《核酸的提取分離》課件

核酸的提取分離核酸提取分離技術(shù)是生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。從生物樣本中提取核酸，為后續(xù)的基因分析、分子診斷等提供材料。課程目標(biāo)掌握核酸提取的基本原理了解核酸提取的步驟和方法，以及影響因素。熟悉各種核酸提取方法學(xué)習(xí)常用核酸提取方法，如酚/氯仿法、磁珠法等。掌握核酸純度檢測(cè)方法了解UV吸收法、凝膠電泳法等檢測(cè)核酸純度的方法。了解核酸的應(yīng)用領(lǐng)域掌握核酸在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。核酸的分類(lèi)及特點(diǎn)脫氧核糖核酸(DNA)DNA是一種雙螺旋結(jié)構(gòu)，攜帶遺傳信息，在細(xì)胞核中儲(chǔ)存。核糖核酸(RNA)RNA是一種單鏈結(jié)構(gòu)，參與蛋白質(zhì)合成，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中存在。核酸的分類(lèi)核酸可分為DNA和RNA，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上有所區(qū)別。DNA和RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）都是核酸，是生物體重要的遺傳物質(zhì)。DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈組成。RNA是單鏈結(jié)構(gòu)，由核糖核苷酸鏈組成。DNA和RNA的結(jié)構(gòu)不同，決定了它們?cè)谏矬w內(nèi)的不同功能。核酸的物理化學(xué)性質(zhì)11.溶解性核酸在水中溶解度較低，但在堿性溶液中溶解度較高。22.吸收光譜核酸在紫外光區(qū)有最大吸收，峰值在260nm左右。33.熱穩(wěn)定性核酸在高溫下會(huì)發(fā)生降解，雙鏈DNA的熱穩(wěn)定性高于單鏈DNA。44.酸堿性核酸在酸性條件下易發(fā)生水解，在堿性條件下則較為穩(wěn)定。核酸的生物學(xué)功能遺傳信息的儲(chǔ)存DNA是遺傳信息的載體，包含了生物體發(fā)育和繁殖所需的所有信息。蛋白質(zhì)合成的模板RNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，將DNA中的遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)合成機(jī)器。生物催化劑一些RNA具有催化功能，可以加速特定的化學(xué)反應(yīng)。細(xì)胞分裂與增殖核酸參與細(xì)胞分裂和增殖過(guò)程，保證遺傳信息的傳遞。核酸提取的意義研究基礎(chǔ)核酸提取是現(xiàn)代生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。它為各種實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，包括基因克隆、測(cè)序、基因表達(dá)分析等。提取的核酸可以用于識(shí)別基因、研究基因表達(dá)、診斷疾病、進(jìn)行親子鑒定等。應(yīng)用價(jià)值核酸提取技術(shù)應(yīng)用廣泛，包括醫(yī)學(xué)診斷、藥物研發(fā)、生物技術(shù)、食品安全、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。它為診斷疾病、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展、研究基因突變、開(kāi)發(fā)新藥物等提供了有力工具。核酸提取的原理1分離利用核酸與蛋白質(zhì)等其他生物大分子的性質(zhì)差異，將核酸從細(xì)胞裂解液中分離出來(lái)。2裂解使用合適的裂解液破壞細(xì)胞膜和核膜，釋放出核酸。3收集通過(guò)離心或其他方法收集細(xì)胞或組織。核酸提取的目的是從生物樣品中分離出純凈的核酸，包括DNA和RNA。核酸提取的方法11.細(xì)胞破碎使用物理、化學(xué)或酶解方法破壞細(xì)胞膜，釋放核酸。22.蛋白質(zhì)去除使用蛋白酶或酚/氯仿抽提法去除蛋白質(zhì)，確保核酸的純度。33.核酸分離使用不同的方法分離核酸，如離心、層析或沉淀。44.核酸濃縮使用乙醇沉淀、膜分離等方法濃縮核酸，提高濃度。細(xì)胞破碎的方法物理方法機(jī)械破碎：研磨、超聲波破碎、勻漿、高壓均質(zhì)冷凍-解凍：反復(fù)凍融破壞細(xì)胞膜滲透壓沖擊：將細(xì)胞置于高滲溶液中化學(xué)方法表面活性劑：SDS、TritonX-100酶解：溶菌酶、蛋白酶有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮蛋白質(zhì)去除的方法蛋白酶消化法使用蛋白酶將蛋白質(zhì)降解，從而實(shí)現(xiàn)去除。