醫(yī)學(xué)教程 維生素的測定學(xué)習(xí)資料

維生素的測定一、概述定義維生素既不是構(gòu)成機(jī)體組織的基本原料，也不是機(jī)體的供能物質(zhì)，它是一類需求量極少、人體不能合成（或合成量很少）、主要以輔酶的形式參與代謝調(diào)節(jié)，是維持人體正常生命活動所必需的天然有機(jī)化合物。目前已確認(rèn)的有30余種，其中被認(rèn)為至關(guān)重要的有20余種。

維生素的命名

1、多根據(jù)發(fā)現(xiàn)的時間順序以英文字母排序，如維生素A、維生素B1、B2，維生素C，維生素E等。

2、

也有根據(jù)特定生理功能，如抗干眼病因子、抗壞血酸、生育酚等，

3、

按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)如視黃醇、硫胺素、煙酸、葉酸等。維生素的分類1、脂溶性維生素：能溶于脂肪或脂溶劑，在食物中與脂類共存的一類維生素，包括A、D、E、K各小類，其共同特點(diǎn)是攝入后存在于脂肪組織中，不能從尿中排除，大劑量攝入時可能引起中毒。由于可儲藏在脂肪中，故不需每天供給。2、水溶性維生素：能溶于水，包括B、C各小類，其共同特點(diǎn)是一般只存在于植物性食品中，滿足組織需要后都能從機(jī)體排出，需要每天供給。VA17－脫氫膽固醇

麥角固醇

生育三烯酚生育酚

β－胡蘿卜素VA2維生素D3(膽鈣化醇)

測定食品中維生素的含量的意義

1、在評價食品的營養(yǎng)價值，2、

尋找富含維生素的食品資源，3

指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，防止維生素缺乏癥或維生素中毒，4、

研究維生素在食品加工、貯存等過程中的穩(wěn)定性，指導(dǎo)人們制定合理的工藝及貯存條件，5、監(jiān)督維生素強(qiáng)化食品的強(qiáng)化劑量，防止因攝入過多而引起維生素中毒維生素的分析方法生物鑒定法：費(fèi)時、費(fèi)力、需要動物飼養(yǎng)場地微生物法：僅限于水溶性維生素的測定熒光法：用于硫胺素的測定儀器法：快速、靈敏、有較好的選擇性HPLC：用于大多數(shù)維生素的測定，費(fèi)用高二、脂溶性維生素的測定脂溶性維生素的理化性質(zhì)溶解性：脂溶性維生素不溶于水，易溶于苯、乙醚、丙酮、三氯甲烷、乙醇等有機(jī)溶劑。耐酸堿性：維生素A、D對酸（ACID）不穩(wěn)定，對堿穩(wěn)定；維生素E在無氧情況下，對熱、酸、堿穩(wěn)定。維生素K對酸、堿都不穩(wěn)定。耐熱、耐光、耐氧化性：

維生素A、D、E、K耐熱性都好，維生素D性質(zhì)穩(wěn)定，不易被氧化。維生素A易被氧化，光和熱會促進(jìn)其氧化。維生素E容易被氧化，對可見光穩(wěn)定但易被紫外線破壞。維生素K對熱穩(wěn)定，但容易被光、氧化劑及醇破壞。（這樣在提取時，要求盡量避光、并加入抗氧化劑）

