微生物的分離純化與接種技術

實驗六

微生物的分離純化與接種技術

2021/6/271一、實驗目的1.掌握常用接種工具的使用2.掌握斜面培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基接種法3.掌握倒平板技術4.掌握各種分離單菌落的技術2021/6/272二、實驗原理接種是微生物實驗及科研的一項最基本的操作技術，是將一種微生物移接到滅過菌的新培養(yǎng)基的過程。接種方法有斜面接種、液體接種、平板接種、穿刺接種等。在接種過程中，為了確保純種不被雜菌污染，必須采用嚴格的無菌操作。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單菌落可用稀釋平板法、劃線分離法等。2021/6/273三、實驗器材及試劑接種環(huán)、酒精燈、試管、移液管、培養(yǎng)皿、涂布棒、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、生理鹽水、大腸桿菌菌液。2021/6/274四、實驗步驟1.接種環(huán)的使用接種環(huán)是用鉑絲或細電爐絲制成的，使用前后都要用酒精燈外焰嚴格滅菌。接種環(huán)的滅菌方法2021/6/275四、實驗步驟2.斜面接種（每人接種2支試管斜面，1支斜面接斜面，1支液體接斜面）將菌種管（若是液體菌種應先搖勻）與空白斜面培養(yǎng)基管握在左手大拇指和其他四指之間，菌種管位于上側(cè)，培養(yǎng)基管位于下側(cè)，斜面均向上。右手持接種環(huán)火焰滅菌。以右手掌心、小指和無名指同時夾取兩管口的棉塞，將兩試管口迅速通過火焰滅菌。在火焰附近，用滅菌的接種環(huán)從菌種管挑取少量菌苔或一環(huán)菌液，伸進待接種的培養(yǎng)基管斜面底部，向上“Z”形劃線。接種時不要劃破培養(yǎng)基表面，沾菌的接種環(huán)進出試管時不應觸及試管口。接種完后灼燒管口，塞上棉塞。灼燒接種環(huán)，放回原處。將接種好的試管斜面放到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。2021/6/276斜面接種示意圖2021/6/2773.液體接種（每人接種2支液體試管，1支斜面接液體，1支液體接液體）操作方法與前相同，但要使試管口向上斜，以免培養(yǎng)基流出。接入菌體后，使接種環(huán)和管內(nèi)壁摩擦幾下以利洗下環(huán)上菌體，接種后塞好棉塞將試管在手掌中輕輕敲打，使菌體充分分散。將接種好的試管斜面放到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。四、實驗步驟2021/6/278四、實驗步驟4.倒平板（每組倒6或8塊營養(yǎng)瓊脂平板）（1）熔化培養(yǎng)基：電爐加熱熔化120mL（或160mL）那瓶營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（電爐加熱時人要在旁邊看著，防止培養(yǎng)基爆沸！）。（2）倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右（用手抓瓶子不燙手）后，取無菌培養(yǎng)皿，每皿倒入15～20mL培養(yǎng)基（自然鋪滿整個底面為準），等凝固后備用。2021/6/279四、實驗步驟2021/6/2710四、實驗步驟5.瓊脂平板劃線分離法瓊脂平板劃線分離的方法一般有連續(xù)劃線分離法和分區(qū)劃線分離法。（1）連續(xù)劃線分離法（每人劃1塊營養(yǎng)瓊脂平板）a.滅菌接種環(huán)，冷卻后取適量混勻的菌液。b.在培養(yǎng)基表面連續(xù)“之”字形劃線，直至劃完整個平板表面。2021/6/2711四、實驗步驟連續(xù)劃線法2021/6/2712四、實驗步驟（2）分區(qū)劃線分離法（每人劃1塊營養(yǎng)瓊脂平板）a.滅菌接種環(huán)。b.冷卻后，蘸取少許混勻的菌液，劃線于平板培養(yǎng)基表面a處。c.再將接種環(huán)滅菌。d.冷卻后，從a處將菌劃出至b處。e.接種環(huán)再次滅菌。f.從b處劃出至c處。g.再次滅菌接種環(huán)。h.從c處劃出至d處。i.將平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。2021/6/2713四、實驗步驟分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)2021/6/27142021/6/2715四、實驗步驟2021/6/2716四、實驗步驟6.稀釋涂布法（每組稀釋10-2，10-3，10-4稀釋度菌液各涂布1塊平板）（1）倒平板：電爐加熱熔化其中一瓶60mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右（用手抓瓶子不燙手）后，取3個無菌培養(yǎng)皿，每皿倒入15～20mL培養(yǎng)基（自然鋪滿整個底面為準），等凝固后備用。（2）取4支裝有9mL無菌生理鹽水的試管，依次編號10-1，10-2，10-3，10-4，再取3個倒好營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平板，分別編號10-2，10-3，10-4

。2021/6/2717（3）稀釋菌液。取1支無菌移液管，按無菌操作的方法吸取1mL菌液于10-1試管中。另取1支無菌移液管，在10-1中吹吸數(shù)次，混勻后吸取1mL菌液至10-2管中。另取1支無菌移液管，在10-2中吹吸數(shù)次，混勻后吸取1mL菌液至10-3管中。另取1支無菌移液管，在10-3中吹吸數(shù)次，混勻后吸取1mL菌液至10-4管中。（注意移液管不能混用）四、實驗步驟2021/6/2718四、實驗步驟（4）用無菌移液管分別吸取10-2，10-3，10-4三個稀釋度的菌液各0.1mL，加入相應編號的營養(yǎng)瓊脂平板中。（注意移液管不能混用）（5）用無菌涂布棒涂抹均勻。（涂抹不同稀釋度菌液要用不同的涂布棒）（6）等菌液吸收進培養(yǎng)基后將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。2021/6/2719四、實驗步驟2021/6/2720四、實驗步驟2021/6/2721四、實驗步驟7.稀釋傾注法（每組稀釋10-2，10-3，10-4稀釋度菌液各加1mL菌液到平板，傾注培養(yǎng)基分離）（1）熔化培養(yǎng)基。電爐加熱熔化另一瓶60mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，將熔化的培養(yǎng)基放于45℃水浴中保溫待用。（2）取4支裝有9mL無菌水的試管，依次編號10-1，10-2，10-3，10-4

，再取3個無菌空平板，分別編號10-2，10-3，10-4

。（3）稀釋菌液。取1支無菌移液管，按無菌操作的方法吸取1mL菌液于10-1試管中。另取1支無菌移液管，在10-1中吹吸數(shù)次，混勻后吸取1mL菌液至10-2管中。另取1支無菌移液管，在10-2中吹吸數(shù)次，混勻后吸取1mL菌液至10-3管中。另取1支無菌移液管，在10-3中吹吸數(shù)次，混勻后吸取1mL菌液至10-4管中。2021/6/2722四、實驗步驟（4）用無菌移液管分別吸取10-2，10-3，10-4三個稀釋度的菌液各1mL，加入相應編號的空平板中。（5）取保溫于45℃水浴中的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入上述平板中，每板倒入15～20mL培養(yǎng)基，立即平面旋搖使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，蓋上平板蓋子。（6）等培養(yǎng)基凝固后將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。2021/6/2723五、注意事項1.接種環(huán)在接種前后都要消毒。2.接種環(huán)消毒后伸入菌種管蘸取菌種之前，要在試管內(nèi)壁上靠一靠，以冷卻鉑絲的溫度，使不至于燙傷菌種。3.用接種環(huán)在培養(yǎng)基表面劃線分離時，不要太用力，以免劃破培養(yǎng)基。4.培養(yǎng)