T-GDTL 011-2020 抗菌、抗病毒涂料

ICS

87.040G51 T/GDTL

抗菌、抗病毒涂料2020-06-28

發(fā)布 2020-08-01

實(shí)施

T/GDTL

011—2020本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)

《團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)化

第1部份：良好行為指南》和

1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》的要求和格式起草。本標(biāo)準(zhǔn)由廣東省涂料行業(yè)協(xié)會(huì)提出和歸口。本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位：廣東省涂料行業(yè)協(xié)會(huì)、廣東省微生物研究所本標(biāo)準(zhǔn)參加起草單位：廣東維拓化工股份有限公司、廣東巴德士化工有限公司、立邦涂料（中國(guó)）公司。標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳金愛(ài)、黎玉蓮、譚毅、嚴(yán)修才、熊紹泊、區(qū)英強(qiáng)、鄒建明、田太陽(yáng)、黎呈鋒、麥宗毅、黃榮軍、蘇錦明、趙文海、楊孝國(guó)、李偉、閆樹(shù)德、陳耀祖、劉永龍。本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。T/GDTL

011—20201

范圍價(jià)、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)識(shí)和包裝等要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于具有抗菌、抗病毒功能的各種涂料產(chǎn)品。2

規(guī)范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

漆膜耐霉菌性測(cè)定法GB/T

色漆、清漆和色漆與清漆用原材料

取樣GB/T

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T

涂料試樣狀態(tài)調(diào)節(jié)和試驗(yàn)的溫濕度GB/T

涂料產(chǎn)品包裝標(biāo)志GB/T

13491

涂料產(chǎn)品包裝通則GB

15258

化學(xué)品安全標(biāo)簽編寫(xiě)規(guī)定GB

19258

紫外線殺菌燈GB

19489

實(shí)驗(yàn)室

生物安全通用要求GB/T

抗菌涂料（漆膜）抗菌性測(cè)定法和抗菌效果ISO

18184:2019

抗病毒紡織品的測(cè)試3

術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1抑菌

抑制細(xì)菌、真菌、霉菌等微生物的生長(zhǎng)繁殖的作用叫做抑菌。[GB/T

21866-2008,術(shù)語(yǔ)和定義

3.2殺菌

sterilization殺死細(xì)菌、真菌、霉菌等微生物營(yíng)養(yǎng)體和繁殖體的作用叫做殺菌。[GB/T

21866-2008,術(shù)語(yǔ)和定義

3.3抗菌

antibacterial抑菌和殺菌作用的總稱為抗菌。99%95%95%90%T/GDTL

011—2020[GB/T

21866-2008,術(shù)語(yǔ)和定義

3.4病毒

virus只含一種核酸（DNA

或

）、結(jié)構(gòu)區(qū)別與其它有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物（原核及真核生物），營(yíng)專性細(xì)胞內(nèi)寄生，必須在宿主內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖的一類特定的微生物。[ISO