脂溶性維生素提取的一般步驟及注意事項(xiàng)步驟：

1、取樣（如魚肝）

2、加乙醇研磨或勻漿機(jī)均質(zhì)化（常加入抗氧化劑（如焦性沒食子酸，抗壞血酸等））

3、加堿加熱皂化（Vk除外）（使脂肪水解成脂肪酸進(jìn)而形成水溶性的脂肪酸鹽）

4、水洗去除脂肪酸鹽

5、從水洗后的殘?jiān)杏糜袡C(jī)溶劑提取脂溶性維生素

6、必要時進(jìn)行減壓回旋蒸發(fā)濃縮7、HPLC分析注意事項(xiàng)：1、

在皂化和濃縮時，為防止維生素的氧化分解，加入抗氧化劑2、

對于某些含脂肪量低、脂溶性維生素含量較高的樣品，可以先用有機(jī)溶劑抽提，然后皂化，再提取。3、

對于那些對光敏感的維生素，分析操作一般需要在避光條件下進(jìn)行。一.高效液相色譜法（HPLC）測定食物中維生素A、E的含量（一）原理樣品中維生素A及維生素E經(jīng)皂化提取處理后，將其從不可皂化部分提取至有機(jī)溶劑中。用高效液相色譜法C18反相柱將維生素A和維生素E分離，經(jīng)紫外檢測器，用內(nèi)標(biāo)法定量測定（二）樣品處理1.皂化稱取適量樣品（含維生素A約3μg，維生素E各異構(gòu)體約40μg）于三角瓶中，加30mL無水乙醇，振搖使樣品分散。加入5mL100g/L抗壞血酸溶液和2.00mL苯并[e]芘溶液（5μg/L，內(nèi)標(biāo)用），混勻，加10mL氫氧化鉀溶液（50％濃度），混勻，于沸水浴上回流30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷卻。2.提取將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50mL水分2－3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL無水乙醚分2次洗皂化瓶及殘?jiān)?，乙醚液并入分液漏斗中。輕輕振搖分液漏斗2min，靜置分層，棄去水層。然后每次用約100mL水將乙醚液洗至中性，約4－5次3.濃縮將乙醚提取液經(jīng)無水硫酸鈉（約5g）濾入150mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約15mL乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下約2mL時，取下蒸發(fā)瓶，用氮?dú)獯蹈梢颐?，隨即加入2mL乙醇，充分混合、溶解提取物。將乙醇液移入塑料離心管中，于離心機(jī)上離心5min（3000r/min），上清液供色譜分析用。（三）液相色譜分析色譜推薦條件：預(yù)柱：ODS10μm,4mm×4.5cm分析柱：ODS5μm,4.6mm×25cm流動相：甲醇：水＝98：2，混勻，臨用前脫氣。紫外檢測器波長：300nm,量程0.02進(jìn)樣量：20μL流速：1.65～1.70mL/min(四)計(jì)算X=ρ/m×V×100/1000式中

X-某種維生素的含量，mg/100g;ρ-由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到某種維生素含量，μg/mL；V–樣品濃縮定容體積，mL；m–樣品質(zhì)量，g。二、比色法測定維生素A的含量（一）原理維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻相互作用，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，其深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比，在620nm波長下測定其吸光度。（二）測定方法1．樣品處理維生素A極易被光破壞，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在微弱光線下進(jìn)行。根據(jù)樣品性質(zhì)，可采用皂化法或研磨法。稱取0.5～5g樣品于錐形瓶中，加入10mL50％氫氧化鉀溶液及20～40mL乙醇，于電熱板上回流30min，至皂化完全。將皂化瓶內(nèi)混合物移至分液漏斗中，用無水乙醚充分洗滌皂化瓶，洗液并入分液漏斗內(nèi)，將水層與乙醚層分開，水層反復(fù)用乙醚抽提直至無維生素A為止。合并醚層后，先用水洗提后，再用0.5mol/L氫氧化鉀溶液洗滌除去醚溶性酸皂，再用水洗滌醚層，直至洗滌水不呈堿性（用酚酞指示劑）為止。將醚層放出，經(jīng)過無水硫酸鈉脫水后，蒸餾濃縮至剩下5mL乙醚時減壓抽氣至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中維生素A含量在適宜范圍內(nèi)，供比色測定。2．標(biāo)準(zhǔn)曲線制備準(zhǔn)確取一定量維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液于4～5個容量瓶內(nèi)，用三氯甲烷配置標(biāo)準(zhǔn)系列。再取相同數(shù)量比色管順次取1mL三氯甲烷和標(biāo)準(zhǔn)系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成標(biāo)準(zhǔn)系列，于620nm波長處，以三氯甲烷調(diào)節(jié)零點(diǎn)，將標(biāo)準(zhǔn)比色系列按順序移入光路前，迅速加入9ml三氯化銻－三氯甲烷溶液，于6s內(nèi)測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3．樣品測定于一比色管中加10mL三氯甲烷，1滴乙酸酐為空白液，另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其它比色管分別加入1mL樣品溶液及1滴乙酸酐，以下步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。（三）計(jì)算x=ρ/m×v×100/1000式中：x－樣品中維生素A含量，mg/100g（如按國際單位，1IU＝0.3ug維生素A）；ρ－由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得維生素A的含量，ug/mL；m－樣品質(zhì)量，g；v－抽取后加三氯甲烷定量的體積，mL；（四）討論1．本法摘自GB12388－90，適用于食品中維生素A的測定。2．三氯化銻有腐蝕性，不能粘在手上，三氯化銻與水能生成白色沉淀，所以不能碰到水。3．三氯化銻與維生素A生成的藍(lán)色物質(zhì)很不穩(wěn)定，要在6s內(nèi)完成吸光度的測定，否則藍(lán)色反應(yīng)逐漸消失，使結(jié)果偏低。三、水溶性維生素的測定水溶性維生素:1、

