T-LTIA 25-2024 魚肉中孔雀石綠殘留物的快速檢測表面增強(qiáng)拉曼光譜法

ICS67.120.30CCSB50LTIARapiddetectionofmalachitegreenresiduesinfishIT/LTIA25—2024前言 II III 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4方法原理 5試劑與材料 6儀器和設(shè)備 7試樣的制備與保存 7.1試樣的制備 27.2試樣的保存 2 8.1提取 38.2凈化 38.3測定 38.4結(jié)果的判定 38.5復(fù)檢和確證 39方法的靈敏度和準(zhǔn)確性驗證 9.1靈敏度 49.2準(zhǔn)確性驗證 410檢測報告 附錄A（資料性）孔雀石綠拉曼光譜示例 A.1孔雀石綠的拉曼光譜 A.2含有不同濃度孔雀石綠的魚肉樣品的表面增強(qiáng)拉曼光譜 參考文獻(xiàn) IIT/LTIA25—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由深圳市生命科技產(chǎn)學(xué)研資聯(lián)盟提出并歸口。本文件起草單位：華測檢測認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司、江南大學(xué)、上海交通大學(xué)、深圳華大海洋科技有限公司、深圳市生命科技產(chǎn)學(xué)研資聯(lián)盟本文件主要起草人：李家欣、邱險輝、尹麗麗、謝云飛、吳蘊(yùn)雯、游欣欣、孫瑩瑩、劉文秋、李陶莎、武慶超IIIT/LTIA25—2024孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛用于治療魚類的真菌和寄生蟲感染。然而，由于其潛在的致癌和誘變性，其使用引起了人們的擔(dān)憂。攝入孔雀石綠污染的魚可能會導(dǎo)致各種健康問題，包括肝損傷和腫瘤形成。因此，包括歐盟和美國在內(nèi)的多個國家已經(jīng)禁止或限制了在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用孔雀石綠。盡管有這些規(guī)定，孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的非法使用仍然是一個持續(xù)的問題，特別是在那些監(jiān)管執(zhí)行可能較弱的發(fā)展中國家?？兹甘G在魚和魚產(chǎn)品中的殘留對消費(fèi)者健康和環(huán)境構(gòu)成了重大風(fēng)險。因此，開發(fā)準(zhǔn)確、快速和可靠的檢測方法以確保魚產(chǎn)品的安全并保護(hù)公共健康是至關(guān)重要的。表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）是一種先進(jìn)的分析技術(shù)，可以以高靈敏度和選擇性檢測化學(xué)化合物的微量。這種方法依賴于通過納米結(jié)構(gòu)表面或納米粒子的存在來增強(qiáng)拉曼散射信號，從而可以檢測到微量濃度的目標(biāo)物質(zhì)。在孔雀石綠檢測的背景下，SERS相比傳統(tǒng)的方法，如高效液相色譜（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA提供了幾個優(yōu)勢。這些優(yōu)點包括更快的分析時間，更高的靈敏度，和更低的檢測限度。此外，SERS可以輕松集成到便攜式設(shè)備中，為水產(chǎn)養(yǎng)殖設(shè)施現(xiàn)場分析提供了多功能和用戶友好的工具。制定一個使用SERS方法檢測魚類中孔雀石綠殘留的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)對于各方面檢測標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)，確保結(jié)果的可靠性以及促進(jìn)全球貿(mào)易是至關(guān)重要的。它將為實驗室、監(jiān)管機(jī)構(gòu)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供清晰的指導(dǎo)，從而改善質(zhì)量控制，提高消費(fèi)者信心，減少健康風(fēng)險。此外，采用這個標(biāo)準(zhǔn)將鼓勵進(jìn)一步的研究和開發(fā)基于SERS的檢測方法，推進(jìn)監(jiān)測水產(chǎn)養(yǎng)殖及其他領(lǐng)域有害物質(zhì)的解決方案。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及5.2中相應(yīng)內(nèi)容的相關(guān)專利的使用。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)承諾，愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。表1中列出的專利權(quán)人持有本文件涉及的專利。表1持有本文件涉及的專利的專利權(quán)人相關(guān)信息專利持有人地址華測檢測認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司深圳市寶安區(qū)新安街道興東社區(qū)華測檢測大樓江南大學(xué)江蘇省無錫市蠡湖大道1800號請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。1T/LTIA25—2024魚肉中孔雀石綠殘留物的快速檢測表面增強(qiáng)拉曼光譜法本文件規(guī)定了采用表面增強(qiáng)拉曼光譜法快速測定魚肉中孔雀石綠殘留量的方法。本文件適用于魚肉中孔雀石綠的表面增強(qiáng)拉曼光譜快速篩查檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法3術(shù)語和定義3.1表面增強(qiáng)劑surfaceenhancer能夠顯著增強(qiáng)吸附在其表面的分子的拉曼散射信號的納米結(jié)構(gòu)材料。3.2空白樣品blanksamples不含目標(biāo)分析物，且組成及物理化學(xué)性質(zhì)與檢測樣品相同或充分相似的樣品。