術(shù)語(yǔ)和定義

3.5病毒感染滴度

在單位體積的細(xì)胞溶解產(chǎn)物或溶液中具有感染性的病毒顆粒數(shù)目。[ISO

18184:2019,術(shù)語(yǔ)和定義

3.6空蝕斑形成單位

PFU

forming

units表示單位體積中感染病毒的濃度單位。[ISO

18184:2019,術(shù)語(yǔ)和定義

3.10]3.7病毒滅活率

經(jīng)過(guò)抗病毒處理的樣品與未經(jīng)抗病毒處理的樣品在接種病毒培養(yǎng)后病毒感染滴度差值的百分率3.8抗菌涂料

antibacterialcoating具有抗菌作用的涂料。[GB/T

21866-2008,術(shù)語(yǔ)和定義

3.9抗病毒涂料

具有抗病毒功能的涂料。4

產(chǎn)品分類Ⅱ級(jí)。5

要求5.1

抗菌要求產(chǎn)品的抗菌性能應(yīng)符合表

1

的要求。表

表

1

抗菌性能要求

2hH3N290%90%EV71H3N285%85%EV71T/GDTL

011—2020表

1

表

1

抗菌性能要求

(續(xù))產(chǎn)品的抗病毒性能應(yīng)符合表

2

的要求。表

2

表

2

抗病毒性能要求當(dāng)產(chǎn)品同時(shí)具有抗菌和抗病毒功能時(shí)，應(yīng)符合表

1

和表

2

的要求。5.4

性能及安全要求5.4.1

標(biāo)準(zhǔn)要求。5.4.2

3

的要求。5.4.3

體造成危害或?qū)Νh(huán)境造成二次污染。

a[(3/1)ECMI/MI(3/1)]15

500

500

(MI)200

(DCOIT)500

750

IPBC1500

ZPT1500

(3-500

50

T/GDTL

011—20205.4.4

用完的抗菌、抗病毒涂料不得在現(xiàn)場(chǎng)處理，避免造成環(huán)境污染。表

3

表

3

生物殺傷劑使用量6.1

實(shí)驗(yàn)室及一般要求6.1.1

抗菌、抗病毒試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合

GB

19489

規(guī)定的生物安全管理和設(shè)施條件要求。6.1.2

應(yīng)配備試驗(yàn)人員的防護(hù)服、口罩、帽子等防護(hù)用品，并由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員進(jìn)行試驗(yàn)。6.1.3

除非另有規(guī)定，在試驗(yàn)中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑，所用水應(yīng)為符合

水。6.2

抗細(xì)菌性能按

GB/T

21866-2008

的規(guī)定進(jìn)行。6.3

抗細(xì)菌耐久性能按

GB/T

21866-2008

的規(guī)定進(jìn)行。6.4

抗霉菌性能按

GB/T

的規(guī)定進(jìn)行。6.5

抗霉菌耐久性性能在進(jìn)行抗霉菌耐久性試驗(yàn)前，試板應(yīng)進(jìn)行如下預(yù)處理。試板完全浸泡在盛有

25℃水的玻璃水槽或

h

h。浸泡后試板涂膜表面不應(yīng)有起泡、脫落、開(kāi)裂等現(xiàn)象。取出后采用

1

支

、波長(zhǎng)為

253.7

nm

的符合GB

19258

的紫外燈，紫外燈距離試板

0.8

m～1.0

照射

100

h，經(jīng)預(yù)處理的試板抗霉菌耐久性性能按GB/T

的規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)。6.6

抗病毒性能T/GDTL

011—2020按附錄

A

的規(guī)定進(jìn)行。6.7

抗病毒耐久性能按附錄

A

的規(guī)定進(jìn)行。7

檢驗(yàn)規(guī)則7.1

檢驗(yàn)分類產(chǎn)品檢驗(yàn)分出廠檢驗(yàn)和型式檢驗(yàn)。7.1.1

出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目按相關(guān)涂料產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行。7.1.2

型式檢驗(yàn)項(xiàng)目包括本標(biāo)準(zhǔn)中抗菌、抗病毒或兼具抗菌和抗病毒功能所對(duì)應(yīng)的全部技術(shù)要求。7.1.3

在正常生產(chǎn)情況下，每年至少進(jìn)行一次型式檢驗(yàn)。7.1.4

在下列情況之一時(shí)，應(yīng)隨時(shí)進(jìn)行型式檢驗(yàn)：——新產(chǎn)品最初定型時(shí)；——生產(chǎn)配方、工藝及原材料有較大改變時(shí)；——停產(chǎn)三個(gè)月后又恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)。7.2

