糧油檢驗(yàn) 糧食中游離氨基酸含量的測(cè)定方法編制說明

1《糧油檢驗(yàn)糧食中游離氨基酸含量的測(cè)定方法》編制說明劃的通知》（質(zhì)檢辦便函〔2012〕5號(hào)）要求，由國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究由于我國(guó)收購(gòu)的谷物、大豆類型及品種多而復(fù)善粒、裂紋及破碎粒，儲(chǔ)藏過程存在水分遷移現(xiàn)象（如冬夏季節(jié)分別在小麥倉(cāng)芯頂及加工品游離α-氨基酸含量進(jìn)行分析，以期對(duì)我國(guó)糧食營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)陜西省糧油科學(xué)研究院、中儲(chǔ)糧成都儲(chǔ)藏研究院有限公司、國(guó)貿(mào)食品科學(xué)研究2起草階段：為了更好的完成本標(biāo)準(zhǔn)任務(wù)，查閱了國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料。起草組先排度和時(shí)間、生成物的穩(wěn)定性，還進(jìn)行了檢出限分析。然后測(cè)定不同含水率的原糧及加工品、萌動(dòng)小麥和糙米中游離α-氨基酸含量。在本方法對(duì)比驗(yàn)證中，比較了小麥、玉米、大米、糙米及大豆原糧中游離氨基酸含量之間的差異?；谝陨瞎ぷ?，查未通過，要求補(bǔ)充本方法測(cè)定的糧食中游離氨基酸含量與氨基酸分析儀測(cè)試結(jié)果形成了新的《送審稿》。糧油標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)要求行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)家，起草組考慮到驗(yàn)證費(fèi)用問題，邀請(qǐng)國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局糧油質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心、陜西省糧油科學(xué)研究院、國(guó)家糧油標(biāo)準(zhǔn)研究驗(yàn)證測(cè)試中心（成都儲(chǔ)藏研究所質(zhì)檢中心）、國(guó)貿(mào)食品科學(xué)研究院有限公司（國(guó)家副食品質(zhì)量檢測(cè)中心）、國(guó)家糧食局西安油脂食品及飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、山東省魯糧檢測(cè)科技有限公司作為本標(biāo)3李興軍負(fù)責(zé)該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)建議書的起草和試驗(yàn)，姜平負(fù)責(zé)試驗(yàn)，范維燕負(fù)責(zé)氨基酸分析儀驗(yàn)證，魏征、張東數(shù)據(jù)處理，頡宇參與試驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理，李秀娟參與文本國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局糧油質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心王佳雅、王麗、李樹朋；陜西省糧油科學(xué)研究院龔珊、陸少蘭；國(guó)家糧油標(biāo)準(zhǔn)研究驗(yàn)證測(cè)試中心（成都儲(chǔ)藏研究所質(zhì)檢中心）胡建蓉、熊升偉；國(guó)貿(mào)食品科學(xué)研究院有限公司（國(guó)家副食品質(zhì)量檢測(cè)山東省魯糧檢測(cè)科技有限公司王菲菲、張金娜對(duì)指定樣品進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本4二酮茚-二酮茚胺的取代鹽(雙-1,3-二酮茚)此反應(yīng)的特點(diǎn)是：茚三酮是使氨基酸和多肽顯色的重肽鏈越大靈敏度也越來越差，故不宜作定量測(cè)定多肽和蛋白12345600濃度(μmol/mL）56），氨基酸態(tài)氮就是以氨基酸形式存在的氮，它的含量與40%。我們測(cè)定的稻米中水溶性蛋白質(zhì)含量5～6mg/gfw,新收獲小麥中水溶性蛋這些谷物水溶性蛋白質(zhì)在弱酸的醋酸緩沖液中不發(fā)生水解。況且，糧食粗粉水提取質(zhì)中的水溶性蛋白質(zhì)不參與茚三酮反應(yīng)，主要原因是其分子量較大，如稻谷清蛋白表4水提取液蛋白酶解后游離氨基酸含量(μg氮/ml）外切活性的蛋白酶后，水溶性清蛋白被水解產(chǎn)生氨基酸，溶液中總氨基酸含量顯著ODOD75℃80℃85℃90℃95℃100℃溫度7BD570 D570D570D570D5700反應(yīng)時(shí)間(6放置時(shí)間（h）89亮氨酸回收率（%）超出了吸光度與濃度之間的線性范圍，所以回收率不是隨亮氨酸增加而呈現(xiàn)線性增游離氨基酸含量(μg氨基態(tài)氮/g干重）--------AspAlaMet3克粉狀樣品加少量娃哈哈純凈水和石英砂研磨，然后轉(zhuǎn)移到50mL離心管，定容為35mL，在4000rpm低溫離心10分鐘，取存。日立氨基酸分析儀L8900進(jìn)樣量為20μL。在同樣條件下，精米粉中沒有檢測(cè)到水溶性蘇氨酸、組氨酸和精氨酸，而糙米粉和小麥粉中均檢測(cè)到水溶性的16種氨基123據(jù)的最小極差百分率對(duì)精米粉、糙米粉、小麥粉分別是-2.9%、10.2%、0.8%。本方并進(jìn)行水合茚三酮反應(yīng)后，在紫外可見分光光度計(jì)上比色法確定含量。