植物工廠化育苗教學(xué)課件 6植物組培脫毒

植物組培脫毒——植物工廠化育苗組培脫病毒技術(shù)植物通過什么方式侵染到病毒？植物遭受病毒有哪些癥狀，有哪些危害？為什么用組培技術(shù)進(jìn)行植物脫病毒，植物脫病毒的意義？怎樣脫病毒，組培脫毒技術(shù)方法？具體園藝植物、農(nóng)作物脫毒方法。外部癥狀（外觀表現(xiàn)不正常狀態(tài)植物表現(xiàn)出各種癥狀）內(nèi)部癥狀（組織和細(xì)胞病變，新陳代謝等生理機(jī)能受到干擾：改變寄主植物的正常代謝活動(dòng)、干擾呼吸作用，光合作用，酶的活性及激素的代謝細(xì)胞病變、篩管壞死等）葉片卷曲不舒展葉片失綠變黃椰子死亡病毒在40年間毀壞了近3000萬椰子植株，每年持續(xù)毀壞50萬株1955年遍布?xì)W美的馬鈴薯退化病毒帶入我國，僅河北中部地區(qū)減產(chǎn)50%-70%，給種植者帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失葡萄扇葉病毒一般可減產(chǎn)20-50%，且果品質(zhì)量下降。利用其枝條做繁殖材料時(shí)，則枝條的扦插生根力下降60%以上，且嫁接成活率僅為30-50%草莓皺縮病毒癥狀：葉片畸形，沿葉脈出現(xiàn)小的、不規(guī)則褪綠斑及壞死斑危害：繁殖力下降果實(shí)變小。草莓產(chǎn)量大幅度下降，甚至絕產(chǎn)。亞洲、非洲和南美洲等木薯種植區(qū)普遍發(fā)生，重病田產(chǎn)量損失通常在30-40%之間，嚴(yán)重時(shí)毀種絕收。20世紀(jì)90年代非洲烏干達(dá)等國家發(fā)生木薯花葉病，給木薯的質(zhì)量造成毀滅性的打擊，造成當(dāng)?shù)貒?yán)重的糧食危機(jī)，民不聊生病毒的危害：全世界已發(fā)現(xiàn)植物病毒有近788種。由于危害可通過營(yíng)養(yǎng)體傳給后代，病毒對(duì)寄主植物可造成毀滅性危害，導(dǎo)致大幅度減產(chǎn)，甚至全株死亡。世界作物生產(chǎn)中，病毒危害程度僅次于真菌。植物生長(zhǎng)緩慢，營(yíng)養(yǎng)器官變小，品質(zhì)降低，農(nóng)作物產(chǎn)量下降（馬鈴薯減產(chǎn)70%-80%）花卉園藝植物花色退化，花朵及花冠冠幅變小，觀賞性降低。影響經(jīng)濟(jì)價(jià)值。植物病害逐漸嚴(yán)重甚至大片死亡。病毒危及表現(xiàn)害癥狀：變色（花葉、斑駁、明脈）：營(yíng)養(yǎng)被病毒所利用或病毒造成維管素壞死阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸，葉綠素形成受阻從而產(chǎn)生，花葉，斑點(diǎn)，黃化等現(xiàn)象?；ǘ浠ㄇ嗨匾矔?huì)因?yàn)椴《径淖?，花色變成雜色，還有深綠淺綠相間的花葉癥壞死斑點(diǎn)：植物對(duì)病毒過敏性反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞和組織死亡，變成枯黃甚至褐色。葉片上常呈現(xiàn)壞死斑點(diǎn)?；危ň砣~、皺縮，矮化，小果）：植物新陳代謝受或體內(nèi)生長(zhǎng)素受到干擾

病毒在不同植物間的傳播病毒是寄生物，生存與繁殖必須在寄主間轉(zhuǎn)移。從一個(gè)植株轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散到其他植物進(jìn)行傳播。

介體傳播：

介體主要以昆蟲為主：蚜蟲線蟲。還有菌真菌等

昆蟲介體：常見的蚜蟲，蚜蟲是病毒主要傳播者。還有葉蟬等

土壤中的介體：土壤中的線蟲和真菌傳播非介體傳播：

機(jī)械傳播：汁液摩擦傳播。農(nóng)具農(nóng)機(jī)、修建工具使用時(shí)對(duì)植物的污染?；蛘咧仓觊g接觸，或者人和動(dòng)物活動(dòng)造成的

