液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定雜質(zhì)

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

目錄第一章:

基本原理第二章：質(zhì)譜在藥品雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用2第三章：質(zhì)譜在基因毒性雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用第一章:基本原理31.1

原子分子質(zhì)量1.2

離子源1.3

質(zhì)量分析器4JosephJohnThomson

1906NobelPrizeforPhysicsFrancisWilliamAston

1922NobelPrizeforChemistryWolfgangPaul

1989NobelPrizeforPhysicsJohnBennetFenn

2002NobelPrizeforChemistryKoichiTanaka

2002NobelPrizeforChemistry質(zhì)譜特殊的天平：稱量離子的質(zhì)量。

原子分子質(zhì)量MassSpectrometryisusedtodeterminethemassandstructureofmoleculesbasedonthemass-to-charge(m/z)ratioofthemolecularionanditsfragments.檢測對象：荷電粒子m/z=mass-to-chargeratio（荷質(zhì)比）=質(zhì)譜非光譜Spectroscopyn.光譜學(xué),波譜學(xué),光譜儀Spectrometry:SpectrometerAbbreviatedto:Massspec.orMS沒有光與波長的概念7原子質(zhì)量原子構(gòu)成：質(zhì)子、中子和電子?中子=1.674928610-27kg?質(zhì)子=1.672623110-27kg?電子=9.109389710-31kg?中子=1?質(zhì)子=0.99862349?電子=0.00054386734?中子=939.56MeV?質(zhì)子=938.27MeV?電子=0.511MeVE=mc28原子質(zhì)量質(zhì)量單位：碳12元素原子質(zhì)量的1/12為一個原子質(zhì)量單位?中子=939.56MeV?質(zhì)子=938.27MeV?電子=0.511MeV9精確質(zhì)量AtomMassofAtom#ofAtomsSumHydrogen1.007834040.31300Carbon12.0000033396.00000Nitrogen14.00307228.00615Oxygen15.994929143.95424Total608.27338PlusH1.0078311.00783Total609.28121Minuse-0.0005510.00055609.28066Reserpine(C33H40N2O9)10分辨率半峰寬m1分辨率=m1/(Dm/z)Dm/zatFWHM精確質(zhì)量測定先決條件１）儀器具有足夠的分辨率２）被測峰具有足夠的峰強(qiáng)度11

四極桿離子阱TOF磁質(zhì)譜四極桿飛行時間Accuracy100ppm100ppm10ppm<5ppm<1ppm-2ppmResolution<4000<400020,00060,00020,000-40,000m/zRange<4000<400020,00010,00020,000TandemMSMS2(triplequad)MSnMS2MS2MS2分辨率12同位素（isotope）定義：具有相同質(zhì)子數(shù)，不同中子數(shù)的同一元素得不同核數(shù)自然界天然同位素準(zhǔn)分子離子質(zhì)子加和物：[M+H]+陽離子加和物：[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+二聚離子：[2M+H]+、[2M+Na]+準(zhǔn)分子離子去氫離子：[M-H]-陰離子加和物：[M+Cl]-二聚離子：[2M-H]-15[M+H]+:373[M+Na]+:39516[M+H]+:822[M+NH4]+:839[M+H]+:844[M+H]+:86017第一章:基本原理181.2

離子源離子源（接口）進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器19離子源（接口）電子轟擊EI

化學(xué)電離CI電噴霧電離ESI大氣壓化學(xué)電離APCI解吸附電噴霧DESI大氣壓分析探針ASAP20工作原理：

樣品溶液從毛細(xì)管流出時，在電場與輔助氣流的作用下噴成霧狀的液滴，在加熱氣體的作用下，液滴中溶劑被蒸發(fā)，使液滴直徑逐漸變小，因而表面的電荷密度增加，當(dāng)達(dá)到雷利極限時，即表面電荷產(chǎn)生的庫侖推斥力與液體表面張力相等時，則會發(fā)生“庫侖爆炸”，把液滴炸碎，產(chǎn)生帶電的更小液滴，此過程不斷重復(fù)，直到液滴變得足夠小，表面電荷形成的電場足夠強(qiáng)，最終把樣品離子從液滴中解吸出來，形成的樣品離子通過錐孔，聚焦透鏡等進(jìn)入質(zhì)譜分析系統(tǒng)。電噴霧離子源（ESI）22電噴霧離子源23大氣壓化學(xué)電離源(APCI)帶電荷溶劑離子+++++++++++++++++++++++蒸汽加熱+分析物離子電荷轉(zhuǎn)移++++其他新型離子源24第一章:基本原理251.3