而如果采用質(zhì)量的樣品，加娃哈哈純凈水研磨提取水溶性氨基酸后在凍干機(jī)進(jìn)行濃縮，然后才檢出限（mg/kg，以氨基氮計(jì)）3.152.543.813.64注：y是吸光值，x是亮氨酸濃度(μmol/mL）。驗(yàn)證單位平行值1平行值2平行值3平行值4平均值標(biāo)準(zhǔn)差RSD/%1192.76194.26201.24191.26194.884.412.262184.69184.32185.31183.92184.560.590.323214.27230.96222.6211.805.304260.89260.18254.30255.01257.593.425218.31219.21217.95220.72219.050.566194.87186.56190.725.883.08驗(yàn)證單位平行值1平行值2平行值3平行值4平均值標(biāo)準(zhǔn)差RSD/%140.6441.4042.5744.0942.183.56252.2452.0555.4855.2853.763.48325.0220.0822.553.4915.49425.6425.9926.9326.5926.290.582.21522.4123.0021.6122.2922.330.572.55639.2934.4736.883.419.24驗(yàn)證單位平行值1平行值2平行值3平行值4平均值標(biāo)準(zhǔn)差RSD1212.92195.86203.86212.92206.398.223.982195.75196.60192.33190.42193.782.903185.61174.40180.017.934.404217.15218.54220.89221.73219.582.110.965183.98182.19183.34182.53183.010.810.446223.06216.29219.684.792.18樣品試驗(yàn)人平行值1平行值2平行值3平均值標(biāo)準(zhǔn)差RSD/%小麥粉1223.49221.24208.45217.738.113.732230.45213.4218.62220.828.743.963220.41226.96218.5221.964.442.00大米粉128.4931.0225.5428.352.749.67222.5221.8920.0221.486.05220.3223.4923.3122.377.96玉米粉1176.52178.78187.17180.825.613.102187.55191.73179.12186.136.423.453187.03179.33177.83181.404.942.72A（小麥粉）99999995%。糧食中游離氨基酸含量的重復(fù)性限（r）見表10。在再現(xiàn)性條件下獲得的兩個(gè)獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值小于等于再現(xiàn)性限（R）的情況應(yīng)大于95%。多酚含量的再現(xiàn)性限（R）參見表10。國(guó)外同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比情況，或與測(cè)試的國(guó)外樣品于糧食食品中16種氨基酸成分的含量測(cè)定。測(cè)定方法原理是，谷物和油料籽粒中的氨基酸，按照一定次序結(jié)合成不同類型的肽和蛋白質(zhì)，在測(cè)定前用一定濃度的鹽酸氨基酸各組分在氨基酸分析儀上被凝膠柱分離后，氨基酸的氨基可與水合茚三酮反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，其顏色的深淺與游離氨基酸的含量成正比。此方法測(cè)定的是糧粒中蛋白質(zhì)及其完全水解產(chǎn)物氨基酸的含量。如果用于游離氨基酸含量檢測(cè)，在糧粒組織中其含量很低的情況下，需要凍干濃縮，然后測(cè)定。它用于糧粒中游離組成植物種子蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，GB5009.124-2016標(biāo)準(zhǔn)方法中只顯示16種氨基酸。而氨基酸自動(dòng)分析儀如日立氨基酸分析儀L8800和L8900均能夠在丙氨酸種子儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)在110℃條件下經(jīng)過6mol/L最低檢出限（一般為10pmol）。就小麥，高分子量醇蛋白占總儲(chǔ)藏蛋白醇蛋白占總儲(chǔ)藏蛋白10～20%，其中Gln為40～45%。即小麥儲(chǔ)藏蛋白中Gln占到30~40%，如果采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析，樣品前處理中Gln產(chǎn)生大量的氯化銨分子。國(guó)內(nèi)外缺乏對(duì)糧食及加工品中游離氨基酸含量快速測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)法類似，不同點(diǎn)是它采用pH8.0的磷酸鹽緩沖液，本方法采用pH5.4乙酸-乙酸鈉緩沖液；它的茚三酮反應(yīng)反應(yīng)條件是沸水浴15min，本方法采用本方法的優(yōu)勢(shì)是快速準(zhǔn)確的揭示糧食及加工品中游離氨基酸含量，尤其是用于芽麥、發(fā)芽糙米和稻谷的檢測(cè)，儀器成本低。如果在全自動(dòng)氨基酸分析儀和高壓液沸點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室大氣壓和海拔高度、樣品含水量（基于15%）進(jìn)行了規(guī)定。該方法通越低。