種環(huán)

的另一端將其壓直；若環(huán)不圓，可將鍥路絲前端放在吸管尖部纏繞一圈，再將鍥谿絲突

出的部分朝內(nèi)壓緊。

接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。

2.L形玻棒：由直徑2?3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。在使用之前用厚紙包扎

后置高壓蒸汽滅菌，或沾取無(wú)水乙醇后在火焰上燒灼滅菌。主要用于液體標(biāo)本涂布接種。

二、細(xì)菌的接種方法

1.液體培養(yǎng)基的接種

該法主要用于細(xì)菌的增菌培養(yǎng)或進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)。

方法：（圖4-2）

（1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許細(xì)菌。

（2）左手拿試管，右手持接種環(huán)，用右手其余手指將試管塞打開(kāi)，試管口通過(guò)火

焰燒灼滅菌。

（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數(shù)次，使細(xì)菌均勻分布于培養(yǎng)基中。

（4）將試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。

（5）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35°。培養(yǎng)18?24h后觀察結(jié)果。

圖4-2液體培養(yǎng)基接種法

2.半固體培養(yǎng)基的接種

該法可用于保存菌種、觀察細(xì)菌的動(dòng)力或進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)。

方法：（圖4-3）

（1）先將接種針在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。

（2）左手拿試管，右手持接種針，將試管塞打開(kāi)后，試管口通過(guò)火焰滅菌，將接

種針從培養(yǎng)基的中心向下垂直穿刺接種至試管底上方約5mm處（勿穿至管底），然后由

原穿刺線退出，

（3）將試管口滅菌后加塞，接種針燒灼滅菌后放回原處。

（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18?24h后觀察結(jié)果。

圖4-3半固體培養(yǎng)基接種法

3.平板劃線接種法

該法可將標(biāo)本中的多種細(xì)菌分散成單個(gè)菌落，有利于細(xì)菌的分純和進(jìn)一步鑒定。

方法：

（1）連續(xù)劃線法（圖4-4）

1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。

2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在泗精燈旁以拇指、

食指和中指將平板蓋撐開(kāi)大約30?45。角，將已挑取細(xì)菌的接種環(huán)先在平板一側(cè)邊緣均

勻涂布，然后運(yùn)用腕力將接種環(huán)在平板上自上而下，來(lái)回劃線。劃線要密，但不能重疊,

充分利用平板的面積，不能劃破瓊脂表面，并注意無(wú)菌操作，避免空氣中的細(xì)菌污染。

3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。

4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。

圖4.4固體培養(yǎng)基連續(xù)劃線法

（2）分區(qū)劃線法（圖4-5）

1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。

2）同上法將平板蓋打開(kāi)約30?45。角，將已挑取細(xì)菌的接種環(huán)在平板一端（1區(qū)）

內(nèi)作來(lái)回劃線，再在2、3、4區(qū)依次劃線，每區(qū)的劃線須有數(shù)條線與上區(qū)交叉接觸，每

劃完區(qū)是否需耍燒灼接種環(huán)依標(biāo)本中的菌量多少而定，每區(qū)線間需保持定距離，線

條要密而不重復(fù)。

3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。

4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35c培養(yǎng)18?24h后觀察結(jié)果。

圖4-5固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法

4.斜面培養(yǎng)基接種法（圖4-6）

斜面培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的純培養(yǎng)，以進(jìn)一步鑒定細(xì)菌或保存菌種。

（1）將接種環(huán)（或接種針）在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后以無(wú)菌操作挑取少許菌

落。

（2）左手拿試管，打開(kāi)試管塞后，試管口通過(guò)火焰滅菌，再將取有細(xì)菌的接種環(huán)

