梅花鹿體內(nèi)胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)規(guī)程

2梅花鹿體內(nèi)胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)規(guī)程本文件確立了梅花鹿體內(nèi)胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)的流程，規(guī)定了供體的選擇與飼養(yǎng)管理、供體的同期發(fā)情超數(shù)排卵與人工授精、手術(shù)法胚胎采集與胚胎質(zhì)量鑒定、胚胎冷凍保存與解凍、胚胎移植與妊娠檢查技術(shù)操作的要求，描述了過程記錄表、照片、影像證實(shí)的方法。本文件適用于梅花鹿體內(nèi)胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)操作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T5458GB/T6682GB/T6935液氮生物容器分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法中國(guó)梅花鹿種鹿GB/T25881—2010牛胚胎NY/T1674—2008牛羊胚胎質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1900—2010畜禽細(xì)胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范DB21/T1835—2020梅花鹿飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)程DB22/T2611—2017梅花鹿冷凍精液DB21/T2749—2017梅花鹿冷凍精液人工授精技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1供體donor用于生產(chǎn)胚胎的母鹿個(gè)體。3.2受體recipient用于移植胚胎的母鹿個(gè)體。3.3陰道栓vaginalsuppository一種內(nèi)含孕酮、用特制放置器將其放入母鹿陰道的同期發(fā)情裝置。33.4拇指管goblet一端封閉，另一端開口的圓柱形貯存冷凍胚胎細(xì)管的器材。在液氮中（—196℃)不變形、不爆裂。3.5縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。CIDR：孕酮陰道栓（controlledinternaldrugreleasing）FSH:促卵泡素（follicle-stimulatinghormone）PMSG:孕馬血清促性腺激素（pregnantmareserumgonadotropin）PG:前列腺素（prostaglandin）LHRH：促黃體素釋放激素（luteinizinghormonereleasinghormone）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）BSA：牛血清白蛋白（bovineserumalbumin）4技術(shù)流程梅花鹿體內(nèi)胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)流程包括供體的選擇與飼養(yǎng)管理、供體的同期發(fā)情超數(shù)排卵與人工授精、手術(shù)法胚胎采集與胚胎質(zhì)量鑒定、胚胎冷凍保存與解凍、胚胎移植與妊娠檢查。梅花鹿體內(nèi)胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)流程見圖1。