離心沉淀法利用蛋白質(zhì)和核酸的密度差異，通過(guò)離心將蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。酚/氯仿抽提法利用酚/氯仿的性質(zhì)，將蛋白質(zhì)從水相中分離出來(lái)。層析法根據(jù)蛋白質(zhì)和核酸的物理化學(xué)性質(zhì)差異，利用層析方法分離。核酸分離的方法密度梯度離心法利用核酸和蛋白質(zhì)的密度差異，通過(guò)離心分離核酸。層析分離法根據(jù)核酸大小、電荷和親和力，選擇合適的層析方法進(jìn)行分離。電泳分離法根據(jù)核酸的大小和電荷進(jìn)行分離，常用于核酸純度的檢測(cè)。等滲鹽溶液法等滲鹽溶液等滲鹽溶液是一種常用的溶液，用于保持細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。細(xì)胞形態(tài)等滲溶液的滲透壓與細(xì)胞內(nèi)的滲透壓相同，可以防止細(xì)胞因水分流失或過(guò)度吸收而發(fā)生變形。提取核酸在提取核酸時(shí)，使用等滲鹽溶液可以使細(xì)胞保持完整，避免核酸被破壞。酚/氯仿法原理酚/氯仿法利用酚和氯仿的密度差，以及核酸在水相中溶解度較高的特點(diǎn)，將核酸從細(xì)胞裂解液中分離出來(lái)。酚和氯仿混合液能有效地去除蛋白質(zhì)，使核酸保留在水相中。步驟細(xì)胞裂解加入酚/氯仿混合液離心分離收集水相核酸沉淀離子交換樹(shù)脂法離子交換樹(shù)脂離子交換樹(shù)脂是具有離子交換能力的合成高分子材料，通過(guò)離子交換作用實(shí)現(xiàn)核酸分離。親和性離子交換樹(shù)脂根據(jù)核酸的電荷性質(zhì)，選擇性地吸附核酸，實(shí)現(xiàn)核酸與其他物質(zhì)的分離。洗脫通過(guò)改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度或pH值，改變核酸與樹(shù)脂的親和性，洗脫出核酸。吸附層析法11.吸附劑常見(jiàn)的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、離子交換樹(shù)脂等，這些材料具有較大的表面積，可以吸附核酸分子。22.洗脫選擇合適的洗脫液，將吸附在吸附劑上的核酸分子洗脫下來(lái)，常用洗脫液包括高鹽溶液、酸性溶液、堿性溶液等。33.優(yōu)勢(shì)吸附層析法操作簡(jiǎn)便，分離效率高，可以有效去除蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，適用于小規(guī)模的核酸提取。親和層析法特異性結(jié)合利用核酸與特定配體之間的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)核酸的分離純化。配體選擇根據(jù)目標(biāo)核酸類(lèi)型，選擇相應(yīng)的配體，例如寡核苷酸、抗體或蛋白質(zhì)。分離過(guò)程核酸與配體結(jié)合后，通過(guò)洗脫步驟將核酸分離純化，例如使用高鹽或競(jìng)爭(zhēng)性配體。核酸濃縮的方法離心濃縮利用離心力將核酸沉淀到管底，然后去除上清液。膜過(guò)濾濃縮使用特定的膜過(guò)濾，將核酸保留在膜上，去除溶液。真空濃縮利用真空將溶液蒸發(fā)，留下濃縮的核酸。冷凍干燥濃縮將溶液冷凍干燥，去除水分，濃縮核酸。乙醇沉淀法乙醇的作用乙醇可以降低核酸的溶解度，使其從溶液中析出。鹽的作用鹽可以中和核酸的負(fù)電荷，使其更容易沉淀。離心作用離心可以將沉淀的核酸收集到管底。乙醇-醋酸鈉沉淀法11.沉淀效率乙醇-醋酸鈉沉淀法是常用的核酸沉淀方法之一，效率高，適用于各種核酸類(lèi)型，包括DNA和RNA。22.沉淀過(guò)程加入乙醇和醋酸鈉后，核酸會(huì)與乙醇形成沉淀，通過(guò)離心分離得到核酸沉淀。33.適用范圍該方法適用于各種核酸樣品，包括純化的核酸和粗提的核酸。44.注意事項(xiàng)操作過(guò)程中需要注意溫度控制，避免過(guò)高或過(guò)低，防止核酸降解或沉淀不完全。聚乙二醇沉淀法原理聚乙二醇(PEG)是一種水溶性聚合物，可以與水形成氫鍵。當(dāng)PEG的濃度達(dá)到一定程度時(shí)，PEG會(huì)與核酸形成沉淀。優(yōu)點(diǎn)PEG沉淀法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，可以有效地從溶液中沉淀核酸。缺點(diǎn)PEG沉淀法效率較低，容易導(dǎo)致核酸降解，需要進(jìn)一步純化步驟。應(yīng)用PEG沉淀法廣泛應(yīng)用于核酸提取、純化和濃縮等領(lǐng)域。膜分離技術(shù)微濾膜微濾膜可去除細(xì)菌、酵母菌、藻類(lèi)和懸浮顆粒物等，廣泛應(yīng)用于食品飲料、醫(yī)藥和生物工程等領(lǐng)域。