由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作出線劃線。

（3）試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。

（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18?24h后觀察結(jié)果。

圖4-6斜面培養(yǎng)基接種法

5.涂布接種法

本法主要用于活菌計(jì)數(shù)和藥敏試驗(yàn)。

（1）活菌計(jì)數(shù)：取一定稀釋度的菌液0.1ml滴在平板上，用無(wú)菌L型玻璃棒將液

滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后計(jì)數(shù)菌落，則每亳升所含活菌數(shù)二菌

落數(shù)xlOx稀釋倍數(shù)。

（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗(yàn)。先配制一定濃度的菌液，用

無(wú)菌棉簽蘸取菌液后，在管壁上將多余的液體擠去，在MH瓊脂平板上按三個(gè)方向均

勻涂布3次，最后沿平板邊緣涂一周。蓋上平板蓋，置室溫放置5min使平板表面稍干,

然后用無(wú)菌鍛子將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，或向豎在平板表面的牛津小杯內(nèi)加入不同

濃度的藥物，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果，測(cè)定抑菌圈直徑，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

6.傾注培養(yǎng)法

此法常用于標(biāo)本或樣品中活菌計(jì)數(shù)。

（1）方法：

1）將標(biāo)本用無(wú)菌生理鹽水稀釋成不同濃度:10\IO-'10-3、ICT1、10-5等。

2）取不同稀釋度的標(biāo)本各1ml分別注入直徑90mm無(wú)菌平皿，迅速加入溶化并冷

卻至約5（）℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂15mL輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板使之充分混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平板。

3）置35℃溫箱孵育18?24h,計(jì)數(shù)菌落形成單位（colonyformingunit,CFU）,按

下式算出每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)：

1ml標(biāo)本中的活菌數(shù)=全平板CFUX稀釋倍數(shù)

7.細(xì)菌接種的注意事項(xiàng)

（1）細(xì)菌接種過(guò)程中需注意無(wú)菌操作，避免污染，因此每一步操作均需嚴(yán)格按要

求進(jìn)行。操作時(shí)不宜說(shuō)話或?qū)⒖诒强拷囵B(yǎng)基表面，以免呼吸道排出的細(xì)菌污染培養(yǎng)基。

（2）所有操作均需在酒精燈火焰附近進(jìn)行，平皿蓋、試管塞、瓶塞均應(yīng)拿在手上

打開(kāi)（具體見(jiàn)前述），禁止將蓋或塞事先取下放置在桌面上。

（3）取菌種前灼燒接種針（環(huán)）時(shí)要將銀路絲燒紅，燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷

卻再取菌種，以免燒死菌種。

（4）取菌時(shí)注意菌落不要取得太多，應(yīng)蘸取而不宜刮取，否則平板劃線很難分離

出單個(gè)菌落。

（5）平板劃線時(shí)注意掌握好劃線的力度和角度，用力不能過(guò)重，接種環(huán)和培養(yǎng)基

表面大約呈30?40°角，劃線要密而不重復(fù)，充分利用培養(yǎng)基，并注意不能劃破平板。

半固體培養(yǎng)基接種時(shí)注意穿刺線要直，并沿原穿刺線退出。

（6）接種完畢后，需在培養(yǎng)基上做好標(biāo)記再放置溫箱孵育。廢棄的有菌材料（如

玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需滅菌后再清洗。發(fā)生有菌材料污染應(yīng)及時(shí)進(jìn)行

消毒處理。

三、細(xì)菌的培養(yǎng)方法

1.需氧培養(yǎng)法

該法適用于需氧菌和兼性厭氧菌。將接種后的培養(yǎng)基（試管放試管架上，平板底上

蓋下）置35c培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18-24ho大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)速度快，在孵育18~24h后即可見(jiàn)

到生長(zhǎng)現(xiàn)象，但若標(biāo)本中的菌量少或生長(zhǎng)速度慢的細(xì)菌（如結(jié)核分支桿菌），則需培養(yǎng)

