《酶工程》總復(fù)習(xí)

《酶工程》總復(fù)習(xí)整理生物酶工程主要研究?jī)?nèi)容（1）用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）如：尿激酶原和尿激酶是治療血栓病的有效藥物。用DNA重組技術(shù)將人尿激酶原的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中，可使大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)人尿激酶原，從而取代從大量的人尿中提取尿激酶。（2）用蛋白質(zhì)工程技術(shù)定點(diǎn)改變酶結(jié)構(gòu)基因（突變酶）如：酪氨酰－tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的絲氨酸），使該酶對(duì)底物ATP的親和力提高了100倍。（3）設(shè)計(jì)新的酶結(jié)構(gòu)基因，生產(chǎn)自然界從未有過(guò)的性能穩(wěn)定、活性更高的新酶。酶工程原理和基本過(guò)程菌種→擴(kuò)大培養(yǎng)→發(fā)酵→發(fā)酵酶液→酶的提取→酶成品↓原料→前處理→殺菌→酶反應(yīng)器←酶的固定化↓反應(yīng)液→產(chǎn)品提取→產(chǎn)品世界三大酶制劑公司NovoNordisk（丹麥）GenencorInternational(美國(guó)杰能科國(guó)際公司）Cuitor(芬蘭）三大公司銷售額占世界總額的70%2、米氏常數(shù)的意義Km：米氏常數(shù)，物理意義為反應(yīng)速率為最大速率Vmax一半時(shí)底物的濃度，單位與底物濃度同（1）Km是酶的一個(gè)特性常數(shù)，Km大小只與酶性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無(wú)關(guān)。當(dāng)?shù)孜锎_定，反應(yīng)溫度，pH及離子強(qiáng)度一定時(shí)，Km值為常數(shù)，可用來(lái)鑒別酶。Km一般在1×10-6~10-1mol/L之間不同的酶Km值不同，測(cè)定Km要在相同測(cè)定條件（pH、溫度、離子強(qiáng)度）下進(jìn)行。（2）Km值可用于判斷酶的專一性和天然產(chǎn)物，若一個(gè)酶有幾種底物就有幾個(gè)Km值，其中Km值最小的底物稱為該酶的最適底物，又稱天然底物。（3）可近似表示酶與底物親和力的大小。真正表示酶與底物親和力為Ks=k2/k1(注Km=k2+k3/k1)（4）已知Km可由[S]計(jì)算v，或由v計(jì)算[S]。酶活力是指一定條件下，酶所催化的反應(yīng)初速度;酶催化反應(yīng)速度用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。V=-dS/dt=dP/dt二、酶的活力單位：表示酶活力大小所用的兩個(gè)國(guó)際單位1IU：在最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱一個(gè)IU。1Kat：在最適反應(yīng)條件下，每秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱Kat單位1Kat＝6×107IU；1IU＝1/60μKat＝16.7nKat最適條件：最適溫度,最適pH、最適緩沖液離子強(qiáng)度、最適底物濃度。底物濃度要求：（1）通常很大，使酶飽和；（2）底物消耗≤5%。目前工業(yè)用酶大多數(shù)來(lái)自微生物。經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)人工操作，利用微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)獲得所需酶的技術(shù)過(guò)程稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。酶的發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)在酶生產(chǎn)的主要方法。酶發(fā)酵生產(chǎn)的前提之一：選育到性能優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物！對(duì)產(chǎn)酶微生物的要求：（1）產(chǎn)酶量高；（2）易培養(yǎng)和管理；（3）產(chǎn)酶性能穩(wěn)定；（4）利于酶產(chǎn)品的分離純化；（5）安全可靠、無(wú)毒性等。1960，Jacob和Monod提出的操縱子學(xué)說(shuō)闡明；與生物合成相關(guān)的四個(gè)基因：調(diào)節(jié)基因Regulatorgene；啟動(dòng)基因Promotergene；操縱基因Operatorgene；結(jié)構(gòu)基因Structuralgene；調(diào)節(jié)基因(R)：可產(chǎn)生一種變構(gòu)蛋白，通過(guò)與效應(yīng)物(effector)（包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。啟動(dòng)基因（P）（啟動(dòng)子）：有兩個(gè)位點(diǎn)：（1）RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)（2）cAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。CAP：分解代謝物活化劑蛋白，又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。操縱基因（Operatergene）:位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）:決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢。（需添加抗生素）細(xì)胞體積大，無(wú)細(xì)胞壁保護(hù)，對(duì)剪切力敏感。反應(yīng)過(guò)程成本高，產(chǎn)品價(jià)格貴。細(xì)胞具有錨地依賴性。原代細(xì)胞一般繁殖50代。首先，應(yīng)對(duì)被純化的酶的理化性質(zhì)有一個(gè)比較全面的了解;其次，判斷采用的方法和條件是否得當(dāng)，始終以活力回收率和純化倍數(shù)為指標(biāo)；再者，在純化工作中，往往不宜重復(fù)采用相同的步驟和條件；最后，要嚴(yán)格控制操作條件。隨著酶的逐步純凈，雜蛋白含量亦逐步降低，蛋白質(zhì)之間的相互作用力隨之下降，酶更不穩(wěn)定，因此，更要防止酶變性。（二）酶分離純化應(yīng)注意以下問(wèn)題1、防止酶變性失活：熱、pH、泡沫、重金屬等。2、選擇有效的純化方法。3、酶活性測(cè)定應(yīng)貫穿純化過(guò)程的始終。先把一定濃度的銫鹽溶液與樣品液混合均勻，也可將一定量的銫鹽加到樣品液中使之溶解。在選定的離心力作用下，經(jīng)過(guò)足夠時(shí)間的離心分離。銫鹽在離心力的作用下，在離心力場(chǎng)中沉降，自動(dòng)形成密度梯度。樣品中不同浮力密度的顆粒在其各自的等密度點(diǎn)位置上形成區(qū)帶。超臨界流體是指超過(guò)臨界溫度與臨界壓力狀態(tài)的流體。（2）超臨界CO2萃取的優(yōu)點(diǎn)①可以在接近室溫下進(jìn)行提取，有效地防止了熱敏性物質(zhì)的氧化和逸散。②CO2是一種不活潑的氣體，萃取過(guò)程中不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且屬不燃性氣體，無(wú)味，無(wú)毒，安全性非常好。③CO2氣體價(jià)格便宜，純度高，容易制取，且在生產(chǎn)中可以重復(fù)循環(huán)使用，從而有效地降低了成本。④分離工藝流程簡(jiǎn)單。⑤萃取效率高，過(guò)程易于調(diào)節(jié)。（1）等溫變壓流程等溫法T1＝T2，P1＞P2（2）等壓變溫流程等壓法T1<T2，P1=P2（3）等溫等壓吸附流程吸附法T1=T2，P1=P2（4）添加惰性氣體的分離法流程酶分子修飾的意義提高酶的活力增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性降低或消除酶的抗原性研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響(5)將引物與單鏈模板DNA配對(duì),用各種DNA聚合酶和DNA連接酶將引物延長(zhǎng),形成互補(bǔ)鏈,得到共價(jià)閉合的雙鏈DNA,也叫異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒(6)將異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞,(如E.coli).轉(zhuǎn)化為兩個(gè)同質(zhì)雙鏈質(zhì)粒,一個(gè)含的基因是天然蛋白質(zhì)編碼的,另一個(gè)是為突變體編碼的(7)將這兩個(gè)基因分離并克隆,最后產(chǎn)物是細(xì)胞轉(zhuǎn)化突變型,能合成突變體蛋白質(zhì),與母體蛋白質(zhì)僅有1個(gè)氨基酸的差別,這個(gè)氨基酸就是事先選定的突變部位.抗體酶（abzyme）：是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性，也叫催化抗體。特點(diǎn)：1、反應(yīng)專一性相當(dāng)于或超過(guò)自然酶反應(yīng)的專一性，2、催化速度有的可達(dá)到自然酶催化的水平。但一般來(lái)說(shuō)比非催化反應(yīng)快102～106倍，比天然酶催化反應(yīng)速度慢，僅為它的10-4-10-2。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)①極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開;②可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng);③在大多數(shù)情況下,能夠提高酶的穩(wěn)定性;④酶反應(yīng)過(guò)程能夠加以嚴(yán)格控制;⑤產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留,簡(jiǎn)化了提純工藝;⑥較游離酶更適合于多酶反應(yīng);⑦可以增加產(chǎn)物的收率,提高產(chǎn)物的質(zhì)量;⑧酶的使用效率提高,成本降低。固定化酶存在的缺點(diǎn)①

