DB51T 2457-2018 斑點(diǎn)叉尾鮰柱形病診斷技術(shù)規(guī)程　

1DB51DB51/T2457—2018斑點(diǎn)叉尾鮰柱形病診斷技術(shù)規(guī)程2018-04-18發(fā)布2018-05-01實施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 5 6 81GB/T28630.4白斑綜合征（WSD）SC/T7201.2魚類細(xì)菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第2部分：柱狀檢驗中所需試劑、染色液與培養(yǎng)基的配制按照GB/T4789.2Taq酶、dNTPs、10×PCR緩沖液（無Mg2+）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物與核酸提取試劑盒選用專業(yè)試劑公司216SrRNA基因DNA序列擴(kuò)增引物，P-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，P-R：5’-GGTTACCTTGTT3用硫酸軟骨素-Shieh培養(yǎng)基，即含400μg/mL的硫酸軟骨素溶液和1%的牛血清白9.2.10運(yùn)動性震蕩懸浮，加入50μL10％的SDS溶液（A.6加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.8充分混勻，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.9）混勻，6液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1A.11混勻，12000r/min離心5min。取上清液，加入1倍體4混勻后，3000r/min離心30s。設(shè)空白對照，空白對照取等體PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)；72℃膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍(lán)指示劑溶液（A.13）混合后加入樣品9.3.4.1.337℃水浴將凍結(jié)的凝膠9.3.4.1.5取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1A.11混勻，12000r/min離心5min。革蘭氏染色為革蘭氏陰性，菌體細(xì)長、彎曲或直的桿狀，約(4～8)μm×(0.5～5—++ +—++++測定的16SrRNA基因序列與附錄B所列的基因序列比6 BaCl2.2H2OK2HPO4KH2PO4配制Shieh培養(yǎng)基，于121℃滅菌20min，冷卻至37℃后加入剛果紅，使終濃度為30-50mg/mL。將0.121gTris堿（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二鈉（分子量372.24）加入80mL雙蒸水7將29.22gNaCl（分子量58.444.1gNaCl溶解于80mL雙蒸水中，緩將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加雙蒸水定容至將溴酚藍(lán)100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴81agagtttgatcatggctcagg61ggtagaaggagcttgttcctttgag181gcctcatttgattattaaagttcc241tggtgtggtaacggcataccaaggcaacgatg301acactggtactgagacacggaccagactcctacg361aatgggcgcaagcctgaaccagccatgccgc421actgcttttgtacaggaagaaaccctcccttgtaag481aaggatcggctaactccgtgccagc541gaatcattgggtttaaagggtccgtaggcg601ctcaacgatcaaacggccattgatactgtaaga661atgtagtgtagcggtgaaatgcttagagattacatgg721actacgagtatattgacgctgatggacgaa781tgtattccaacgcccgtaaacg841cgaaagtgataagtatcccacctggggagtacgtt901gacgggggcccgcacaagcggag961taccanggcttaaatgggaaacgaca1081gcgcaacccctgttgc1201ac