3~7天甚至4~8周后才能觀察到生長(zhǎng)現(xiàn)象。

2.CO2培芥法

（l）CCh孵育箱：能自動(dòng)調(diào)節(jié)箱內(nèi)CO2的濃度和溫度，使用方便。

（2）燭缸法：取一有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器，在蓋及磨口處上涂上凡士林。

將接種后的培養(yǎng)基放入缸中，并在缸內(nèi)放一支點(diǎn)燃的蠟燭，加蓋密封。隨著缸內(nèi)蠟燭燃

燒產(chǎn)生的CO2增加，蠟燭逐漸自行熄滅，此時(shí)缸內(nèi)的CO2濃度約為5?10%,置35℃培

養(yǎng)箱孵育18~24h后觀察結(jié)果。（見(jiàn)圖4-7）

圖4-7燭缸法

（3）化學(xué)法（重碳酸鈉-鹽酸法）：按每升容積重碳酸鈉0.4g與lmol/L鹽酸0.35ml

比例，分別將二種試劑置于容器內(nèi)，將容器放置在標(biāo)本缸中，密封后傾斜容器，使二種

試劑接觸混合產(chǎn)生CO2o該法適用于奈瑟菌和布魯菌等苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。

3.微需氧培養(yǎng)：先用真空泵將容器內(nèi)的空氣排盡，再注入5%。2、10%CO2、85%N2

的混合氣體，然后置于35℃培養(yǎng)箱孵育后觀察結(jié)果。該法適用于空腸彎曲菌、幽門(mén)螺

桿菌等微需氧菌的分離培養(yǎng)。

4.厭氧培養(yǎng)法：

（1）厭氧罐培養(yǎng)法：用理化方法使容器內(nèi)形成無(wú)氧環(huán)境，用于專性厭氧菌培養(yǎng)。

常用的方法有抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。

1）抽氣換氣法：將已接種的培養(yǎng)基放入真空干燥缸或厭氧罐中，再放入催化劑把

粒和指示劑美藍(lán)。先用真空泵將缸內(nèi)抽成負(fù)壓99.99kPa（750mmHg）,再充入無(wú)氧氮?dú)?

反復(fù)三次，最后充入80%N2、10%以和10%CO2混合氣體，若缸內(nèi)呈無(wú)氧狀態(tài)，則指

示劑美藍(lán)為無(wú)色。每次觀察標(biāo)本后需重新抽氣換氣，用過(guò)的鈿粒經(jīng)160℃2h干烤后可重

復(fù)使用。

2）氣體發(fā)生袋法（Gas-pak法）：該法需以下二種容器：厭氧罐一一是由透明聚碳

酸酯或不銹鋼制成，蓋內(nèi)有金屬網(wǎng)狀容器，其內(nèi)裝有厭氧指示劑美藍(lán)和用鋁箔包裹的催

化劑把粒；氣體發(fā)生袋一一是一種鋁箔袋，其內(nèi)裝有硼氫化鈉-氯化鉆合劑、碳酸氫鈉-

檸檬酸合劑各1丸和1張濾紙條，使用時(shí)剪去特定部位，注入10ml水，水沿濾紙滲入

到二種試劑中，發(fā)生下列化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生H?和CCh。立即將氣體發(fā)生袋放入罐內(nèi)，密