檢驗(yàn)結(jié)果的判定7.2.1

檢驗(yàn)結(jié)果的判定按

8170

中修約值比較法進(jìn)行。7.2.2

1

級(jí)時(shí)，該抗菌涂料應(yīng)判定為Ⅱ級(jí)。7.2.3

級(jí)時(shí)，該抗病毒涂料應(yīng)判定為Ⅱ級(jí)。7.2.4

性能結(jié)果或抗病毒性能結(jié)果中有

1

項(xiàng)僅達(dá)到Ⅱ級(jí)時(shí)，該抗菌抗病毒涂料應(yīng)判定為Ⅱ級(jí)。7.2.5

應(yīng)檢項(xiàng)目的檢驗(yàn)結(jié)果均達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)要求時(shí)，該試驗(yàn)樣品為符合本標(biāo)準(zhǔn)要求。8

標(biāo)志、包裝和貯存8.1

標(biāo)志8.1.1

按

9750

的規(guī)定進(jìn)行。8.1.2

產(chǎn)品中使用的生物殺傷劑應(yīng)按

GB

15258

的規(guī)定進(jìn)行有危害性標(biāo)識(shí)。8.1.3

標(biāo)志或說(shuō)明書(shū)應(yīng)明確施工狀態(tài)下的施工配比、施工要求。8.1.4

活率以及耐久性技術(shù)指標(biāo)。8.1.5

按本標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格的產(chǎn)品可在包裝標(biāo)志上明示。8.2

包裝按

13491

包裝要求的規(guī)定進(jìn)行。T/GDTL

011—20208.3

貯存存條件下，自產(chǎn)品生產(chǎn)之日起，包裝完好的產(chǎn)品保質(zhì)期應(yīng)不少于

6

個(gè)月,并在包裝標(biāo)志上明示。T/GDTL

011—2020附錄

A（規(guī)范性附錄）抗病毒涂料的試驗(yàn)方法A.1

主要設(shè)備A.1.1

高壓滅菌鍋：溫度

121℃±2℃，壓力

103kPa±5kPa。A.1.2

干熱滅菌箱：溫度

160

℃±2

℃和

180℃℃。A.1.3

天平：,精度

0.01g；精度

0.1mg。A.1.4

水浴鍋：溫度

37

℃±2

℃，50

℃±2

℃或

℃

℃。A.1.5

CO2培養(yǎng)箱：5%

2、溫度

34

℃

℃和

37

℃±2

℃。A.1.6

冰箱：溫度

2

℃～8

℃、-20

℃

℃和

℃±2

℃。A.1.7

PH

計(jì)：配玻璃電極。A.1.8

離心機(jī)：溫度

4

℃±2

℃，

g。A.1.9

培養(yǎng)箱：保持溫度

25

℃±2

℃,34

℃±2

℃或

37

℃

℃.A.1.10

玻璃和/或塑料吸管：50

mL±0.5

mL；25

mL±0.25

mL；10

；5

mL。微量吸管：刻度小于體積的

。A.1.11

過(guò)濾膜：孔徑

μm。A.1.12

倒置顯微鏡A.1.13

液氮罐A.1.14

培養(yǎng)容器A.1.15

A.1.16

6

試驗(yàn)的

孔板。A.1.17

微生物試驗(yàn)用的渦旋器、鑷子、量筒、燒瓶、試管、燒杯、離心管等。A.2

主要試劑及材料列配方制備試劑，也可以按照所操作的病毒及宿主的情況自行購(gòu)買適用的等效商品化試劑。A.2.1

符合

GB/T

6682

規(guī)定的三級(jí)水。A.2.2

最低必須培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基。A.2.3

7.5%碳酸氫鈉溶液75

g

碳酸氫鈉,加水

1000

。A.2.4

福爾馬林溶液37%甲醛溶液

mL,加水

900

mL。A.2.5

亞甲藍(lán)溶液，用于細(xì)胞染色。水

mL，亞甲藍(lán)