質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器四極桿（Q）離子阱（IT）飛行時間（TOF）FTICROrbital-Trap空間串聯(lián)時間串聯(lián)IonPulserTurbo2Octopole1RoughPumpTurbo1Turbo1Turbo1QuadMassFilter(Q1)CollisionCellLens1and2HiSpeedDetectorAssemblyIonBeamCompressor*Hi-ResSlicerAssemblyTurbo2IonMirrorAssemblyFlightAssemblyCollisionCellTurbo2Turbo127空間串聯(lián)時間串聯(lián)28離子阱質(zhì)譜全掃描圖譜分析質(zhì)量數(shù)選擇碰撞誘導(dǎo)解離（CID）檢測器檢測IT-TOF

離子源離子傳輸部分質(zhì)量分析器檢測器3DIontrapTimeofFlight目錄第二章：質(zhì)譜在藥品雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用3031雜質(zhì)譜雜質(zhì)：任何影響藥品純度的物質(zhì)（中國藥典）Impurity:anycomponentofasubstanceforpharmaceuticalusethatisnotthechemicalentitydefinedasthesubstance（EP）ICH相關(guān)限度32MaximumDailyDoseReportingThresholdIdentificationThresholdQualificationThreshold≤2g/day0.05%0.10%or1.0mgperdayintake(whicheverislower)0.15%or1.0mgperdayintake(whicheverislower)>2g/day0.03%0.05%0.05%液質(zhì)聯(lián)用鑒定雜質(zhì)33應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用:電噴霧質(zhì)譜:與液相高流速兼容LC-UV:純度測定MS:推測化學(xué)結(jié)構(gòu)Templatestructureidentificationmethod:Template:maincomponentfragmentationfeaturesStudyfragmentationroutesofunknownpeaksProposethestructurebasedontemplate34HPLC方法質(zhì)譜兼容HPLCESI-ITMSESI-QTOFMS碎片裂解途徑解析元素組成制備液相色譜/合成1D,2DNMR目標(biāo)化合物形成過程芐達(dá)賴氨酸芐達(dá)酸和賴氨酸復(fù)鹽醛還原酶抑制劑預(yù)防、延緩白內(nèi)障藥物HPLC：ShimadzuLC-20AT型高效液相色譜儀色譜柱：Kromasil100-5C18柱（250mm×4.6mm，5μm）流動相：0.1%乙酸-乙腈（57：43）流速：1.0ml/min柱溫：30℃波長：

227nm質(zhì)譜儀：Agilent6538四極桿飛行時間質(zhì)譜儀離子源：電噴霧離子源電壓：4000V干燥氣：11L/min霧化氣：35psi毛細(xì)管溫度：325℃掃描范圍：50-1000芐達(dá)賴氨酸芐達(dá)賴氨酸227nm302nmImpurity1：0.19%Impurity2：0.29%Impurity3：0.10%123bendazac中國藥典芐達(dá)賴氨酸芐達(dá)酸雜質(zhì)1雜質(zhì)2雜質(zhì)3芐達(dá)酸雜質(zhì)1雜質(zhì)2雜質(zhì)3負(fù)離子圖譜芐達(dá)酸裂解機(jī)理雜質(zhì)3表1負(fù)離子模式下二級質(zhì)譜圖中主要的碎片離子峰理論值與實(shí)驗(yàn)值的偏差計(jì)算Tab.1SummaryofMS2resultsforimpuritiesinnegativemode母離子子離子實(shí)驗(yàn)值計(jì)算值分子式偏差