圖1梅花鹿體內(nèi)胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)流程圖45供體的選擇與飼養(yǎng)管理5.1供體的選擇供體應(yīng)滿足以下條件：a)品種優(yōu)良，生產(chǎn)性能優(yōu)秀，經(jīng)濟(jì)價(jià)值大，綜合評(píng)定等級(jí)一級(jí)以上；b)三代系譜完整，繁殖機(jī)能正常，遺傳性能穩(wěn)定；c)3歲～5歲經(jīng)產(chǎn)母鹿，體質(zhì)健康，營(yíng)養(yǎng)狀況良好5.2供體的飼養(yǎng)管理供體的飼養(yǎng)管理應(yīng)滿足以下條件：a）單圈飼養(yǎng)，杜絕人員參觀，以免引起應(yīng)激；b）超數(shù)排卵前4周～5周應(yīng)進(jìn)行短期優(yōu)飼，每只每天補(bǔ)飼胡羅卜0.25kg，精料飼喂量及配方遵守DB21/T1835—2020中5.5.3的規(guī)定；c）同期發(fā)情處理后，肌肉注射維生素A、維生素D、維生素E，劑量按照產(chǎn)品說明；d）超數(shù)排卵前4周，避免注射疫苗。6供體的同期發(fā)情、超數(shù)排卵與人工授精6.1器材和藥品6.1.1器材同期發(fā)情、超數(shù)排卵與人工授精所需主要器材應(yīng)符合附錄A中A.1的相關(guān)規(guī)定。6.1.2藥品同期發(fā)情、超數(shù)排卵與人工授精所需主要藥品應(yīng)符合附錄A中A.2的相關(guān)規(guī)定。6.2同期發(fā)情與超數(shù)排卵在發(fā)情周期的任意一天埋植CIDR，埋栓當(dāng)天記為第0天，在埋栓后第11天開始肌肉注射FSH（同時(shí)換栓每天早、晚各1次，間隔12h，4d8次，劑量遞減，總劑量10.00mL。在第6次注射FSH時(shí)撤栓，同時(shí)肌肉注射PG1.50mL，撤栓后30h～36h肌肉注射LHRH-A325μg。FSH4d注射程序見表1FHS4d注射程序56.3人工授精6.3.1種公鹿符合GB/T6935中的規(guī)定，且綜合評(píng)價(jià)等級(jí)為超特級(jí)。6.3.2冷凍精液質(zhì)量符合DB22/T2611—2017中的規(guī)定。6.3.3輸精時(shí)間撤栓后38h～44h一次輸精。6.3.4輸精方法遵守DB21/T2749—2017中7.2的規(guī)定。6.4記錄同期發(fā)情、超數(shù)排卵與人工授精后，應(yīng)填寫供體同期發(fā)情、超數(shù)排卵與人工授精記錄表，見附錄B7手術(shù)法胚胎采集與胚胎質(zhì)量鑒定7.1基本要求7.1.1現(xiàn)場(chǎng)條件7.1.1.1具有相對(duì)分開的采胚室、檢胚室、胚胎冷凍室。7.1.1.2采胚室應(yīng)寬敞明亮、無灰塵，并配有照明、上下水、工作臺(tái)、保定架等設(shè)施，宜與檢胚室相鄰。7.1.1.3采胚室和檢胚室應(yīng)配備溫度控制和紫外消毒設(shè)備，溫度宜控制在18℃~25℃,提前1天用紫外線燈照射30min～40min。7.1.2器材消毒凡是接觸鹿的器材，如手術(shù)剪、手術(shù)刀、宮頸鉗、打孔器、鑷子、創(chuàng)布、毛巾、紗布等，洗凈后放入（金屬器械用布包好）高壓滅菌器中，溫度121℃~126℃,維持30min，消毒后置于無菌箱中備用。7.1.3人員準(zhǔn)備操作人員應(yīng)穿好工作服，戴好工作帽和乳膠手套，雙手用0.1%新潔爾滅消毒。7.1.4供體準(zhǔn)備供體應(yīng)在手術(shù)前24h斷水?dāng)嗔?，避免?yīng)激。7.2器材、藥品和試劑7.2.1器材6手術(shù)法胚胎采集與胚胎質(zhì)量鑒定所需器材應(yīng)符合附錄A中A.3的相關(guān)規(guī)定。7.2.2藥品和試劑手術(shù)法胚胎采集與胚胎質(zhì)量鑒定所需藥品和試劑應(yīng)符合附錄A中A.4的相關(guān)規(guī)定。7.2.3沖胚液和保存液沖胚液配制見附錄C中C.1，保存液配制見附錄C中C.2。或者使用商品沖胚液、保存液。7.3手術(shù)法胚胎采集7.3.1胚胎采集時(shí)間應(yīng)在人工授精后的第6天進(jìn)行，人工授精當(dāng)天為第0天。7.3.2胚胎采集步驟7.3.2.1用吹管、吹針、麻醉藥將供體麻倒，運(yùn)到采胚室，放在保定架上，呈水平仰臥保定，拉出舌頭，戴上頭套。