[來源：GB/T32467-2015，有修改]4方法原理試樣中的孔雀石綠殘留用乙腈提取，經(jīng)中性氧化鋁柱凈化后，用表面增強(qiáng)拉曼檢測儀測定?？兹甘G分子與表面增強(qiáng)劑混合后，目標(biāo)分子吸附在表面增強(qiáng)納米粒子上從而增強(qiáng)其拉曼散射信號。表面增強(qiáng)拉曼檢測儀可通過自動識別特征峰對孔雀石綠進(jìn)行定性檢測。5試劑與材料本方法所用水為GB/T6682規(guī)定的三級水。5.1.1乙腈（CH3CN分析純。5.1.2醋酸銨（CH3COONH4分析純。5.1.3無機(jī)鹽混凝劑：1mol/L氯化鈉水溶液，或其他相當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽溶液。5.1.4醋酸銨溶液（5mmol/L稱取0.385g醋酸銨，用水溶解，定容至1000mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。5.2標(biāo)準(zhǔn)品5.2.1孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（CAS569-64-2純度≥99.0%。2T/LTIA25—20245.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.3.1孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（50μg/mL）稱取5.0mg（精確至0.01mg）孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，-18℃避光保存，有效期3個月。5.3.2孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（0.5μg/mL）吸取1.00mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，-18℃避光保存，5.3.3孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5μg/L）吸取1.00mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配。5.4材料5.4.1表面增強(qiáng)劑：納米金-三聚氰胺海綿[1]，納米金，納米銀，或其他適用。5.4.3有機(jī)0.2μm濾膜。6儀器和設(shè)備6.1表面增強(qiáng)拉曼光譜儀。6.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速=4000r/min。6.4渦旋儀。6.5勻漿機(jī)。6.6超聲波清洗儀。6.7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。6.8KD濃縮瓶：25mL。7試樣的制備與保存7.1試樣的制備取適量新鮮或解凍的空白或供試組織的可食部分，絞碎，并使均質(zhì)。a)取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試樣；b)取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試樣；7.2試樣的保存-18℃以下保存。3T/LTIA25—20248步驟稱取約5.0g(±0.01g)的試樣于50mL離心管中。加入11mL乙腈，超聲振蕩提取2min，渦旋30s，4000r/min離心5min，將上清液收集到25mL比色管中。殘渣再加乙腈11mL，重復(fù)提取一次，合并上清液。用乙腈定容至25mL，混勻備用。8.2凈化移取5.0mL上述提取液至活化的中性氧化鋁柱上，用KD濃縮瓶接收濾液。用4.0mL乙腈清洗中性氧化鋁柱并收集所有濾液。45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用乙腈將殘液定容1mL，超聲震蕩5min。加8.3測定8.3.1表面增強(qiáng)拉曼光譜儀參考條件數(shù)據(jù)采集時間≥2s。響應(yīng)范圍300cm-1~1800cm-1，或大于該響應(yīng)范圍。8.3.2樣品的測定將待測溶液、表面增強(qiáng)劑和無機(jī)鹽混凝劑按5:1:1的比例加入樣品池中，混合后進(jìn)行拉曼檢測。曝光時間為30s。8.3.3空白試樣的測定稱取5.0g空白試樣，按照8.1和8.2步驟與樣品同法操作，拉曼光譜儀檢測。8.3.4加標(biāo)試樣的測定稱取5.0g空白試樣于離心管中，加入5mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.3.3按照8.1和8.2步驟與樣品同法操作，表面增強(qiáng)拉曼光譜儀檢測。8.4結(jié)果的判定征拉曼光譜，對樣品中孔雀石綠的含量進(jìn)行判定。若同時存在上述特征峰且信噪比大于3，則檢測結(jié)果判定為陽性。陰性結(jié)果代表該樣品中不含有孔雀石綠或濃度低于5.0μg/kg。每批樣品應(yīng)同時進(jìn)行空白實驗和加標(biāo)樣品對照質(zhì)控實驗，且空白試樣測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)試樣測定結(jié)果應(yīng)為陽性。8.5復(fù)檢和確證本方法為初篩方法，若初檢結(jié)果為陽性，需要按照8.1和8.2步驟重新檢測；重復(fù)檢測結(jié)果仍為陽性，需要采用參比方法確證。參比標(biāo)準(zhǔn)為GB/T20361-2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法》。當(dāng)結(jié)果判定為陽性時，以參比標(biāo)準(zhǔn)方法確證結(jié)果為最終報告值。9方法的靈敏度和準(zhǔn)確性驗證4T/LTIA25—20249.1靈敏度該方法中孔雀石綠殘留物的檢出限為5.0μg/kg。9.2準(zhǔn)確性驗證在相同條件下進(jìn)行至少三次連續(xù)的獨(dú)立測定，結(jié)果為一致。10檢測報告檢測報告應(yīng)包含以下數(shù)據(jù):——鑒定樣品所需的所有信息；——對本文件的引用；——本文件中未指定或視為可選的任何操作細(xì)節(jié)，以及可能影響測試結(jié)果的任何事件的細(xì)節(jié)；——測試日期；——測試結(jié)果。5T/LTIA25—2024孔雀