封嶙蓋，使氣體釋放到罐中。

C6H8Ch+3NaHCO3fNa3（C6H5O7）+3H2O+3CO2t

NaBHH2H2OfNaBCh+4H2t

（2）厭氧袋法：厭氧袋是用無(wú)毒透明、不透氣的復(fù)合塑料薄膜制成。袋中裝有催

化劑把粒和2支安甑，分別裝有Hz、CO?發(fā)生器（化學(xué)藥品，成分同上）、指示劑美藍(lán)。

使用時(shí)將接種細(xì)菌的平板放入袋中，密封袋口，先將袋中裝有化學(xué)藥品的安甑折斷，幾

分鐘后再折斷裝有美藍(lán)的安甑，若美藍(lán)為無(wú)色則表示袋內(nèi)己處于無(wú)氧狀態(tài)，置35c溫

箱孵育。

（3）需氧菌共生法：將已知專性需氧菌（如枯草芽胞桿菌）和待檢厭氧菌分別接

種到2個(gè)大小相同的平板上，將兩者合攏，縫隙用透明膠密封，置35℃溫箱培養(yǎng)，需

氧菌生長(zhǎng)過(guò)程中消耗氧氣，待氧氣耗盡后，厭氧菌即開(kāi)始生長(zhǎng)。

（4）平皿焦性沒(méi)食子酸法:按每100ml容積加入焦性沒(méi)食子酸1g和2.5moKLNaOH

10ml（也可用Na2co3）的比例，先將焦性沒(méi)食子酸放入平皿蓋背面的滅菌紗右中，再

滴入NaOH,立即將接種細(xì)菌的平板扣上，用熔化的石蠟密封平皿和平皿蓋的縫隙，置

35℃溫箱培養(yǎng)。

（5）庖肉培養(yǎng)基法：將庖肉培養(yǎng)基上面的石蠟熔化，用毛細(xì)管吸取標(biāo)本后接種于

培養(yǎng)基中，待石蠟?zāi)毯笾?7℃孵育。用于培養(yǎng)基中的肉渣可吸收氧氣，石蠟?zāi)毯?/p>

起隔絕空氣的作用，從而使培養(yǎng)基內(nèi)呈無(wú)氧狀態(tài)。

（6）厭氧手套箱培養(yǎng)法：厭氧手套箱是目前國(guó)際上公認(rèn)的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之

一。它是一個(gè)密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個(gè)透明面板，板上裝有兩個(gè)手套，可通

過(guò)手套在箱內(nèi)進(jìn)行操作。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門(mén)，內(nèi)門(mén)通箱內(nèi)先關(guān)著。使用時(shí)

將物品放入箱內(nèi)，先打開(kāi)外門(mén)，放入交換室，關(guān)上外門(mén)進(jìn)行抽氣、換氣（H2,CO2,N2）

使之達(dá)到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門(mén)打開(kāi)，將物品移入箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門(mén)。

箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，是利用充氣中的氫在鋼的催化下和箱中殘余氧化合成水的原理。該

箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或?qū)⒎跸涓皆谄鋬?nèi)。該法適于作厭氧菌的大量培養(yǎng)研究。

四、細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察

1.液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象：

渾濁生長(zhǎng)（如葡萄球菌）、沉淀生長(zhǎng)（如鏈球菌）、菌膜生長(zhǎng)（如枯草桿菌）。

觀察要點(diǎn)：注意觀察培養(yǎng)基的透明度、管底和液面上是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象：

（1）無(wú)鞭毛的細(xì)菌：僅沿穿刺線生長(zhǎng)，穿刺線清嘶，周?chē)囵B(yǎng)基透明（如葡萄球

菌）。

（2）有鞭毛的細(xì)菌：沿穿刺線向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)，穿刺線邊緣呈羽毛狀，周?chē)囵B(yǎng)

基變渾濁（如大腸埃希菌）。

觀察耍點(diǎn)：注意觀察穿刺線是否清晰、周?chē)呐囵B(yǎng)基是否混濁。

3.固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象：

菌落：由一個(gè)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖而形成的一個(gè)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)。因來(lái)源相同，同一

個(gè)菌落的細(xì)菌為純種細(xì)菌。不同細(xì)菌菌落的形態(tài)學(xué)特征不同，可以鑒別細(xì)菌。

菌苔：由多個(gè)菌落融合而成，可能含有雜菌。

菌落性狀的描述：大小、形狀、顏色、凸扁、表面光滑度、濕潤(rùn)度、光澤、透明度、

邊緣、粘度、溶血（血平板）、氣味等。

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌的生化反應(yīng)