7.3.2.2位于乳房前4cm、腹中線兩側(cè)20cm區(qū)域，先用剃須剪剔除皮膚的被毛，再用刮胡刀刮凈。用濕毛巾擦凈，先用5%碘酊消毒，再用75%酒精脫碘處理。7.3.2.3升起保定架一端，呈前（頭）低后高姿勢(shì)。術(shù)部蓋上創(chuàng)布，并固定。7.3.2.4在乳房前4cm，沿腹中線用手術(shù)刀切約5cm切口，用宮頸鉗將子宮角及卵巢牽出，觀察左右卵巢上的黃體發(fā)育情況，記錄黃體數(shù)目。7.3.2.5如果卵巢上有3個(gè)以上黃體發(fā)育良好，在子宮角基部（上1/3處）用止血鉗穿孔，插入沖胚管，由沖胚管的充氣孔注入20mL沖胚液，使氣囊封阻子宮腔。在子宮角的上端（子宮角和輸卵管結(jié)合部）用打孔器打一小眼，插入套管針，拔出針芯，將裝有沖胚液的20mL注射器接到套管針上，注入20mL沖胚液（35℃~37℃),將胚胎由沖胚管的出液孔收集于培養(yǎng)皿(Φ90mm）中，用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記。抽出氣囊中液體，取下沖胚管，用同樣的方法沖取另一側(cè)子宮角的胚胎。7.3.2.6用含青霉素的生理鹽水（1瓶生理鹽水加入1支青霉素）沖洗子宮角，放回腹腔。7.3.2.7創(chuàng)口用縫合針和縫合線縫合兩層，腹膜和肌肉層連續(xù)縫合，皮膚結(jié)節(jié)縫合，外涂5%碘酊，肌肉注射獸用土霉素注射液7mL和PG2mL。7.3.2.8將供體鹿運(yùn)回鹿舍，注射解麻藥，單獨(dú)飼養(yǎng)。7.4胚胎檢出7.4.1在20℃~25℃環(huán)境條件下，將盛有沖胚液的培養(yǎng)皿放在28℃~30℃恒溫板上，靜置10min，讓其自然沉降。7.4.2在8倍～10倍體式顯微鏡下尋找胚胎，尋找到的胚胎用連有移胚針的1mL注射器或吸胚管移入盛有保存液的培養(yǎng)皿(Φ35mm）中，同一供體的胚胎應(yīng)放在一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，并記錄。7.5胚胎洗滌7.5.1將同一供體的胚胎從保存液中吸出移到另一個(gè)培養(yǎng)皿中的保存液中，洗滌1次～2次。7.5.2每次洗滌保存液應(yīng)不少于200μL，每組洗滌胚胎數(shù)不應(yīng)超過10枚，每次洗滌應(yīng)更換移胚針、注射器或吸胚管，每次洗滌胚胎帶入培養(yǎng)皿中的液體量不應(yīng)超過1%。7.5.3胚胎洗滌后，置于50倍以上體式顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育狀態(tài)，確定胚胎等級(jí)。77.6胚胎質(zhì)量鑒定7.6.1胚胎發(fā)育期7.6.1.1人工授精后第6d采集的胚胎應(yīng)處于桑椹胚階段。7.6.1.2胚胎發(fā)育期劃分應(yīng)按照GB/T25881—2010中4.4.1的規(guī)定執(zhí)行。7.6.2胚胎分級(jí)7.6.2.1胚胎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)胚胎等級(jí)劃分應(yīng)按照NY/T1674—2008中A.3.3.2.1的規(guī)定執(zhí)行。7.6.2.2胚胎質(zhì)量要求胚胎分為A、B、C、D四個(gè)等級(jí)，A、B、C級(jí)為合格，D級(jí)為不合格。7.7記錄胚胎采集及質(zhì)量鑒定后，應(yīng)由操作人員及時(shí)填寫胚胎采集與胚胎質(zhì)量鑒定記錄表，見附錄B中表B.2。8胚胎的冷凍、保存與解凍8.1器材胚胎冷凍、保存與解凍所需器材應(yīng)符合附錄A中A.5的相關(guān)規(guī)定。8.2胚胎的冷凍8.2.1冷凍液配制見附錄C中C.3?；蛘呤褂蒙唐防鋬鲆骸?.2.2胚胎要求胚胎應(yīng)處于桑葚胚至囊胚階段，胚胎質(zhì)量應(yīng)為A級(jí)或B級(jí)。8.2.3胚胎冷凍操作步驟8.2.3.1胚胎的洗滌把胚胎放進(jìn)冷凍液中洗滌2次，在第3次洗滌時(shí)裝入細(xì)管，時(shí)間不應(yīng)超過40min。