0.375

g,

1

mol/L

氫氧化鈉溶液

6.25

溶解并混合均勻。A.2.6

滅活胎牛血清：A.2.6.1

將滅活胎牛血清置于溫度低于℃的冰箱保存，使用前將冰凍的滅活胎牛血清置于

37℃水浴中直至解凍。A.2.7.1

水

800mL,硫酸卡那霉素

60最低必需（eagle

s）培養(yǎng)基

9.53g。T/GDTL

011—2020A.2.7.1

水

800mL,硫酸卡那霉素

60最低必需（eagle

s）培養(yǎng)基

9.53g。A.2.6.2

如果需要自行進(jìn)行胎牛血清滅活，應(yīng)遵守水浴調(diào)至

℃，30

至滅活原則。A.2.7

生長(zhǎng)培養(yǎng)基,A.2.7.2

溶解并混合均勻再加水至

,然后添加

碳酸氫鈉溶液和

熱滅活胎牛血清。A.2.8

細(xì)胞培養(yǎng)維持液（維持介質(zhì)）水

800mL,硫酸卡那霉素

mg,最低必需（EMEM）培養(yǎng)基

g，溶解并混合均勻加水至

，混合液使用孔徑

μm

過(guò)濾膜過(guò)濾,然后添加

15mL

的

碳酸氫鈉溶液。A.2.9

雙倍濃度維持培養(yǎng)基水

800mL,硫酸卡那霉素

mg,最低必需培養(yǎng)基

g,溶解并混合均勻加水至

mL，混合液使用孔徑

過(guò)濾膜過(guò)濾。A.2.10 mol/L

磷酸緩沖液

PBS（-）氯化鈉

8g,氯化鉀

0.2g,十二水合磷酸氫二鈉

g,磷酸二氫鉀

0.2g,溶解并混合均勻加水定容至1000。在高壓鍋滅菌，溫度（121±2）℃，壓力（103±5）kPa

保持

15。A.2.11

牛胰蛋白酶

溶液（-）A.2.11.1

取

磷酸緩沖液

（-）

2

h，混合液使用孔徑

μm

過(guò)濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后未使用的分裝在試管保存于-A.2.11.2

磷酸緩沖液

（-）

A.2.11.1）保存在-

37℃水浴中直至解凍。A.2.12

胰蛋白酶

溶液0.01mol/L

磷酸緩沖液

（-）1000mL

2.5g

g

B2，EDTA，溶解充分并混合?；旌弦菏褂每讖?/p>

過(guò)濾膜過(guò)濾,保存在-置于

A.2.13

DEAE-葡聚糖溶液DEAE-葡聚糖

20g

加水

mL

μm

過(guò)濾膜過(guò)濾。A.2.14

瓊脂培養(yǎng)基用于蝕斑試驗(yàn)，在使用前混合

A

液和

B

液。A.2.14.1

A

溶液A.2.14.1.1雙倍濃度維持培養(yǎng)基

DEAE-葡聚糖溶液

mL;

7.5%碳酸氫鈉溶液

mL

混合均勻。A.2.14.1.2

3

牛胰蛋白酶

PBS

溶液（-）。上述

或

A.2.14.1.2

A.2.14.2

B

溶液細(xì)胞培養(yǎng)瓊脂

加水

mL,

kPa，15

min。上述溶液在水浴中保持～60)℃至使用。A.2.14.3 使用前等比混合

A

B

溶液（體積比

1:1）。A.2.15

SCDLP

培養(yǎng)基水

mL，酪蛋白胨

g，大豆蛋白胨

，氯化鈉

，磷酸氫二鉀

，葡萄糖

2.5g，卵磷脂

鈉或鹽酸調(diào)節(jié)溶液至

PH

為

7.0±0.2

121℃，壓力

，min。A.3

試驗(yàn)準(zhǔn)備H3N2EV

71MDCK

Vero

EMEM

EMEM

將低溫儲(chǔ)存的宿主細(xì)胞置

37

75cm

細(xì)胞培養(yǎng)瓶里加入將低溫儲(chǔ)存的宿主細(xì)胞置

37

75cm

細(xì)胞培養(yǎng)瓶里加入

20

細(xì)胞生長(zhǎng)培A.3.1從低溫保存中復(fù)蘇宿主細(xì)胞2養(yǎng)基（A.2.7），再加入解凍的宿主細(xì)胞。將培養(yǎng)瓶置于

CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)

24

h。使用顯微鏡觀察細(xì)胞，如證實(shí)增殖再進(jìn)行下一步，如沒(méi)有增殖則繼續(xù)培養(yǎng)。A.3.2

宿主細(xì)胞的傳代培養(yǎng)A.3.2.1

確認(rèn)

A.3.1.1

宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到

以上后，棄掉培養(yǎng)瓶舊培養(yǎng)基,添加

5

mLPBS

溶液（A.2.11）

2

A.2.11

CO2

375±1）

5

mL

A.2.8散細(xì)胞，此過(guò)程應(yīng)避免細(xì)胞損傷。A.3.2.2

1

A.3.2.1A.2.820

mL。將培養(yǎng)瓶置于

CO2培養(yǎng)箱中，37

℃培養(yǎng)，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況可傳代或換液。A.3.3

細(xì)胞培養(yǎng)作感染病毒滴定度測(cè)定

6

孔板,

CO2培養(yǎng)箱中，在

℃中培養(yǎng)

18h～，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后即可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。A.3.4

測(cè)試病毒的準(zhǔn)備A.3.4.1

病毒株和宿主細(xì)胞本標(biāo)準(zhǔn)使用的病毒、宿主細(xì)胞和介質(zhì)見(jiàn)表

A.1.依據(jù)使用要求，可增加選用其他商定病毒作檢驗(yàn)病毒。表

A.1

本標(biāo)準(zhǔn)使用的病毒、宿主細(xì)胞和介質(zhì)表

A.1

本標(biāo)準(zhǔn)使用的病毒、宿主細(xì)胞和介質(zhì)A.2.8

或

50/mL)～

或

50/mL)

1

A.3.4.2.1

移除已培養(yǎng)好單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，使用新鮮的細(xì)胞維持培養(yǎng)基（A.2.8）清洗培養(yǎng)細(xì)胞表面

2

次。A.3.4.2.2

373 4稀釋后的流感病毒置培養(yǎng)好的細(xì)胞表面（A3.4.2.1），并將其置于

34℃中

CO2培養(yǎng)箱中保持

1

h毒吸附細(xì)胞，之后在細(xì)胞瓶?jī)?nèi)加入含

30

μL

胰蛋白酶（）的維持培養(yǎng)基（A.2.8）

mL胞瓶置于

2培養(yǎng)箱中，在

34

℃中培養(yǎng)

1

d～3

d

使病毒增殖。A.3.4.2.3

4

℃，1000

,離心

15

。離心后取上清液，即為流感病毒混懸液。分裝后存儲(chǔ)在℃低溫冰箱中。A.3.4.2.4

測(cè)定病毒滴度是否大于10

PFU/mL(或50/mL),如滴度小于

或TCID50/mL)，則從A.3.4.2.4

測(cè)定病毒滴度是否大于10

PFU/mL(或50/mL),如滴度小于

或TCID50/mL)，則從A.2.8

PFU/mL(或

50/mL)～

或

50/mL)

1

mLA.3.4.3.4

測(cè)定病毒滴度是否大于

10

或

50/mL),

10

PFU/mL(或

TCID/mL)，則7 737檢測(cè)用的病毒懸液，若不立即使用，可暫存于2℃～8℃冰箱。A.3.4.3

EV71

病毒A.3.4.3.1

移除已培養(yǎng)好單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，使用新鮮的細(xì)胞維持培養(yǎng)基（A.2.8）清洗培養(yǎng)細(xì)胞表面

2

次。A.3.4.3.2

373 4稀釋后的流感病毒至培養(yǎng)好的細(xì)胞表面（A3.4.2.1），并將其置于

37℃中

CO2培養(yǎng)箱中保持

1

hA.2.8

CO2

37℃中培養(yǎng)