【目的和要求】

1.掌握細(xì)菌生化反應(yīng)的概念。

2.掌握常用生化反應(yīng)的原理和方法。

3.了解生化反應(yīng)在細(xì)菌鑒定及診斷中的重要意義。

【試劑與器材】

1.菌種：大腸埃希菌、傷寒沙門(mén)菌、產(chǎn)氣腸桿菌。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白陳水、葡萄糖發(fā)酵管、蛋白膿水、硫酸亞鐵（或醋酸鉛）

半固體培養(yǎng)基、西蒙氏或柯氏培養(yǎng)基等。

3.試劑：甲基紅試劑、40%KOH、靛基質(zhì)試劑、3%H2O”1%鹽酸四甲基對(duì)苯二

胺（或1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺）。

4.其他：接種環(huán)（針）、酒精燈、毛細(xì)滴管、生物安全柜、培養(yǎng)箱、水浴箱、濾紙

條等。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

不同細(xì)菌具有不同的酶，對(duì)同一種基質(zhì)（糖、蛋白質(zhì)等）分解代謝的能力不同而可

得到不同的代謝產(chǎn)物，檢查這些代謝產(chǎn)物就可幫助鑒別細(xì)菌，這類試驗(yàn)稱為細(xì)菌的生化

反應(yīng)。生化反應(yīng)在細(xì)菌的鑒定中起著重要的作用，因而為臨床細(xì)菌檢驗(yàn)所常用。

細(xì)菌的生化反應(yīng)很多，本次實(shí)驗(yàn)著重介紹一些最常用、最基本的試驗(yàn)，其余部分可

參見(jiàn)附錄。

、糖（醇、甘）的分解代謝試驗(yàn)

1.葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)

（1）原理：將大腸埃希菌和傷寒沙門(mén)菌分別接種于半固體的葡萄糖發(fā)酵管中，經(jīng)

37℃18-24h培養(yǎng)，大腸埃希菌因?yàn)榉纸馄渲械钠咸烟亲罱K產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。產(chǎn)酸使培養(yǎng)基

中的pH下降因而指示劑顯紅色，產(chǎn)氣，則半固體中有氣泡出現(xiàn)；而傷寒沙門(mén)菌分解葡

萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基雖變紅但其中無(wú)氣泡。通過(guò)觀察培養(yǎng)基顏色變化以及氣體的有

無(wú)即可鑒別細(xì)菌。

（2）方法:

1）葡萄糖發(fā)酵管的制備：取經(jīng)高壓滅菌并經(jīng)加熱融化的半固體瓊脂100mL以無(wú)

菌操作加入經(jīng)煮沸消毒的20%葡萄糖水溶液5ml、1%酸性復(fù)紅指示劑0.5ml,混勻之后，

趁熱倒入小試管并冷卻凝固。

2）細(xì)菌接種、培養(yǎng)：用接種針挑取大腸埃希菌和傷寒沙門(mén)菌分別穿刺接種于半固

體糖發(fā)酵管中，將試管放35℃18~24h培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)基變紅者為細(xì)菌產(chǎn)酸，半固體中有氣泡即產(chǎn)氣。

（4）注意事項(xiàng)：

1）發(fā)酵管的制備、細(xì)菌的接種均應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作。

2）將其中的葡萄糖換成其他的糖（或醇），就可以做成其他糖（或醇）的發(fā)酵管。

3）發(fā)酵管也可以制成液體的，但需在試管中加入一支小倒管以觀察產(chǎn)氣情況，并

可以選用不同的指示劑。

4）培養(yǎng)基的pH應(yīng)控制在7.2?7.4為宜。

臨床應(yīng)用：可用于多種細(xì)菌的鑒別。

2.甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）

（1）原理：某些細(xì)菌如大腸桿菌能將葡萄糖分解成丙酮酸，并進(jìn)一步將丙酮酸分

解成大量有機(jī)酸（甲酸、乙酸、乳酸等）使pH下降至4.4以下，加入甲基紅指示劑后

顯紅色為試驗(yàn)陽(yáng)性。而另一些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌則分解葡萄糖產(chǎn)酸少，并將酸分解生成