8.2.3.2胚胎的裝管洗滌后應(yīng)迅速用吸卵器或移胚針將胚胎裝入0.25mL細(xì)管，每支細(xì)管宜裝1枚～2枚胚胎。胚胎裝入細(xì)管順序：冷凍液（約1.6cm）→氣泡（約0.5cm）→冷凍液（約1.6cm）→氣泡（約0.5cm）→含胚胎冷凍液（約2.5cm）→氣泡（約0.5cm）→冷凍液（約1.6cm）→氣泡（約0.5cm）→冷凍液（約1.6cm），用經(jīng)酒精燈加熱的止血鉗熱塑封口（或使用封口器封口）。胚胎裝入細(xì)管示意圖見圖2。8圖2胚胎裝入細(xì)管示意圖8.2.3.3胚胎細(xì)管的標(biāo)識(shí)胚胎細(xì)管應(yīng)標(biāo)識(shí)細(xì)管號(hào)、胚胎數(shù)量、胚胎發(fā)育期、胚胎等級(jí)、供體品種、供體號(hào)、公鹿品種、公鹿號(hào)、生產(chǎn)日期和生產(chǎn)單位等內(nèi)容，示例見附錄D中D.1。8.2.3.4胚胎冷凍步驟胚胎冷凍操作步驟如下：a)將胚胎冷凍儀預(yù)先冷卻至—6.0℃~?6.5℃;b)將裝有胚胎的細(xì)管棉塞端朝下插入冷凍槽內(nèi)平衡4min～5min；c)用經(jīng)液氮冷卻后的鑷子夾細(xì)管封口端植冰；d)植冰后平衡5min～10min；e)以0.3℃/min～0.6℃/min的速率降溫至—32℃~?35℃,投入液氮。8.2.3.5記錄胚胎冷凍結(jié)束后，應(yīng)由操作人員填寫冷凍胚胎生產(chǎn)記錄表，見附錄B中表B.3。8.3胚胎的保存8.3.1冷凍胚胎細(xì)管宜裝入拇指管內(nèi)，拇指管應(yīng)標(biāo)識(shí)供體號(hào)、公鹿號(hào)、細(xì)管數(shù)量、生產(chǎn)日期、生產(chǎn)單位，示例見附錄D中D.2。8.3.2冷凍胚胎細(xì)管應(yīng)保存的液氮罐的液氮中。8.3.3存放冷凍胚胎細(xì)管的液氮罐應(yīng)符合GB/T5458的規(guī)定。8.4胚胎的解凍胚胎解凍操作步驟如下：a)從液氮灌中取出冷凍胚胎細(xì)管；b)在空氣中（18℃~25℃)停留5s～7s；c)投入32℃~35℃水浴中停留30s～45s；d)從水浴中取出胚胎細(xì)管，用滅菌紙巾擦干細(xì)管表面水珠，再用酒精棉球擦拭細(xì)管表面；e)用細(xì)管剪剪去胚胎細(xì)管封口，將胚胎細(xì)管中的冷凍液及胚胎推出到培養(yǎng)皿中；f)在體式顯微鏡下檢查，合格胚胎進(jìn)行移植。9胚胎移植與妊娠檢查9.1受體的選擇與飼養(yǎng)管理99.1.1受體的選擇受體應(yīng)滿足以下條件：a)2歲～4歲經(jīng)產(chǎn)鹿，生產(chǎn)性能較低；b)體質(zhì)健康，繁殖機(jī)能正常；c)膘情適中，體型相對(duì)較大；d)母性好，無惡癖。9.1.2受體的飼養(yǎng)管理應(yīng)符合5.2中的相關(guān)規(guī)定。9.2受體的同期發(fā)情9.2.1器材和藥品9.2.1.1受體同期發(fā)情所需器材應(yīng)符合附錄A中A.1的相關(guān)規(guī)定。9.2.1.2受體同期發(fā)情所需藥品應(yīng)符合附錄A中A.2的相關(guān)規(guī)定。9.2.2同期發(fā)情處理9.2.2.1新鮮胚胎受體宜早于供體一天埋植CIDR和撤出CIDR，撤栓時(shí)肌肉注射PMSG330IU。9.2.2.2冷凍胚胎在發(fā)情周期任意一天埋植CIDR，埋栓當(dāng)天記為第0天，在埋栓后第12天～14天撤栓，同時(shí)肌肉注射PMSG330IU。9.3胚胎移植9.3.1器材和藥品9.3.1.1胚胎移植所需器材應(yīng)符合附錄A中A.6的相關(guān)規(guī)定。9.3.1.2胚胎移植所需藥品應(yīng)符合附錄A中A.7的相關(guān)規(guī)定。9.3.2移植時(shí)間9.3.2.1新鮮胚胎與供體胚胎采集同一天進(jìn)行。胚胎鑒定合格后2h內(nèi)完成移植。9.3.2.2冷凍胚胎受體撤出CIDR后第8d～9d進(jìn)行。解凍后胚胎應(yīng)在10min內(nèi)完成移植。