1

d～3d

使病毒增殖。A.3.4.3.3

EV71

A.3.4.2.2

4℃，1000

離心

15

min。離心后取上清液，即為

病毒混懸液。分裝后存儲(chǔ)在℃低溫冰箱中。7 7從頭開(kāi)始重新制備。使用前，將冷凍的病毒放入

37℃水浴，使其迅速解凍。解凍后稀釋至合適滴度，即為檢測(cè)用的病毒懸液，若不立即使用，可暫存于

2℃～8℃冰箱。A.3.5

試板制備A.3.5.1

產(chǎn)品按

GB/T

3186

的規(guī)定進(jìn)行取樣，也可按商定的方法取樣。取樣量根據(jù)試驗(yàn)需要而定。A.3.5.2

按產(chǎn)品明示的配比或稀釋比例，按規(guī)定的配比或稀釋攪勻后制板，如產(chǎn)品未明示稀釋比例時(shí)，攪拌均勻后制板。若產(chǎn)品明示了稀釋比例范圍時(shí)，應(yīng)取其中間值。A.3.5.3

除另有商定外，制備抗病毒試板（C

樣）底材為不銹鋼片、馬口鐵片或鋁片，抗病毒涂料施涂

污等。以木材為底材的試板，要求漆膜覆蓋整塊試板。試板涂刷后按

規(guī)定的條件干燥

7d。試板尺寸為

50mm。A.3.5.4

按

A.3.5.3

B

樣）,B

物質(zhì)和必要溶劑，不含任何抗病毒劑、抗菌劑、防霉劑、防腐劑等添加助劑物質(zhì)。試板尺寸為

50mm。

A.3.5.5

在試驗(yàn)前所有試板均需要進(jìn)行滅菌處理，一般可采用紫外照射

30

的方式。A.4

試驗(yàn)程序A.4.1

預(yù)試驗(yàn)抑制效果。A.4.1.1

細(xì)胞毒性試驗(yàn)104～6）×10

4～6）×10

PFU/mL（或

50

9

25℃放置

min用維持培養(yǎng)基將病毒懸液濃度調(diào)整在1×10

或～5×10

PFU/mL(或之間取空白對(duì)照試板（B樣）及抗病毒試板（C樣）各3片，放在培養(yǎng)皿中，加入10

mLSCDLP肉湯或其他板并進(jìn)行培養(yǎng)觀察，觀察細(xì)胞有無(wú)病變。若未觀察到細(xì)胞毒性，繼續(xù)下一步驟。若觀察到有細(xì)胞毒性，則需酌情更改、修改培養(yǎng)基配方或增加中和劑的使用量。若采用10

中和劑回收洗脫有困難，則可增加中和劑溶液用量。若中和劑的配方修改、更改或增加，則在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)使用相同的洗脫液或中和劑。A.4.1.2

驗(yàn)證細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性和洗脫液終止殺病毒的性能A.4.1.2.1

試驗(yàn)步驟B

C

3

mLSCDLP

肉湯或其

5

mLSCDLP

3

5

μL

制備好的濃度4測(cè)試陰性對(duì)照、空白對(duì)照試板（B

樣）及抗病毒試板（C

樣）的洗脫回收液中病毒的滴度。A.4.1.2.2

試驗(yàn)有效性的條件BC滿足式（1）和式（2）的要求：|Sn

-

Su|

≤

……………(1)|Sn

-

St|

≤

……………(2)其中：Sn—3個(gè)SCDLP肉湯培養(yǎng)基陰性對(duì)照回收的平均病毒滴度對(duì)數(shù)值，單位為（50）；Su—3個(gè)空白對(duì)照試板（B樣）回收的平均病毒滴度對(duì)數(shù)值，單位為PFU/mL（50）；St—3個(gè)抗病毒試板（C樣）回收的平均病毒滴度對(duì)數(shù)值，單位為PFU/mL（50/mL）。若以上結(jié)果超過(guò)0.5，中和劑的配方應(yīng)該酌情修改或更改，或增加中和劑的量。若中和劑的配方修改或更改，或增加用量，則在正式試驗(yàn)中應(yīng)用使用相同的中和劑。A.4.2

