動物疫病鑒別檢測技術(shù) 第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型-地方標準編制說明

《動物疫病鑒別檢測技術(shù)第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型》地方標準編制說明（報批稿）一、工作簡況（一）任務(wù)來源2019年9月4日，山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布《2019年度標準化綜合改革暨“山東標準”建設(shè)計劃項目》（魯標改辦發(fā)〔2019〕6號），本標準任務(wù)來源于其中的“鄉(xiāng)村振興標準化建設(shè)項目”，名稱為“兔病毒性出血癥Real-timeRT-PCR檢測方法”，由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施、山東省畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口，山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院牽頭組織編制。（二）起草單位、起草人及任務(wù)分工本標準起草工作由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院、山東綠都生物科技有限公司、山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所等單位承擔。本標準制定首先成立了標準起草小組，擬定了標準起草工作方案、技術(shù)路線、人員分工和計劃進度等，具體人員分工如下。姓名單位職稱承擔任務(wù)肖躍強山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院研究員標準制訂負責人，項目設(shè)計、統(tǒng)籌協(xié)調(diào)、標準起草與修改審定沈志強山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院研究員技術(shù)與標準起草指導孫培姣山東綠都生物科技有限公司助理研究員Real-timeRT-PCR楊慧山東綠都生物科技有限公司助理研究員樣本檢測劉吉山山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院研究員樣本采集王玉茂山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院研究員檢測方法應(yīng)用王金良山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院研究員特異性檢測謝金文山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院副研究員檢測方法應(yīng)用黃兵山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所研究員檢測方法驗證于新友山東綠都生物科技有限公司副研究員標準品的制備與檢測郭廣君山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院副研究員RT-PCR（三）起草過程1、材料收集2019年檢索和查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻資料，搜集了相關(guān)畜禽疫病診斷的國家標準、行業(yè)標準、地方標準及團體標準等，根據(jù)兔出血癥病毒（Rabbithemorrhagicdiseasevirus,RHDV）經(jīng)典型與出血癥病毒2（Rabbithemorrhagicdiseasevirustype2,RHDV2）變異型流行毒株及病毒基因組序列差異性的特點，分析比較了現(xiàn)有動物疫病檢測方法的優(yōu)、缺點，確定了實時熒光反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-timeRT-PCR）是適合實驗室的檢測方法。2、病原與流行病學調(diào)查本項目組自2006年以來，一直開展RHDV經(jīng)典型與RHDV2變異型的流行與跟蹤研究，對其臨床癥狀、流行病學、臨床發(fā)病特點、病毒遺傳進化演變、綜合防控技術(shù)進行了深入研究。項目組對國內(nèi)46株RHDV經(jīng)典毒株主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60的基因序列或者基因組進行了研究分析，抗原性未發(fā)生重大變異。法國于2010年首先報道了RHDV2新型變異株，不僅導致育肥兔大量死亡，以RHDV經(jīng)典型制備的滅活疫苗無法提供完全保護，免疫兔群死亡率高達25%，可見，其抗原性產(chǎn)生較大變異。之后RHDV2型在歐洲、非洲、大洋洲部分國家流行，瑞典、葡萄牙、澳大利亞等國RHDV2型已經(jīng)取代RHDV經(jīng)典型成為主要流行毒株。我國于2020年5月份在四川省確診了由RHDV2型引發(fā)的疫病，與荷蘭報道的NL2016毒株（GenBank登錄號：MN061492）同源性最高為98.3%。我國作為世界第一養(yǎng)兔大國，若該變異毒株發(fā)生大規(guī)模流行，勢必加大防控難度。因此，建立一種可以通用并鑒別RHDV經(jīng)典型與RHDV2型的檢測技術(shù)極為重要。