9.3.3移植要求挑選單側(cè)卵巢有黃體的受體進(jìn)行胚胎移植。9.3.4胚胎要求9.3.4.1移植的新鮮胚胎質(zhì)量應(yīng)達(dá)到B級(jí)（含B級(jí)）以上。9.3.4.2移植的冷凍胚胎質(zhì)量應(yīng)為A級(jí)。9.3.5移植方法9.3.5.1術(shù)前準(zhǔn)備受體手術(shù)前24h斷水?dāng)嗔希苊鈶?yīng)激。9.3.5.2胚胎移植操作步驟胚胎移植操作步驟如下：a)符合7.3.2.1中的相關(guān)規(guī)定；b)符合7.3.2.2中的相關(guān)規(guī)定；c)在乳房前4cm、腹中線兩側(cè)10cm處用手術(shù)刀各切約1cm切口，一側(cè)插入打孔器和內(nèi)窺鏡，另一側(cè)插入宮頸鉗，通過內(nèi)窺鏡和宮頸鉗相互配合觀察左右卵巢上的黃體發(fā)育情況；d)把卵巢上有黃體一側(cè)子宮角用宮頸鉗拉出，在子宮角基部（上1/3處）用打孔器打一小孔，用連接有移胚針的1mL注射器把含有胚胎的0.1mL～0.2mL的保存液注入子宮內(nèi)；e）符合7.3.2.6中的相關(guān)規(guī)定；f）左右創(chuàng)口各縫合1針，外涂5%碘酊，同時(shí)肌肉注射青霉素400IU或獸用土霉素注射液5mL和黃體酮1mL；g）移植鹿運(yùn)回鹿舍，注射解麻藥，單獨(dú)飼養(yǎng)，精心照顧。9.4妊娠檢查在胚胎移植后50d用超聲波儀進(jìn)行檢查，確定母鹿是否懷孕及胚胎發(fā)育情況。9.5記錄胚胎移植和妊娠檢查后，應(yīng)由操作人員填寫受體胚胎移植與妊娠檢查記錄表，見附錄B中表B.4。10證實(shí)方法梅花鹿體內(nèi)胚胎生產(chǎn)與移植過程中應(yīng)保留各環(huán)節(jié)的記錄表、照片和影像等。查驗(yàn)環(huán)節(jié)的記錄表、照片和影像包括：a)供體同期發(fā)情、超數(shù)排卵與人工授精記錄表；b)胚胎采集與胚胎質(zhì)量鑒定記錄表、照片及影像；c)冷凍胚胎生產(chǎn)記錄表；d)受體胚胎移植與妊娠檢查記錄表、照片及影像。器材、藥品及試劑A.1同期發(fā)情、超數(shù)排卵與人工授精所需主要器材吹管（內(nèi)徑2cm、長(zhǎng)135cm）、吹針（2mL）、注射器（2mL、5mL）、恒溫水浴箱、細(xì)管剪、輸精槍（0.25mL）、輸精槍外套、一次性長(zhǎng)臂塑料手套等。A.2同期發(fā)情、超數(shù)排卵與人工授精所需主要藥品麻醉藥（鹽酸賽拉唪）、解麻藥（鹽酸苯噁唑）、孕酮陰道栓（CIDR）、促卵泡素（FSH）、氯前列烯醇鈉（PG）、獸用注射用促黃體素釋放激素（LHRH-A3）、生理鹽水等。A.3手術(shù)法胚胎采集與胚胎質(zhì)量鑒定所需器材吹管、吹針、體視顯微鏡、腹腔內(nèi)窺鏡、恒溫水浴箱、高壓滅菌器、恒溫板（28℃)、保定架（自制）、打孔器、套管針、沖胚管（F16）、注射器（1mL、2mL、5mL、20mL）、一次性無菌培養(yǎng)皿 (Φ90mm、Φ35mm）、剃須剪、刮胡刀、手術(shù)剪（13cm）、手術(shù)刀、縫合針、縫合線、止血鉗、宮頸鉗、移胚針、記號(hào)筆、乳膠手套、創(chuàng)布、無菌紗布等。A.4手術(shù)法胚胎采集與胚胎質(zhì)量鑒定所需藥品及試劑麻醉藥（鹽酸賽拉唪）、解麻藥（鹽酸苯噁唑）、沖胚液、保存液、冷凍液、0.1%新潔爾滅、75%酒精、生理鹽水、5%碘酊、青霉素、鏈霉素、獸用注射用土霉素、前列腺素（PG）等。A.5胚胎冷凍、保存與解凍所需器材移胚針、注射器（1mL）、培養(yǎng)皿(Φ35mm、Φ90mm）、記號(hào)筆、酒精燈、鑷子、封口器。A.7胚胎移植與妊娠檢查所需主要器材吹管、吹針、注射器（1mL2mL）、移胚針、液氮罐、保定架、腹腔內(nèi)窺鏡、鑷子、剃須剪、刮胡刀、手術(shù)刀、縫合針、縫合線、套管針、宮頸鉗、獸用B超儀、乳膠手套等。A.8胚胎移植與妊娠檢查所需主要藥品麻醉藥（鹽酸賽拉唪）、解麻藥（鹽酸苯噁唑）、保存液、75%酒精、5%碘酊、黃體酮、青霉素、鏈霉素、獸用注射用土霉素、0.1%新潔爾滅。（資料性）梅花鹿體