無性繁殖材料和嫁接傳播：植物體內(nèi)普遍帶有病毒，使用枝條、芽作為砧木進(jìn)行嫁接，就會(huì)把病毒帶入作為砧木的植株中還有種子，花粉的傳播病毒在植物體內(nèi)移動(dòng)方式在一株植物內(nèi)從一個(gè)局部到另一個(gè)局部叫移動(dòng)。病毒在植物體細(xì)胞間的移動(dòng)通過

胞間連絲。

通過輸導(dǎo)組織系統(tǒng)轉(zhuǎn)移主要通過韌皮部移動(dòng)的方向是與營(yíng)養(yǎng)主流方向一致，可隨營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行上下雙向移動(dòng)。多數(shù)農(nóng)作物，特別是無性繁殖作物，都易受到一種或一種以上病原菌的周身浸染。例如，已知草莓能感染62種病毒和類菌質(zhì)體，因而每年都必須更新母株。病原菌的侵染不一定都會(huì)造成植物的死亡，很多病毒甚至可能不表現(xiàn)任何可見癥狀。然而，在植物中病毒的存在會(huì)減少作物的產(chǎn)量和（或）品質(zhì)。據(jù)報(bào)道，當(dāng)以特定的無毒植株取代了被病毒侵染的母株之后，產(chǎn)量最多可增加300％（平均為30％）。植物脫毒苗的意義：因此，為了提高產(chǎn)量和促進(jìn)活體植物材料的國際交換，根除病毒和其他病原菌是非常必要的。雖然通過殺細(xì)菌和殺真菌的藥物處理，可以治愈受細(xì)菌和真菌侵染的植物，但現(xiàn)在還沒有什么藥物處理可以治愈受病毒侵染的植物。植物脫毒苗的意義：由于大部分病毒都不是通過種子傳播的，因此，若是使用未受侵染或侵染程度較輕的個(gè)體的種子進(jìn)行繁殖，就有可能得到無病毒植株。不過有性繁殖后代常常表現(xiàn)遺傳變異性，在園藝和造林業(yè)中，品種的無性繁殖十分重要，而這一般都是通過營(yíng)養(yǎng)繁殖實(shí)現(xiàn)的。如果在一個(gè)品種中，并非全部母株都受到了侵染，那么只要選出一個(gè)或幾個(gè)無病株進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，也有可能建立起無病的核心原種。植物脫毒苗的意義：但是，若一個(gè)無性系的整個(gè)群體都已受到侵染，獲得無病植株的惟一辦法，就是由該植株的無病毒組織，通過組織培養(yǎng)，再生出無病毒的完整植株。植物脫毒苗的意義：脫毒技術(shù)與無病毒苗脫毒就是采用一定的方法除去植物體內(nèi)病毒的技術(shù)，最常采用的組培脫毒技術(shù)是莖尖培養(yǎng)；莖尖培養(yǎng)不但可以去病毒，而且可以去掉所有的病原菌(包括細(xì)菌、真菌等）。莖尖培養(yǎng)法建立之前，在活體上消除病毒的方法是對(duì)整個(gè)植株進(jìn)行熱處理。無病毒苗：指不含該種植物的主要危害病毒，即經(jīng)檢測(cè)主要病毒在植物體內(nèi)的存在表現(xiàn)陰性反應(yīng)的苗木。植物組培脫毒作用：1、能夠有效地保持優(yōu)良品種的優(yōu)良性狀。任何一種優(yōu)良品種均需有一個(gè)穩(wěn)定地保存其遺傳性狀的繁殖方法。離體無性繁殖可以很好地保持品種的優(yōu)良特性，是無性繁殖品種繁育的理想途徑。2、快速繁殖品種，使優(yōu)良品種迅速應(yīng)用。組培快繁繁殖周期短，不受季節(jié)限制，繁殖系數(shù)高，繁殖速度是任何其他方法所不能比的。3、生產(chǎn)無病毒種苗，防止品種退化。4、提高農(nóng)產(chǎn)品的商品率，節(jié)約耕地，便于運(yùn)輸。離體繁殖的種苗體積小，易攜帶，運(yùn)輸十分方便。（1）熱處理原理植物組織處于高于正常溫度環(huán)境時(shí)，組織內(nèi)部病毒受熱后盾化，其復(fù)制功能受到影響，繁殖就會(huì)受影響，以致病毒含量不斷降低甚至死亡，從而達(dá)到脫毒目的。熱處理對(duì)葡萄扇葉病毒，蘋果花葉病毒，康乃馨病毒等一類的圓形或線形病毒起作用

