T-CVMA 173-2024 豬偽狂犬病病毒gB蛋白磁微?；瘜W(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)方法

T/CVMA173—2024豬偽狂犬病病毒gB蛋白磁微?；瘜W(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)方法MagneticparticlechemiluminescentimmunoassaydetectionofgBantibodiesagainstpseudorabiesvirus2024-7-4發(fā)布2024-7-4實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布I本文件由洛陽(yáng)現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司病預(yù)防控制中心、河南科技大學(xué)、洛陽(yáng)萊普生信息科技有12規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范CLIA：化學(xué)發(fā)光免疫分析（ChemiluminePRV:豬偽狂犬病毒（PseudorabiesVirus）RLU：相對(duì)光單位發(fā)光值（RelativeLightUnit）carbodiimidehydrochlori2本文件采用磁微粒化學(xué)發(fā)光——競(jìng)爭(zhēng)法原理，用豬偽狂犬病毒gB重組蛋白包被磁微粒，酶標(biāo)單克抗原-待測(cè)抗體復(fù)合物；抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物催化發(fā)光底物液發(fā)出光子形成發(fā)光值（RLU其發(fā)光強(qiáng)度與豬偽狂犬病毒gB抗體的含量成反比。根據(jù)樣本發(fā)光值與陰性對(duì)照發(fā)光值的比值，判斷豬偽狂犬病毒gB抗體水平，比值越大，說(shuō)明樣本中豬偽狂犬病毒gB抗體水平越低；比值越小，說(shuō)明樣本中豬偽狂6.1包被磁微?；鞈乙?，按照附錄A制6.2酶標(biāo)單克隆抗體（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的豬偽狂按照NY/T541中規(guī)定進(jìn)行樣本的采集與處理，期間做好個(gè)人防護(hù)。按常規(guī)方法抽取2mL～3mL血按照NY/T541中規(guī)定進(jìn)行血清樣本的存放與運(yùn)輸。血清樣本若在一周內(nèi)檢測(cè)，置2℃~8℃條件下保存。若超過(guò)一周檢測(cè)，置于-20℃以下冷凍保存。運(yùn)將待檢樣品從2℃~8℃或-20℃冰箱取出，靜置至室溫。3參照磁微粒化學(xué)發(fā)光儀器系統(tǒng)操作說(shuō)明，按b）加磁微粒混懸液。每孔分別加入磁微?；鞈乙?0μL。c）孵育?；靹蚝?7℃溫育30min。d）洗滌。使用磁鐵吸附磁微粒10s，使其聚集于孔壁，棄去上清液。加入洗滌液30f）讀值。檢測(cè)完成后，儀器自動(dòng)計(jì)算并讀取數(shù)據(jù)結(jié)果，打印報(bào)告。如本次檢測(cè)完畢則清空廢液、9試驗(yàn)成立條件S/N≤0.5，為豬偽狂犬病病毒gB抗體陽(yáng)性；S/N＞0.5，為豬偽狂犬病病毒gB抗體陰性。4取1mL磁微粒原液進(jìn)行磁分離至上清澄清，棄去上清；移液器移取1mL加入1mL4mg/mLEDC溶液，蓋緊瓶蓋/容器封口，室溫條件下活化反應(yīng)60min。A.2洗滌A.3包被豬偽狂犬病毒重組蛋白gB包被抗原。蓋緊瓶蓋/容器封器，2℃~8℃條件下反應(yīng)120min。A.4封閉將反應(yīng)容器進(jìn)行磁分離至上清澄清，棄去上清；移液器精確移取4mL磁微粒洗滌液加入反應(yīng)容器液加入反應(yīng)容器內(nèi)；以100r/min混合15min，最終進(jìn)行磁分離至上清澄清，棄去上清。A.5制備后儲(chǔ)存準(zhǔn)確量取磁微粒保存液100mL，以100r/min混5稱取24.23gTris（三羥甲基氨基甲烷）溶于800mL純水中，充分?jǐn)?用豬偽狂犬病滅活疫苗免疫豬偽狂犬病gB抗體陰性健康豬，耳根后肌肉注射，首次免疫28日后進(jìn)的0.04%加入Proclin-300防腐，經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾除菌，無(wú)菌分裝，作為陽(yáng)性對(duì)照，置2℃~8℃保存挑選豬偽狂犬病gB抗體陰性健康豬，經(jīng)前腔靜脈大量采血分離血活30min后，