超濾膜超濾膜可去除蛋白質(zhì)、多糖、核酸等大分子物質(zhì)，應(yīng)用于生物制藥、食品加工和水處理等行業(yè)。納濾膜納濾膜可去除水中的重金屬、鹽類(lèi)、有機(jī)物等，在海水淡化、工業(yè)廢水處理和食品加工中應(yīng)用廣泛。反滲透膜反滲透膜可去除水中的所有溶解物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于純水制備、海水淡化和污水處理等領(lǐng)域。核酸純度檢測(cè)的方法UV吸收法核酸在260納米波長(zhǎng)處有最大吸收值。通過(guò)測(cè)量溶液在260納米和280納米處的吸光度，可以計(jì)算核酸的純度。260/280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明核酸樣本純凈，沒(méi)有蛋白質(zhì)污染。凝膠電泳法核酸在電場(chǎng)中會(huì)向正極移動(dòng)，其遷移速度取決于分子大小和形狀。通過(guò)凝膠電泳可以觀察核酸的完整性和大小。樣本條帶清晰，沒(méi)有拖尾或降解現(xiàn)象，表明核酸純度高。UV吸收法11.原理核酸在紫外光區(qū)有最大吸收，通過(guò)檢測(cè)特定波長(zhǎng)下的吸光度，可以定量分析核酸濃度。22.操作將待測(cè)核酸溶液置于紫外分光光度計(jì)中，測(cè)定其在260nm波長(zhǎng)下的吸光度。33.計(jì)算根據(jù)吸光度值和已知的核酸摩爾消光系數(shù)，計(jì)算出核酸濃度。44.應(yīng)用適用于快速測(cè)定核酸溶液的濃度，但無(wú)法判斷核酸的完整性和純度。凝膠電泳法核酸分離利用電場(chǎng)使帶電荷的核酸在凝膠介質(zhì)中遷移，根據(jù)分子大小進(jìn)行分離。電泳系統(tǒng)電泳系統(tǒng)由電泳槽、電源、凝膠等組成，用于控制電場(chǎng)和凝膠環(huán)境。結(jié)果分析通過(guò)觀察核酸條帶的位置和大小，可以分析核酸的類(lèi)型、大小和含量。PCR擴(kuò)增法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR利用特異性引物和DNA聚合酶，在體外對(duì)模板DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增。核酸模板需要擴(kuò)增的DNA片段作為模板，可來(lái)源于各種生物樣品。熱循環(huán)儀PCR反應(yīng)需要在特定溫度下進(jìn)行，熱循環(huán)儀用于控制反應(yīng)溫度。核酸質(zhì)量分析的注意事項(xiàng)核酸質(zhì)量分析是核酸提取和分離的重要步驟，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。在進(jìn)行核酸質(zhì)量分析時(shí)，需要關(guān)注以下注意事項(xiàng):首先，應(yīng)選擇合適的檢測(cè)方法，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆颖绢?lèi)型選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)。其次，要注意操作細(xì)節(jié)，避免污染和誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。最后，要對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和評(píng)估，確保核酸質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求，并進(jìn)行必要的優(yōu)化，提高核酸提取和分離的效率和質(zhì)量。核酸穩(wěn)定性及保存條件溫度核酸在高溫下容易降解。最佳保存溫度為-20°C或-80°C。pH核酸在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境中容易降解。最佳保存pH為7.0-8.0。光照紫外線會(huì)損傷核酸。保存核酸時(shí)要避免陽(yáng)光直射。金屬離子某些金屬離子會(huì)催化核酸降解。建議使用去離子水或超純水保存核酸。核酸的應(yīng)用領(lǐng)域分子生物學(xué)研究核酸是生命的基本物質(zhì)，在分子生物學(xué)研究中起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)對(duì)核酸的提取和分析，科學(xué)家可以深入研究基因的功能、表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及疾病發(fā)生機(jī)制。醫(yī)學(xué)診斷核酸檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，包括感染性疾病的診斷、遺傳性疾病的篩查以及腫瘤的診斷和