DB37T 3128.1-2018 群禽腺病毒感染診斷技術(shù) 第1部分：病毒分離鑒定

DB37/T3128.1—2018l群禽腺病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病IDB37/T3128.1—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：刁有祥、陳浩、唐熠、竇硯國(guó)、鄭肖強(qiáng)。1DB37/T3128.1—2018l群禽腺病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒分離鑒定1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了I群禽腺病毒樣品的采集與保存、病毒的分離和鑒定等的技術(shù)要求。熒光試驗(yàn)(IFA)適用于上述病毒的檢測(cè)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)適用于對(duì)I群禽腺病毒12種血清型病毒的鑒定。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫下列定義和術(shù)語(yǔ)適用于本文件。種血清型。3.2間接免疫熒光試驗(yàn)Indirect用對(duì)應(yīng)某一種抗原的抗體(這里被稱為一抗)與細(xì)胞孵育結(jié)合，在采用對(duì)應(yīng)一抗(也就是抗一抗)的抗體(這里被稱為二抗，二抗上偶聯(lián)有熒光素分子)與細(xì)胞孵育結(jié)合后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)為陽(yáng)性反應(yīng)。3.3利用限制性內(nèi)切酶能識(shí)別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，用于檢測(cè)DNA序列多態(tài)性。3.42雞胚肝癌上皮細(xì)胞系，來(lái)源于雄性雞肝臟腫瘤。電泳檢測(cè)區(qū)，盡可能形成有效的物理隔離，且為單一流向，不得倒流。用收集處，并通過(guò)適當(dāng)?shù)姆绞?如焚燒、或送有資質(zhì)的醫(yī)用垃圾處理公司)進(jìn)行無(wú)害化處理。用垃圾處理公司做最終處理。4.2人員操作人員應(yīng)接受實(shí)驗(yàn)室生物安全、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理、細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)。熟悉生物樣品處理、細(xì)胞培養(yǎng)、以及核酸提取、基因擴(kuò)增等分子生物學(xué)技術(shù)。a)生物安全柜；b)PCR儀；c)CO?恒溫培養(yǎng)箱(37℃恒溫);d)臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(最大轉(zhuǎn)速12000r/min);e)電泳儀；j)微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭；k)孵化器(37℃恒溫);n)電磁爐或微波爐；除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純。b)細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%血清的DMEM培養(yǎng)基);c)細(xì)胞維持液(含1%血清的DMEM培養(yǎng)基);d)甲醇：丙酮(1:1)固定液；e)抗體稀釋液PBST,見A.2;3f)商品化的FITC標(biāo)記鼠抗兔熒光抗體；g)兔抗I群禽腺病毒多克隆抗體(滅活疫苗免疫兔制備);m)商品化的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，要求在100bp～2000bp之間，有5條以上的指示條帶；o)1×TAE緩沖液，見B.2;q)核酸電泳加樣緩沖液，見B.4;y)Hexon基因擴(kuò)增引物。FAV-AF:5'-TGGACATGGGGGCGACCTA-3';FAV-BF:5'-AACGTCAATCCCTTCAACCACC-3';5.2.1室溫條件下樣品在1h~2h內(nèi)處理完畢，未能及時(shí)處理的樣本在4℃冰箱中存放，不超過(guò)24h;也可于-20℃低溫條件下保存，不超過(guò)30d;-70℃貯存最佳，不超過(guò)1年。5.2.2組織研磨液和泄殖腔拭子懸液置于-20℃低溫條件下保存，不超過(guò)2周；-70℃貯存不超過(guò)5.3.1在生物安全柜中，取1IU/mL)等滲磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值7.0~7.4,附錄A.1)配成10%～20%(g/mL)的懸液；泄殖腔拭子懸液中抗生素濃度提高5倍。加入抗生素后pH調(diào)至7.0～7.4。4DB37/T3128.1—20185.3.35.3.3樣本組織懸液反復(fù)凍融3次，經(jīng)8000r/min離心10min,取上清并置4℃過(guò)夜，次日接種SPF雞胚或LMH細(xì)胞系。6.1雞胚接種6.1.1將處理后的樣品上清，每份尿囊腔接種(3枚~5枚)9日齡~11日齡SPF雞胚，0.2mL/胚，置于孵化器中，37℃孵化120h。6.1.2棄去24h內(nèi)死亡胚，24h~120h內(nèi)死亡和存活雞胚置4℃冰箱過(guò)夜或-20℃冷凍1h,分別無(wú)菌收集尿囊液并進(jìn)行無(wú)菌檢查，無(wú)菌尿囊液盲傳三代。6.2細(xì)胞接種6.2.1將處理后的樣品上清接種單層LMH細(xì)胞，孵育1h,吸棄上清，用PBS緩沖液輕輕洗滌2次，吸棄后加入細(xì)胞維持液。6.2.270%以上單層細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后，轉(zhuǎn)移至凍存管置于-70℃保存，不超過(guò)3年。7.1間接免疫熒光法(IFA)緩沖液輕輕洗滌3次~4次，吸棄液體。每孔加入用-20℃預(yù)冷的甲醇：丙酮(1:1)固定液150μL,置于-20℃孵育10min,吸棄固定液。干燥后用PBS緩沖液洗滌7.1.2一抗孵育用抗體稀釋液(PBST,見附錄A.2)將兔抗工群禽腺病毒多克隆抗體作1:200倍稀釋，每孔加入100μL,置于濕盒中，37℃孵育1h。吸棄后用PBS洗滌3次。7.1.3二抗孵育避光條件下，用PBST將FITC標(biāo)記鼠抗兔抗體作1:200倍稀釋，每孔加入100μL,置于濕盒中，37℃孵育1h。吸棄后用PBS洗滌3次。7.1.4封片觀察加入數(shù)滴50%甘油(附錄A.3)封片，置于熒光倒置熒光顯微鏡(FITC熒光目鏡)下，觀察是否出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)。7.2限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析7.2.1DNA的提取510×PCRBuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,上游引物(50μmol/L)和下游引物(50當(dāng)加樣緩沖液中溴酚藍(lán)電泳過(guò)半至凝膠下2/5處時(shí)，停止電泳。將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀下觀按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書對(duì)陽(yáng)性條帶回收、純化，溶解于30μLddH20中。測(cè)定核酸濃度，確保核酸濃度≥10ng/μL。反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物(片段A或B)17μL、10×緩沖液2μL、HaeⅡ限制性內(nèi)切酶1μL,總體積為20μL。反應(yīng)條件：37℃孵育1h,72℃作用5min。取酶切產(chǎn)物9μL,按照7.2.4的步驟進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。7.2.11對(duì)照設(shè)置每次檢測(cè)，用相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品(LMH細(xì)胞),至少設(shè)置一個(gè)或一個(gè)以上的8結(jié)果判定8.1LMH細(xì)胞感染I群禽腺病毒，細(xì)胞腫脹變圓，呈葡萄串狀，細(xì)胞間隙增大，IFA檢測(cè)出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)。在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)(引物二聚體除外)時(shí)，檢測(cè)樣品陽(yáng)性的表明樣品中存在I群禽腺病毒，陰性樣品中無(wú)I群禽腺病毒。68.2陽(yáng)性對(duì)照接種細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，IFA檢測(cè)顯示胞漿出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)(附錄C),陰性對(duì)照無(wú)細(xì)胞病變，胞漿未出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)時(shí)，判定檢測(cè)有效；否則判定檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，陽(yáng)性樣品用于病毒的血清型鑒定。8.3以陽(yáng)性樣品培養(yǎng)物的