正式試驗(yàn)A.4.2.1

試樣準(zhǔn)備B樣）6C樣）3面朝上。A.4.2.2

試樣接種按照檢測(cè)病毒的制備步驟，制備試驗(yàn)用病毒。試驗(yàn)前，將冷凍的病毒置37℃水浴，使其迅速融化。7 7作接種液，若接種液不立即使用，可暫存于4℃冰箱。11T/GDTL

011—2020用移液管吸取

mL40

mm×40mm薄膜蓋于接種好的病毒蓋上薄膜后，蓋上培養(yǎng)皿蓋。

mL

A.4.2.3

接種后試樣的培養(yǎng)除特別說(shuō)明外，接種后的試板，在（）℃、相對(duì)濕度不小于的條件下培養(yǎng)2

h。各方也可以協(xié)商采用不超過(guò)24

h的其它培養(yǎng)時(shí)間，并在報(bào)告中注明。A.4.2.4

病毒的洗脫回收A.4.2.4.1

接種后，立即對(duì)已接種的

3

片空白對(duì)照試板（B

樣）進(jìn)行病毒回收。在各培養(yǎng)皿中加入

mLSCDLP

度測(cè)定。測(cè)定方法見(jiàn)

?？梢允褂闷渌幕厥障疵摲椒??；厥辗椒ǖ淖兏赡軙?huì)影響所測(cè)得的抗病毒活性結(jié)果，應(yīng)充分證實(shí)其有效性A.4.2.4.2

A.4.2.4.1

處理

3

B

3

C

然后立即對(duì)試樣上的病毒滴度進(jìn)行測(cè)定。A.4.3

感染病毒滴度測(cè)試（蝕斑法）A.4.3.1

操作步驟A.4.3.1.1

在

6

孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔內(nèi)培養(yǎng)單層細(xì)胞（A.3.3），并用顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)觀察到長(zhǎng)滿的單層細(xì)胞時(shí)，棄掉舊的培養(yǎng)基。使用細(xì)胞維持培養(yǎng)基（A.2.8）清洗細(xì)胞表面

2

次。A.4.3.1.2

洗脫液原液及每個(gè)梯度的稀釋液均接種

2

孔用于測(cè)試，接種量

。如果原液接種到第一個(gè)

2

2

孔接種

2

A.2.8陰性對(duì)照。A.4.3.1.3

將接種后的

6

孔板置于表

A.2

所列溫度的

CO2

1h隔～A.2.8）加到

6

孔板上，清洗表面，然后棄掉多余的培養(yǎng)基。A.4.3.1.4

加入

A.2.14

左右讓瓊脂培養(yǎng)基凝固。待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，倒置細(xì)胞板，放入

5%

2培養(yǎng)箱中，流感病毒于

34℃培養(yǎng)

4d～7d，腸道病毒于

℃培養(yǎng)

2

d～3

d

A.2.4）

1h

3mL

min

對(duì)細(xì)胞染色。染色完畢，棄掉亞甲基藍(lán)溶液（A.2.5），用水沖洗一下。確認(rèn)細(xì)胞染色。計(jì)算斑的數(shù)量(白色斑點(diǎn))。A.4.3.1.5

計(jì)數(shù)蝕斑的數(shù)量（白色斑點(diǎn)），取兩個(gè)孔的平均值。蝕斑試驗(yàn)示例見(jiàn)圖

A.1。12EV713437

1/101/1001/10001/10nC1C2C3C4CNT/GDTL

011—2020圖

A.1

蝕斑試驗(yàn)示例表

A.2

CO2表

A.2

CO2培養(yǎng)箱條件A.4.3.2.1

60

個(gè)以內(nèi),60

個(gè)時(shí)，空斑的邊界將不清晰）?？瞻叩臄?shù)量以每個(gè)稀釋度上兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均值計(jì)。A.4.3.2.2

對(duì)