動(dòng)物組織基因組DNA的提取

實(shí)驗(yàn)三動(dòng)物組織基因組DNA的提取2017-3-292021/6/271實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.實(shí)驗(yàn)原理（核酸分離純化）2.實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和耗材3.實(shí)驗(yàn)步驟4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論5.動(dòng)物組織基因組DNA的提取2021/6/272一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹男∈笪舶椭刑崛〖兊幕蚪MDNA;掌握基因組DNA抽提的辦法，理解核酸分離純化的基本原理；2021/6/273二、實(shí)驗(yàn)原理DNA：主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA）、葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。RNA：存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA，rRNA，tRNA等。1、核酸的分類2021/6/274二、實(shí)驗(yàn)原理分離純化核酸總的原則：①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染；核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降到最低程度；③排除其它核酸分子的污染；2、核酸制備的一般原則2021/6/275二、實(shí)驗(yàn)原理核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)：①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程；②減少化學(xué)因素對(duì)核酸的講解；③減少物理因素的核酸的講解：機(jī)械剪切力和高溫；

④防止核酸的生物講解；2、核酸制備的一般原則2021/6/276二、實(shí)驗(yàn)原理降低溫度，改變pH值，及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如用核酸酶抑制劑更有利，幾個(gè)條件并用更好。DNA，抑制Dnase活力很容易，但防止機(jī)械拉力張力更重要；RNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制Rnase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制Rnase更重要。3、核酸酶的抑制和抑制劑2021/6/277二、實(shí)驗(yàn)原理Dnase抑制：①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，Dnase基本可以全部失活；②去垢劑、蛋白變性劑及Dnase抑制劑也可使Dnase失活；3、核酸酶的抑制和抑制劑2021/6/278二、實(shí)驗(yàn)原理RNase抑制：①操作要帶手套；②所有器皿要嚴(yán)格消毒；③試劑處理；④低溫操作；⑤在分離過程中要加入一定的Rnase抑制劑3、核酸酶的抑制和抑制劑2021/6/279二、實(shí)驗(yàn)原理4、核酸制備中常用的去垢劑核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)，用于核酸提取的去垢劑一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：①溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；②溶解核糖體上面的蛋白，使其解聚，將核酸釋放出來；③對(duì)Rnase和Dnase有一定的抑制作用；如:SDS，脫氧膽酸鈉，4-氨基水楊酸鈉，萘-1，5-二磺酸鈉等2021/6/2710二、實(shí)驗(yàn)原理5、核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑蛋白質(zhì)變性劑的作用：①使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白質(zhì)污染；②使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸；③某些蛋白質(zhì)變性劑也可抑制Rnase活性和破裂細(xì)胞的作用；如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC2021/6/2711二、實(shí)驗(yàn)原理6、核酸制備的步驟破碎細(xì)胞提取純化2021/6/2712二、實(shí)驗(yàn)原理6、核酸制備的步驟破碎細(xì)胞①微生物：溶酶菌、SDS裂解；②高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。酶法——蛋白酶、胰蛋白酶；冰凍法——反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎；③動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎；以上處理時(shí)均要加入核酸酶抑制劑。2021/6/2713二、實(shí)驗(yàn)原理6、核酸制備的步驟①首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離；②使核酸與蛋白質(zhì)分離；③除去脂類；④多糖的除去；破碎細(xì)胞提取2021/6/2714二、實(shí)驗(yàn)原理6、核酸制備的步驟根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染，并除去其它提取過程中的一系列試劑（鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。破碎細(xì)胞提取純化2021/6/2715二、實(shí)驗(yàn)原理7、核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)溫度：①4℃——最佳最簡(jiǎn)單；②-70℃——長(zhǎng)期保存的良好溫度；③-20℃；保存介質(zhì)：TE緩沖液（最常用）10mmol/LTris-HClpH8.01mmol/LEDTApH8.02021/6/2716三、實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和耗材材料：小鼠尾巴儀器：離心機(jī)、各種規(guī)格移液器、無菌移液器吸頭、分光光度計(jì)試劑：組織基因組DNA提取試劑盒

無水乙醇2021/6/2717四、實(shí)驗(yàn)步驟①在液氮中將組織塊研磨粉碎；②取不多于50mg磨碎的組織，放入1.5或2.0ml離心管中。注意：樣本的磨碎程度將影響裂解效果。③加入600ul的FLBuffer和10ulPKsolution，混合均勻。注意混合充分將有助于裂解。④于56℃溫浴15min（如果組織較難裂解完全，可以適當(dāng)延長(zhǎng)溫浴時(shí)間，甚至過夜）。然后14000g離心3min。⑤取500ul上清液，至新的2.0ml離心管中。2021/6/2718四、實(shí)驗(yàn)步驟⑥加入700ulbindingbuffer和300ul無水乙醇，顛倒混勻；⑦將混合液轉(zhuǎn)移至SpinColomn。于10000g離心1min，并棄去接液管中的液體。由于混合液體積大于750ul，請(qǐng)分兩次離心過柱。⑧向Spincolomn中加入500ul的PWBuffer。于10000g離心30s，并棄去接液管中液體。⑨向Spincolomn中加入600ul的WashBufer。于10000g離心30s，并棄去接液管中液體。⑩重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9。2021/6/2719四、實(shí)驗(yàn)步驟11再次將SpinColomn于10000g離心1min，并將SpinColomn轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5ml離心管；12向Spincolomn中加入100ul-200ulElutionBuffer,并于室溫放置1min。1310000g離心1min，并棄去SpinColomn,1.5ml離心管中液體含有DNA。2021/6/2720五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量：取出一部分的DNA，用elutionbuffer稀釋到一定的倍數(shù)，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定OD260，OD28