DB51T 2649-2019 小熊貓親子鑒定技術(shù)規(guī)范　　

DB51四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB51/T2649—2019 1 1 1 1 2 3 3 4 5 6DB51/T2649—20191DB51/T2649—2019小熊貓親子鑒定技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)適用于四川省圈養(yǎng)小熊貓親子鑒定、個(gè)體識(shí)別、遺傳多樣性評(píng)估和遺傳檔CJJ/T263-2017動(dòng)物園動(dòng)物管微衛(wèi)星標(biāo)記Microsatellit微衛(wèi)星親子鑒定MicrosatellitePaternit4樣品采集與保存2DB51/T2649—20194.1采樣范圍4.2采樣工具一次性橡膠手套、EDTA抗凝采血管、采樣登記表、采4.3血液及組織樣品采集4.4糞便樣品采集采集樣品時(shí)，應(yīng)佩戴一次性手套，禁止用手直接觸碰4.5樣品記錄與編號(hào)在采集樣品時(shí)，填寫《小熊貓樣品采集記錄表》（附錄A）。記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、動(dòng)物編號(hào)、性別、年齡、來(lái)源以及動(dòng)物體況特征等。在采血管/采樣袋和采樣表表示成都動(dòng)物園血液樣品，電子芯片號(hào)75687表示成都動(dòng)物園糞便樣品，電子芯片號(hào)75634血液樣品采集編號(hào)規(guī)則為：動(dòng)物園首寫字母（三位）+B（血液樣品）+樣品號(hào)或動(dòng)物呼名，如 糞便樣品采集編號(hào)規(guī)則為：動(dòng)物園首寫字母（三位）+F（糞便樣品）+樣品號(hào)或動(dòng)物呼名，如“CDZ-F-001”表示成都動(dòng)物園001號(hào)個(gè)體糞便樣品，“C使用樣品對(duì)應(yīng)的專用商品試劑盒或傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)手段進(jìn)行3DB51/T2649—2019近期使用的DNA，裝有DNA的離心管保存于-2號(hào)為備選標(biāo)記。當(dāng)基本標(biāo)記不能成功進(jìn)行親子鑒定時(shí)，考進(jìn)行小熊貓個(gè)體識(shí)別時(shí)，在10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中選擇使用（附錄B），其中1-5號(hào)為基本標(biāo)記，6-10號(hào)為備選標(biāo)記。當(dāng)基本標(biāo)記不能成功進(jìn)行個(gè)體識(shí)別時(shí)，考使用微量分光光度計(jì)對(duì)每個(gè)DNA樣品進(jìn)行濃度分析。血液樣品260/280在1.8-2.0之間，糞便樣品260/280在1.7-2.1之間，濃度超過(guò)50ng/ul的DNA樣品合格。不在范圍內(nèi)的DNA記。詳細(xì)記錄引物合成的公司名稱、合成批次及每個(gè)引物Taqpolymerase(2.5U/4DB51/T2649—2019PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10分鐘；95℃變性15秒，退火（退火溫度根據(jù)具體的引物確定）15秒，）；當(dāng)PCR擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物5μL，經(jīng)1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如電將符合質(zhì)量要求的PCR產(chǎn)物避光（使用錫箔紙盒）存放于4℃冰箱，用將符合質(zhì)量要求的PCR產(chǎn)物送有關(guān)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行基因掃不同顏色標(biāo)記引物的PCR產(chǎn)物或者相同顏色標(biāo)記但PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度明顯不重疊的可以混合后進(jìn)行基因同一批樣品或同一地樣品分兩/多批次檢測(cè)的，需使用一個(gè)已檢對(duì)未鑒定出父本或母本的，擴(kuò)大疑是父母范圍，進(jìn)行樣品采集、PCR擴(kuò)增和基因分型，以進(jìn)一步確當(dāng)兩個(gè)或兩個(gè)以上的樣品微衛(wèi)星標(biāo)記分型結(jié)果完當(dāng)兩個(gè)樣品的微衛(wèi)星標(biāo)記分型結(jié)果中只有一個(gè)標(biāo)記差異時(shí)，對(duì)出現(xiàn)差異的位點(diǎn)重復(fù)PCR擴(kuò)增（2-3個(gè)體；若仍存在標(biāo)記差異，則認(rèn)為兩個(gè)樣品來(lái)自不5DB51/T2649—2019A號(hào)性別左一雌雄6DB51/T2649—2019B5’-3’℃1Aifu-01R:GGTATCAGACGTGGGA2F:ACTCTACTATGATTCTGCCTATR:TGAAGGTTATCTCAGG3Aifu-04F:TTATTTTTTTATGGCTGAGR:GCACTGCTAGTTATTT4F:TGAGGGCATTTGATTTR:AGAGTGAACTGGAATG5Aifu-066F:TTCCCAACTTTCTTCTCTR:AACCAACCCAGTGACA7Aifu-22F:CACGTTGGCTTCAGTAR:GGTTCGGATAAAGTATTR:CCTTGATTTGTTGGAG8Aifu-23F:GGACCCAACAAGCCCTTTR:TTCTCTCTCAGCCTCTCA9F:AACCTCTGTCCTCCTCCR:GCACAATGGTTTAGGCR:ACGGGTCAGAGTCAGAF:AAGTTGAAATGCCCGAGR:TTGCTGGTAGTTGTAGTAATF:TGATTCAAGGTTCCCTAR:AAGAAAGTGGTTAGTTTAAF:AATGTCAAGGAAGAACCR:TTCACTGCTCACCGTTAifu-05F:GAATAATGAGCTTGCCTR:TTGACATTGGCTATGTGF:GACTCTTGGTTTCAGGGR:TCTACACTGGACCATTTTTR:CTTATGCTCTTTCTCC7DB51/T2649—20195’-3’℃F:TTCATGTCCTTTTGGATR:CCTCTTTTACCTCTGCF:AGAGTATCTCGGAAACTGF:TGCGGTGTATTCAGGTAR:TCTTTGAACCCTCAGCF:GGGGCCTTGTCTAATTCAifu-02F:GACCCAGCCCTAACTCR:FAM-CCTGCATTAGGCTCF:AGTGTCTGAAAAATGGAGATF:TAGGGTTCAAGCTCTTACTTAGR:AGCAAACTGTTCTACCACTAifu-24F:AGAGGG