葡萄扇葉病毒在38度處理30分鐘可脫毒。早在1889年，國外有人用熱水浸甘蔗種子，得到病毒減輕的甘蔗。熱處理脫毒是英國卡尼斯，馬鈴薯塊莖37度，處理20天，卷葉病毒消失。局限性：并非所有病毒對(duì)熱處理敏感，熱處理只對(duì)等徑的，線狀的病毒和類菌質(zhì)體起作用。延長(zhǎng)處理時(shí)間，病毒鈍化效果好，同時(shí)也鈍化植物組織中的抗性因子而降低處理效果。熱處理后只有部分植物能存活。在大批量生產(chǎn)上仍受限制微莖尖脫毒原理病毒在植物體內(nèi)分布不均，越靠近生長(zhǎng)點(diǎn)，病毒濃度越稀，微莖尖不含植物病毒，特別小的芽原基不含病毒。病毒數(shù)量隨植株部位及年齡而定，越靠近莖頂端區(qū)病毒感染濃度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)（0.1-1mm區(qū)域）則幾乎不含病毒或含量少。一個(gè)比較早的證明實(shí)驗(yàn)，康乃馨斑駁病毒研究：切取康乃馨不同大小的芽，將其汁液稀釋到500倍，然后接種到指示植物莖尖上（敏感植物），只有微莖尖不染病毒寬森一團(tuán)隊(duì)研究：煙草花葉病毒在番茄中大小不一的莖尖中含量是不一樣的任何病毒都有容易侵染的植物，這個(gè)植物被侵染后會(huì)很快表現(xiàn)出癥狀---敏感植物。敏感植物就是某病毒的指示植物?？吹桨Y狀就可以判斷這個(gè)植物有沒有感染上該病毒。為什么用莖尖分生組織可以起到脫毒的作用

病毒的浸染或傳播兩種途徑：一個(gè)是胞間連絲一個(gè)是輸導(dǎo)組織（主要靠維管組織）①病毒易于通過維管系統(tǒng)而移動(dòng)，特別微小的莖尖輸導(dǎo)組織沒有形成，不能疏導(dǎo)組織傳播

病毒在細(xì)胞間移動(dòng)通過胞間連絲，通過胞間連絲速度很慢，生長(zhǎng)點(diǎn)最活躍的部分，生長(zhǎng)點(diǎn)較快，病毒復(fù)制傳播跟不上生長(zhǎng)點(diǎn)速度,所以生長(zhǎng)點(diǎn)沒病毒；②在莖尖分生組織存在高水平內(nèi)源生長(zhǎng)素，可以抑制病毒的增殖。植物脫毒的方法1、通過熱處理消除病毒（溫?zé)岑煼ǎ├貌《竞图闹髦参飳?duì)高溫忍耐性的差異，將植株置于高于正常環(huán)境的溫度（35-40度）種，使植物體內(nèi)病毒全部或部分鈍化，而寄主植物基本不受到傷害，達(dá)到脫毒目的。病毒DNA分子進(jìn)入細(xì)胞后隨植物細(xì)胞DNA一起復(fù)制。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止，失去傳染能力。作為一種物理效應(yīng)可以加速植物細(xì)胞的分裂，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競(jìng)爭(zhēng)中取勝。溫水浸漬處理脫毒密閉環(huán)境中：將要脫毒的材料置于50度左右熱水中浸漬十分鐘到數(shù)小時(shí)，即可使病毒失活。方法簡(jiǎn)單成本低。適合木本植物和休眠器官，休眠芽效果好。上限55度植物會(huì)被殺死。植物脫毒的方法2.熱空氣處理熱空氣對(duì)活躍生長(zhǎng)的莖尖效果較好，既能消除病毒，又能使寄主植物又較高的存活機(jī)會(huì)。處理方法：把旺盛生長(zhǎng)的植物移入到高溫生長(zhǎng)室中，在35~40℃，光照3000—10000lx處理一定時(shí)間即可。處理時(shí)間的長(zhǎng)短，2-4周或更長(zhǎng)時(shí)間。溫度高，脫毒時(shí)間長(zhǎng)，脫毒效果越好，植株存活率下降。試驗(yàn)?zāi)钢暝诟邷厣L(zhǎng)室中生長(zhǎng)一段時(shí)間，其頂端分生組織比次生分生組織生長(zhǎng)迅速，后切取其莖尖分生組織進(jìn)行離體培養(yǎng)。植物脫毒的方法注意：連續(xù)高溫處理會(huì)使寄主植物受到傷害，解決辦法-----高低溫交替恒溫處理：36-38度左右。