(ppm)371(impurity3)－371.1408371.1401C23H19N2O3-1.9327327.1499327.1503C22H19N2O--1.2313313.1351313.1346C21H17N2O-1.6298298.1236298.1237C21H16NO--0.3249249.1032249.1033C16H13N2O--0.4235235.0876235.0877C15H11N2O--0.4192192.0826192.0819C14H10N-3.6雜質(zhì)結(jié)構(gòu)雜質(zhì)3核磁共振（600MHz1HNMR，150MHz13CNMR）半制備液相（Shimadzusemi-preparativeHPLC）色譜柱：AgilentPrep-C18column(30mm×250mm,10um)流動相：0.1%乙酸-乙腈（57：43）流速：1.0ml/min柱溫：30℃波長：227nm雜質(zhì)3NMR1HNMR13CNMR雜質(zhì)3HMBC芐達(dá)賴氨酸合成工藝雜質(zhì)3形成過程色甘酸鈉系列液相色譜條件開發(fā)：原料、滴眼液均適用強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)：系統(tǒng)耐用性、強(qiáng)制降解路徑鑒定9個雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中有2個未知雜質(zhì)，6個未知降解產(chǎn)物色甘酸鈉抗過敏藥，用于治療過敏性哮喘，療效較好歐洲藥典方法:色譜柱:SymmetryshieldC184.6*150mm,3.5um流動相A:乙腈-10g/l四丁基硫酸氫銨(5:95)流動相B:乙腈-10g/l四丁基硫酸氫銨(50:50)檢測波長:330nm梯度洗脫方法:0-15min:0%-100%15-20min:100%新開發(fā)方法:色譜柱:SunfireC184.6*150mm,3.5um流動相A:10mM甲酸銨流動相B:乙腈檢測波長:254nm梯度洗脫方法:0-30min:3%-50%35min:50%四丁基硫酸氫銨：離子對試劑色甘酸鈉歐洲藥典對照品原料藥滴眼液防腐劑色甘酸鈉熱破壞堿破壞氧化破壞色甘酸鈉EP對照品原料藥滴眼液Impurity1Impurity2Impurity3防腐劑Cromoglycate:469Impurity1:469Impurity2:731(468+263)Impurity3:415雜質(zhì)2元素組成:C36H27O16雜質(zhì)2雜質(zhì)361DegradationProducts光破壞堿破壞氧化破壞62降解產(chǎn)物63降解產(chǎn)物64PrecursorionsProductionsMeasuredmassCalculatedmassFormulaError(ppm)469(cromoglycate)－469.0757469.0765C23H17O11+-1.7451451.0654451.0660C23H15O10+-1.3263263.0549263.0550C13H11O6+-0.4245245.0443245.0444C13H9O5+-0.4207207.0286207.0288C10H7O5+-1.0469(impurity1)－469.0774469.0765C23H17O11+1.9451451.0677451.0660C23H15O10+3.8423423.0736423.0711C22H15O9+5.9263263.0565263.0550C13H11O6+5.7245245.0461245.0444C13H9O5+6.9207207.0284207.0288C10H7O5+-1.9高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)65降解路徑雜質(zhì)來源目錄67第三章：質(zhì)譜在基因毒性雜質(zhì)鑒定中的應(yīng)用GenotoxicimpurityRegulatoryToxicologyandPharmacology44(2006)198–211GenotoxicimpurityRegulatoryToxicologyandPharmacology44(2006)198–211達(dá)比加群酯DB-10ATTCvalue:1.5μg/dayintakeMaximum：300mg/day5.0μg/gGenotoxicimpurity島津LC-30AD超高效液相色譜儀；島津LCMS-8050三重四級桿質(zhì)譜儀島津液質(zhì)聯(lián)用儀控制軟件為LabSolutions5.72色譜柱：島津Shim-PackGISC18（2.1x50mm，2μm）流速：0.4ml/min，柱溫：40℃PDA檢測波長：254nm時間（min）流動相A（%）流動相B（%）070301.570302.010907.010907.1703010.07030UPLC梯度洗脫表接口HV：4.0kV（正離子模式），-3.0kV（負(fù)離子模式）InterfaceTemperature：350℃DLTemperature：250℃HeatingBlockTemperature：350℃NebulizingGasFlow：2.5L/minHeatingGasFlow：12L/minDryingGasFlow：8L/minDwellTime：60msGenotoxicimpurityGenotoxicimpurity圖8.溴乙酸、對氨基苯腈、DB-10混合對照色譜圖Genotoxicimpurity對氨基苯腈Y=1499.93X+491.612（r2=0.9999）線性范圍為0.4-40ng/ml溴乙酸Y=476.807X+1051.52（r