3、檢測方法建立與復核2018-2019年通過對本項目組獲知的11株病毒的基因序列和GenBank登錄的41株RHDV經(jīng)典型、18株RHDV2型基因序列進行比對分析，根據(jù)病毒VP60基因的保守區(qū)域分別設(shè)計了3對Real-timeRT-PCR組合引物，經(jīng)敏感性、特異性、重復性及擴增產(chǎn)物Tm值差異等驗證，篩選出1對最佳引物，對反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，建立了一種敏感、特異、快速、操作簡便的通用并鑒別檢測RHDV經(jīng)典型與RHDV2型的Real-timeRT-PCR檢測方法，并進行了大量的臨床檢測應(yīng)用驗證，確保方法的準確性。將該鑒別檢測技術(shù)實施標準化后，委托4家單位開展對《動物疫病鑒別檢測技術(shù)第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型》標準進行相關(guān)樣品復核驗證，反饋結(jié)果表明：標準文件中鑒別檢測技術(shù)敏感、特異，具有很好的重復性，可有效鑒別檢測RHDV經(jīng)典型與RHDV2型。4、標準編寫過程2019年9-2019年10月，查閱相關(guān)技術(shù)資料和文獻調(diào)研。2019年11月-2019年12月，成立標準起草組，召開項目協(xié)調(diào)會，根據(jù)前期調(diào)研論證和檢測方法建立的結(jié)果，開始編寫《動物疫病鑒別檢測技術(shù)第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型》的征求意見草案稿。2020年1月-2020年6月，根據(jù)我國流行毒株情況，進行了進一步試驗驗證及相關(guān)數(shù)據(jù)分析，對征求意見草案稿進行修訂、完善，形成《動物疫病鑒別檢測技術(shù)第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型》的征求意見稿。2020年7月-2022年2月，對征求意見稿進行項目專家函審，廣泛征求意見；收集、匯總專家修改意見，形成了標準預審征求意見。繼續(xù)反復試驗驗證，完善檢測技術(shù)方法，根據(jù)草案稿函審意見對此標準進行了修改與完善，形成《動物疫病鑒別檢測技術(shù)第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型》送審稿。2022年3月-2023年1月，申請山東省地方標準審查，依據(jù)專家意見對標準及編制說明文本進行修改。2023年2月，召開地方標準審查會議，邀請9位專家對標準案進行整體審查，包括題目、前言審查，范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語與定義等審查，試劑或材料、儀器設(shè)備審查，結(jié)果判定審查，附錄審查及檢測技術(shù)審查。2023年3月-2023年7月，依據(jù)專家審查會意見對標準及編制說明文本進行修改與完善，形成《動物疫病鑒別檢測技術(shù)第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型》報批稿，并申請山東省地方標準報批。地方標準制定目的和意義兔出血癥（Rabbithaemorrhagicdisease，RHD）首發(fā)于我國江蘇，是目前困擾我國養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展最為重要的病毒性疫病，是由兔出血癥病毒引起的表現(xiàn)為發(fā)病急、突然死亡，且死亡率高達40%～90%。該病毒基因組為單股正鏈RNA，約7.4kb，含有2個開放閱讀框（Openreadingframe,ORF），其中ORF1占比94%，編碼多聚蛋白，被裂解為多個非結(jié)構(gòu)蛋白與主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60，ORF2與ORF1部分重疊，編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白VP12；同時，病毒粒子還含有約2.2kb的亞基因組RNA，在病毒感染的中、后期翻譯VP60與VP12蛋白。VP60是主要免疫保護性蛋白，主導了病毒抗原性演變，是新型疫苗研制、檢測試劑開發(fā)的重要靶標。RHDV經(jīng)典型被分為RHDV原始群（OriginalRHDV）與變異群（RHDVa），國內(nèi)目前流行的以RHDVa為主。RHDV2是2010年在法國開始出現(xiàn)的新型變異毒株，不僅導致育肥兔大量死亡，還可以導致免疫了RHDV經(jīng)典型疫苗的兔群病死，死亡率高達25%，之后在歐洲、非洲、大洋洲部分國家流行。我國四川省已經(jīng)確診了該型病毒，無疑加重了其在我國的防控難度，開發(fā)快速、敏感、特異的檢測試劑，尤其是既可以通用、又可以鑒別的檢測方法具有重要意義。序列分析顯示，RHDV經(jīng)典型與RHDV2型VP60基因核苷酸序列同源性僅為81%左右，因此，現(xiàn)有的針對RHDV經(jīng)典型VP60基因的分子生物學檢測方法可能因引物序列與RHDV2型VP60基因無法完全匹配而導致對后者的檢測敏感性大幅度降低，甚至無法檢出。因此，急需建立一種敏感、特異、快速、操作簡便、易于判定的通用鑒別檢測RHDV經(jīng)典型與RHDV2型的熒光定量RT-PCR檢測方法，目前國內(nèi)外還沒有該方法的診斷標準?；诖?，過比較分析RHDV經(jīng)典型與RHDV2型VP60基因序列，設(shè)計引物并建立了基于SYBRGreenI染料的熒光定量RT-PCR檢測方法，同時，通過比較擴增產(chǎn)物熔解曲線Tm值的差異，通用、鑒別檢測RHDV經(jīng)典型與RHDV2型，在此基礎(chǔ)上制定該標準。