變溫處理：32、38度每隔8h交替一次。植物脫毒的方法熱處理的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):方法簡(jiǎn)單，效果明顯。缺點(diǎn):1)具有局限性，不能去除所有病毒。只對(duì)圓形病毒（蘋果花葉病毒），或?qū)€狀病毒（馬鈴薯卷葉病毒）有效；而對(duì)桿狀病毒（千日紅病毒）無效。2)熱處理后只有小部分植株能夠存活。極易使植物材料受熱枯死，造成損失3)延長(zhǎng)熱處理時(shí)間，病毒鈍化效果好，同時(shí)也可能會(huì)鈍化植物組織中的抗性因子而降低處理效果。植物脫毒的方法對(duì)于熱處理時(shí)間長(zhǎng)短要慎重決定，時(shí)間太長(zhǎng)，對(duì)于植株有傷害。據(jù)報(bào)道，在菊花中，熱處理的時(shí)間由十天增加到30天，可使無毒植株百分?jǐn)?shù)由9％增加到90％處理40天或者更長(zhǎng)并不能再增加無毒植株的百分?jǐn)?shù)，卻會(huì)顯著減少能形成植株的莖尖總數(shù)。有跡象表明，高溫處理除了可以消除病毒之外，也能鈍化寄主組織中的抗病毒因子。莖尖脫毒可以使用莖尖為外植體，也可以使用莖的頂端分生組織為外植體。莖尖是由頂端分生組織及其下方的1-3個(gè)葉原基一起構(gòu)成的。莖頂端分生組織是指莖的最幼齡葉原基上方的一部分，最大直徑約為100um，最大長(zhǎng)度約為250um。莖尖與莖頂端分生組織組培脫病毒外植體取樣與消毒為了避免外植體滅菌不徹底導(dǎo)致污染，可以先對(duì)外植體進(jìn)行無菌培養(yǎng)，確立了無菌體系后再進(jìn)行之后的步驟直接選定的植株上頂芽進(jìn)行消毒接種。采頂芽與側(cè)芽消毒接種。剪取頂芽梢段3、5厘米，剝?nèi)ゴ笕~片，用自來水沖洗干凈，超凈臺(tái)在75%酒精中浸泡30秒左右，用1-3%次氯酸鈉或5-7%的漂白粉溶液消毒10-20分鐘，最后用無菌水沖洗材料4-5次。（或莖尖外植體要用75％酒精浸蘸一下或0.1％的次氯酸鈉消毒10分鐘）。剝?nèi)∏o尖的具體方法工具：解剖鏡（體視顯微鏡），解剖針，解剖刀。為了防止莖尖變干，要在襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行解剖。（微莖尖非常小，容易干燥，）在剖取莖尖時(shí)，要把莖芽置于解剖鏡下，一手用一把細(xì)鑷子將其按住，另一手用解剖針將葉片和葉原基剝掉。當(dāng)形似一個(gè)透明閃亮的半球形頂端分生組織暴露出來之后，用一個(gè)鋒利的長(zhǎng)柄刀片將分生組織切下來，上面可以帶有葉原基，也可不帶，然后用同一工具接種到培養(yǎng)基上。注意，不要太大，以免帶有較老的組織。

莖尖培養(yǎng)

23-27℃，1500-5000LX，10-16h，

一般光照培養(yǎng)比暗培養(yǎng)效果好。

培養(yǎng)初期莖尖非常小，弱光。

莖尖生長(zhǎng)的葉片開展，光照強(qiáng)度加大。利于葉片光合作用，合成有機(jī)物。

培養(yǎng)間應(yīng)更換新鮮培養(yǎng)基。提高培養(yǎng)基中6-BA的濃度可形成大量從生芽。

生根誘導(dǎo)

誘導(dǎo)生根的方法是將2-3cm高的無根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1-2個(gè)月可生根。特點(diǎn)：既可縮短熱處理時(shí)間，提高植株成活率，又可剝離較大的莖尖，提高莖尖培養(yǎng)的成活率和脫毒率。在草莓中，將熱處理（36℃,6周）與莖尖培養(yǎng)結(jié)合起來，比單獨(dú)莖尖培養(yǎng)對(duì)于消除溫性黃邊病菌更有效。在大多數(shù)的草莓品種中，熱處理還能提高植株的生長(zhǎng)速率。馬鈴薯S病毒單獨(dú)通過熱療法或單獨(dú)通過莖尖培養(yǎng)都不容易消除。通過培養(yǎng)經(jīng)過熱處理的植株上的莖尖，已在幾個(gè)馬鈴薯品種中消除了這兩種非常穩(wěn)定的病毒。熱處理和莖尖分生組織培養(yǎng)結(jié)合起來的方法脫毒