固定化時(shí),酶活力有損失;②增加了生產(chǎn)的成本,工廠初始投資大;③只能用于可溶性底物,而且適于催化小分子底物,對(duì)大分子底物不適宜;④與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng),特別是需要輔助因子的反應(yīng);二、固定化酶的制備原則根據(jù)應(yīng)用目的、應(yīng)用環(huán)境，選擇固定化的方法，都要遵循以下基本原則：①必須注意維持酶的催化活性及專一性。②固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化。③固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻④酶與載體必須結(jié)合牢固,從而使固定化酶能回收貯藏,利于反復(fù)使用。⑤固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性,所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。⑥固定化酶成本要低,以利于工業(yè)使用。酶?jìng)鞲衅饔缮镒R(shí)別元件和能量轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器。生物識(shí)別元件(Biologicalrecognitionelement)是酶經(jīng)固定化后形成的一種生物敏感膜結(jié)構(gòu)，對(duì)被測(cè)定的物質(zhì)有選擇性的分子識(shí)別能力。換能器(Transducer)將識(shí)別元件上進(jìn)行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。酶?jìng)鞲衅髦饕晒潭ɑ改ず妥儞Q器組成：固定化酶膜：選擇性地“識(shí)別”并催化被檢測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；變換器：把催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)儀表顯示出來(lái)。

離子液(Ionicliquid)是由有機(jī)陽(yáng)離子與有機(jī)（無(wú)機(jī)）陰離子構(gòu)成的、在室溫下呈液態(tài)的低熔點(diǎn)鹽類，揮發(fā)性低，穩(wěn)定性好。以酶為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需的設(shè)備稱為酶反應(yīng)器。酶反應(yīng)器基本上是游離酶、固定化酶或固定化細(xì)胞催化反應(yīng)的容器(附加有混合、取樣和檢測(cè)設(shè)備)。作用:酶反應(yīng)器是用于完成酶促反應(yīng)的核心裝置。它為酶催化反應(yīng)提供合適的場(chǎng)所和最佳的反應(yīng)條件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。它處于酶催化應(yīng)過(guò)程的中心地位，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。以盡可能低的成本，按一定的速度由規(guī)定的反應(yīng)物制備特定產(chǎn)物。反應(yīng)器選擇注意要點(diǎn)：（1）分子量較大-一般不采用膜反應(yīng)器；（2）溶解度低，黏度高-選用攪拌罐式或流化床式；（3）底