三、地方標準編制原則、主要技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)（一）標準的編寫原則本標準的制定，按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》與《標準化工作導則第2部分：標準中規(guī)范性技術(shù)要素的確定方法》給出的規(guī)定起草，主要遵循“規(guī)范性、實用性、統(tǒng)一性和協(xié)調(diào)性”的原則，注意標準的經(jīng)濟性和社會效益。規(guī)范性本標準針對開展RHDV經(jīng)典型與RHDV2型檢測的文件使用者原則，從操作過程到結(jié)果判定均給出了明確的規(guī)范，保證了規(guī)范性要素中的內(nèi)容是特定使用者所需要的。實用性文件內(nèi)容的表述便于直接應(yīng)用于RHDV經(jīng)典型與RHDV2型的檢測。一致性和協(xié)調(diào)性本標準各部分之間，關(guān)于RHDV經(jīng)典型與RHDV2型檢測的結(jié)構(gòu)表述一致，能夠幫助文件使用者理解文件；同時，與現(xiàn)行有效的文件相互協(xié)調(diào)，沒有重復和不必要的差異。（二）主要技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)本標準樣品的采集、保存和運輸，以及各種試驗條件優(yōu)化與參數(shù)確定等，凡是未特別描述的均參照NY/T541《獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范》標準與文獻（肖躍強，孫培姣，周迎春等.鑒別RHDV與RHDV2熒光定量RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國預防獸醫(yī)學報,2021,43(05):512-520）。本標準制定的Real-timeRT-PCR檢測方法，最大特點是利用1對引物，能用于通用、鑒別檢測RHDV經(jīng)典型與RHDV2型。本標準方法建立時首先設(shè)計3對組合引物，序列見表1，對RHDV經(jīng)典型與RHDV2型通用擴增、擴增產(chǎn)物Tm差異篩選見圖1，最終，通過擴增曲線與熔解曲線分析，篩選VP60-F1244/VP60-R1393組合，熔解曲線Tm值差異分析見圖2，繼而通過體系反應(yīng)條件優(yōu)化建立了檢測方法。該方法敏感性好，對RHDV經(jīng)典型與RHDV2型質(zhì)粒標準品敏感性均為1×101拷貝，如圖3所示；該方法特異性好，僅對RHDV經(jīng)典型與RHDV2型擴增陽性，對豬瘟兔化弱毒（脾淋源）、兔多殺性巴氏桿菌、兔A型魏氏梭菌、兔波氏桿菌均為陰性，如圖4所示；該方法重復性好，對RHDV經(jīng)典型擴增的批內(nèi)和批間Cp值最大變異系數(shù)分別為1.91、3.60，Tm值最大變異系數(shù)分別小于0.72、0.48，對RHDV2型擴增的批內(nèi)和批間Cp最大變異系數(shù)分別為1.90、3.93，Tm值最大變異系數(shù)分別為0.29、0.17；該方法通過Tm值即可實現(xiàn)RHDV經(jīng)典型與RHDV2型鑒別檢測，臨床樣品檢測結(jié)果顯示，RHDV經(jīng)典型與RHDV2型擴增產(chǎn)物Tm值一般相差1.5℃～2.5℃，Tm值比較見表2；同時用2家公司市售主流病毒核酸提取試劑盒提取RHDV與RHDV2基因組RNA，然后分別進行3次重復檢測，結(jié)果見表3，可見，無論是擴增Cp值還是擴增產(chǎn)物Tm值均無顯著差異；同時，對人工感染RHDV的實驗兔樣品檢測，肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、心臟、內(nèi)皮、肌肉組織樣品等檢測均為陽性，以肝臟Cp值最小，即病毒含量最高，其它臟器組織Cp值依次升高，對口鼻粘液、肛腸排泄物、尿液排泄物的檢測也均為陽性，其中口鼻粘液的帶毒量高于肛腸排泄物與尿液，如圖5所示。表1引物序列引物序列（5’-3’）VP60-F1081TGGAACAGTAACARCGGTGCCCVP60-R1218GGCATAAATGGACTTRGCGACAGVP60-F1244CAACCGGACTGTTTGTGATGGCVP60-F1252CTGTTTGTGATGGCMTCGGGVP60-R1393ACGCGAACATGATGGGTGTGTT表2臨床樣品檢測結(jié)果樣品熒光定量RT-PCRRT-PCR符合率Tm平均數(shù)陽性數(shù)Tm平均數(shù)陽性數(shù)RHDV2isolateZar2016_4（合成基因）82.60±0.021－0－RHDV2isolateSC2020/0482.45±0.091－－－RHDVAV3484.98±0.041－193.3%臨床樣本84.76±0.3914－13注：“－”表示未進行檢測或分析。表3市售病毒核酸提取試劑盒檢測比較結(jié)果試劑盒廠家Cp值平均數(shù)()Tm值平均數(shù)()RHDVRHDV2RHDVRHDV2A公司18.34±0.1223.71±0.1685.06±0.0582.41±0.07B公司18.19±0.1823.56±0.1285.02±0.0482.44±0.08AA：不同引物組合擴增RHDVCp值與熔解曲線；B：不同引物組合擴增RHDV2Cp值與熔解曲線圖1熒光定量PCR引物組合的篩選RHDV2RHDVRHDV2RHDV圖2RHDV與RHDV2熒光定量PCR產(chǎn)物熔解曲線Tm值差異123456781-7：依次代表1×107～1×101拷貝/μL熒光定量PCR擴增；8：陰性對照圖3RHDV與RHDV2熒光定量PCR敏感性擴增圖圖4特異性試驗擴增RHDVRHDV2豬瘟兔化弱毒兔多殺性巴氏桿菌兔A型魏氏梭菌兔波氏桿菌陰性對照11～10：肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、心肌組織、內(nèi)皮組織、口鼻粘液拭子、肌肉組織、肛門拭子、尿液樣品熒光