香石竹脫毒的具體操作過和如下：（1）熱處理

將盆栽植株或離體瓶苗，在36～38℃下處理2周，或每天在36℃16小時(shí)和38℃8小時(shí)處理共30天，光照為3000lx。（2）表面消毒

選取盆栽香石竹植株葉腋間生出的側(cè)芽為外植體，先用自來水沖洗半小時(shí)，用75%的酒精消毒30秒，再用2.5%次氯酸鈣或次氯酸鈉溶液處理15分鐘,取出后用無菌蒸餾水清洗4次,用無菌濾紙吸去多余水分備用。（3）莖尖剝離

在雙筒解剖鏡下。切除葉片使芽體暴露，用解剖針剝掉幼葉，直到只剩下2個(gè)最幼小的葉原基。（4）莖尖培養(yǎng)

用小刀片切下莖尖放入培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為25℃，光照16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000lx，平均兩周進(jìn)行一次轉(zhuǎn)接，5～7周可獲得單個(gè)小植株。影響莖尖脫毒效果的因素（一）培養(yǎng)基（1）MS培養(yǎng)基是常用的較好的適于莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基之一。（提高鉀鹽和銨鹽利于莖尖生長(zhǎng)）不同植物莖尖培養(yǎng)，可以在MS培養(yǎng)基成分上做相應(yīng)調(diào)整。（2）激素使用較大的莖尖外植體（500μm或更長(zhǎng)）在不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中也能產(chǎn)生一些完整的植株。少量的（0.1－0.5mg/L）生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素利于莖尖生長(zhǎng)注意：避免使用2，4－D，因?yàn)樗ǔＤ苷T導(dǎo)外植體形成愈傷組織，廣泛使用的生長(zhǎng)素是NAA和IAA，其中NAA由于比較穩(wěn)定，效果更好。（二）外植體大小

在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小可以決定莖尖的存活率。外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機(jī)會(huì)也就越多。莖尖越小脫毒越好。但是莖尖內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，水分難長(zhǎng)時(shí)間維持，成功率低。在實(shí)際應(yīng)用中考慮脫毒又考慮成活率一般0.2-0.5mm,帶1-2個(gè)葉原基的莖尖作為培養(yǎng)材料。影響莖尖脫毒效果的因素（三）培養(yǎng)條件在莖尖培養(yǎng)中光照培養(yǎng)通常都比暗培養(yǎng)的效果好。溫度通常是25℃+2℃。胚珠表面滅菌可以提前進(jìn)行，滅菌后在無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)幾天，觀察沒有污染，滅菌成功后再進(jìn)行下一步接穗及砧木都是無菌狀態(tài)砧木—種子組培后得到的實(shí)生苗（不帶病毒）檢驗(yàn)病毒d植物組培脫毒舉例：馬鈴薯全國現(xiàn)有馬鈴薯播種面積300多萬公頃，每年需合格種薯45億公斤，脫毒原種4億公斤，脫毒小薯或微型薯45億粒。我國的馬鈴薯平均單產(chǎn)僅為13.60噸/公頃，是世界單產(chǎn)最高國這瑞士（48.80噸/公頃）的1/4。最主要的因素就是種薯質(zhì)量差，品種布局不合理。植物組培脫毒舉例1：馬鈴薯馬鈴薯病毒的種類：危害有17種之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花葉病毒、紡錘形塊莖病毒等。馬鈴薯病毒可使塊莖產(chǎn)量減少50%~80%。馬鈴薯的莖尖脫毒1，莖尖消毒一般在室內(nèi)發(fā)芽，芽經(jīng)熱處理（38℃）2周。然后取1厘米的莖尖，水洗干凈，無菌條件下先用70％的酒精浸組織15-20秒，再用2％次氯酸鈉溶液浸泡4--5min，然后用無菌水沖洗3次。2，取材和接種把消毒芽在解剖鏡下逐層剝?nèi)ビ兹~，露出圓滑的生長(zhǎng)點(diǎn)，留1-2個(gè)葉原基，0.2—0.3毫米，隨即接種于MS液體培養(yǎng)基上，每升加0.1mgNAA、0.2mgGA3、0.5BA，2%蔗糖，pH值5.8。馬鈴薯的莖尖脫毒3，培養(yǎng)條件溫度：21~25℃光照度：2000-3000lx光照時(shí)間：12h/d2-3周長(zhǎng)愈傷組織，4-5周長(zhǎng)綠點(diǎn)，3--6月長(zhǎng)成2-3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。馬鈴薯的莖尖脫毒4，繼代和生根培養(yǎng)成功的馬鈴薯脫毒苗