醇、酮、醛等，培養(yǎng)基的pH在5.4以上，使甲基紅試劑顯黃色，為試驗(yàn)陰性。

（2）方法：

1）用接種環(huán)挑取大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于葡萄糖蛋白陳水中，置35℃

培養(yǎng)箱，經(jīng)18~24h培養(yǎng)。

2）取出培養(yǎng)物，于試管中滴加幾滴甲基紅試劑，輕輕搖動(dòng)試管，培養(yǎng)液立即顯紅

色者為試驗(yàn)陽(yáng)性，黃色者為陰性。

臨床應(yīng)用：該試驗(yàn)主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別，前者為陽(yáng)性，后者為

陰性。

3.V-P（Voges-Proskauer）試驗(yàn)（伏普試驗(yàn)）

（1）原理：某些細(xì)菌（如產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌）將葡萄糖分解成丙酮酸之后，

能進(jìn)一步使丙酮酸脫竣生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在堿性環(huán)境中被空氣中的氧氧化

成二乙酰，二乙酰與蛋白族中所含精氨酸的呱基發(fā)生反應(yīng)生成紅色的化合物。故在培養(yǎng)

基中加入含股基的化合物（如肌酸或肌酎等），可加速該反應(yīng)。

（2）方法：

1）接種環(huán)取細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白陳水，置35℃培養(yǎng)48h°

2）取出，按每毫升加入含0.3的肌酸或肌酊的40%KOH溶液0.1ml,放48?50

C水浴2h（或37-C4h）,充分搖動(dòng)后，觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)液變紅色為陽(yáng)性。

臨床應(yīng)用：主要用于產(chǎn)氣腸桿菌和大腸埃希菌的鑒別，產(chǎn)氣腸桿菌V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，

后者為陰性。

二、蛋白質(zhì)（或氨基酸）代謝試驗(yàn)

1.靛基質(zhì)（口引喙）試驗(yàn)

（1）原理：某些細(xì)菌（如大腸埃希菌等）能分解蛋白月東中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)（咧

咪），當(dāng)加入靛基質(zhì)試劑（對(duì)二甲氨基苯甲醛）之后，靛基質(zhì)與對(duì)二甲氨基苯甲醛作用

生成紅色化合物一玫瑰靛基質(zhì)。

（2）方法：

1）將細(xì)菌種于蛋白膿水培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24?48h。

2）取出，滴加數(shù)滴旋基質(zhì)試劑于培養(yǎng)基的液面上，靜置半分鐘觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果觀察：液面的試劑變紅色為試驗(yàn)陽(yáng)性，黃色為陰性。

（4）注意事項(xiàng)：靛基質(zhì)試劑具有較強(qiáng)的腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)小心，勿滴落至皮膚、

衣服或其他物品上。

臨床應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。

2.硫化氫試驗(yàn)

（1）原理：某些細(xì)菌（如變形桿菌）能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半

胱氨酸等），產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇到培養(yǎng)基中的重金屬離子如Pb?+或Fe2+等，形成硫

化鉛或硫化亞鐵黑色沉淀。

（2）方法；將待測(cè)細(xì)菌穿刺接種于含硫酸亞鐵（或醋酸鉛）的半固體培養(yǎng)基中，

35℃培養(yǎng)24-48小時(shí)后觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果觀察：穿刺線周?chē)霈F(xiàn)黑色者為陽(yáng)性.

臨床應(yīng)用：常用于腸桿菌科屬間的鑒別，沙門(mén)菌屬（甲型副傷寒沙門(mén)菌除外）、愛(ài)

德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸掾酸桿菌屬和變形桿的屬等