水溶性維生素包括維生素B族(維生素B1(硫胺素)、維生素B2（核黃素）、維生素B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）、維生素PP（煙酸）、葉酸、泛酸（維生素B3）、生物素（維生素B7）)維生素C(抗壞血酸)和硫辛酸，廣泛存在于動植物組織中，常以輔酶的形式存在。2、都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑。3、在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，即使加熱也不破壞；但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，如果同時加熱，更易于破壞或分解。

4它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響(如維生素B2對光，特別是紫外線敏感，易被光線破壞；維生素C對氧、銅離子敏感，易被氧化)。測定水溶性維生素的一般方法樣品處理：一般多在酸性溶液中進(jìn)行前處理，再經(jīng)淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使結(jié)合態(tài)維生素游離出來，再進(jìn)行提取。為進(jìn)一步去除雜質(zhì)，還可用活性人造沸石、硅鎂吸附劑等進(jìn)行純化處理。測定水溶性維生素的方法常有高效液相色譜法、熒光比色法、比色法和微生物法等。水溶性維生素的測定舉例維生素B1的測定(THIAMINE)

維生素B1又稱抗神經(jīng)炎素，因其分子中既含有氮（N），又含有硫（S），故又稱硫胺(素)。特別是在酸性介質(zhì)中相當(dāng)穩(wěn)定。但在堿性介質(zhì)中對熱極不穩(wěn)定。

硫胺素在堿性介質(zhì)中可被鐵氰化鉀氧化產(chǎn)生硫色素，在紫外光照射下產(chǎn)生藍(lán)色熒光，可借此以熒光比色法定量。硫胺素能與多種重氮鹽偶合呈現(xiàn)各種不同顏色，借此可用比色法測定。比色法靈敏度較低，準(zhǔn)確度也稍差，適用于含硫胺素高的樣品。熒光法和高效液相色譜法靈敏度很高，是目前常用的方法。熒光法

這里我們主要介紹熒光法

參考GB/T5009.84-2003食品中硫胺素(維生素B1)的測定

方法原理試樣在酸性溶液中加熱，提取維生素B1，經(jīng)蛋白分解酶處理，使維生素B1成為游離型。再經(jīng)層析柱純化，去除熒光淬滅物質(zhì)，同時濃縮，用堿性鐵氰化鉀溶液將其氧化成硫色素，在紫外線下，硫色素發(fā)出熒光，再給定的條件下以及沒有其他物質(zhì)干擾時，此熒光之強(qiáng)度與硫色素量成正比即與溶液中維生素B1量成正比。操作步驟1.樣品處理樣品采集后用勻漿機(jī)打成勻漿于低溫冰箱中冷凍保存，用時將其解凍后使用。

2.樣品提取3.凈化a.脫脂棉鋪于鹽基交換管的交換柱底部，再加約1g活性人造浮石使之達(dá)到交換柱的1/3高度。b.用移液管加入提取液20~60ml。c.加入約10ml熱蒸餾水沖洗交換柱，棄去洗液，重復(fù)三次。d.加入20ml50g/L酸性Kcl,收集此液于25ml刻度試管內(nèi)。涼至室溫，用250g/L酸性Kcl定容至25ml，即為凈化液。

做空白試驗(yàn)重復(fù)上述操作，將20ml維生素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液加入鹽基交換管以代替試樣提取液，即得到標(biāo)準(zhǔn)凈化液。4.氧化

將5ml試樣凈化液分別加入A、B兩個反應(yīng)瓶；同時將5ml標(biāo)準(zhǔn)凈化液分別加入A1、B1兩個反應(yīng)瓶中。Maizel-Gerson

反應(yīng)瓶氧化流程反應(yīng)瓶要同時振搖，準(zhǔn)確計(jì)時90s.5、測定

熒光測定條件：

激發(fā)波長365nm；發(fā)射波長435nm；激發(fā)波狹縫5nm；發(fā)射波狹縫5nm。

依次測定下列熒光強(qiáng)度：

a.樣品空白熒光強(qiáng)度（樣品反應(yīng)瓶A）；

b.標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度（標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)瓶A1）；

c.樣品熒光強(qiáng)度（樣品反應(yīng)瓶B）；

d.標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度（標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)瓶B1）；

6.計(jì)算式中：X──樣品中硫胺素含量，mg/100g；

U──樣品熒光強(qiáng)度；

Ub──樣品空白熒光強(qiáng)度；

S──標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度；

Sb──標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度；

c──硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，μg/ml；

V──用于凈化的硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液體積，ml；

V1──樣品水解后定容之體積，ml；

V2──樣品用于凈化的提取液體積，ml；

m──樣品質(zhì)量，g；

試劑作用1、蛋白分解酶：用于試樣的蛋白分解。2、鹽酸：水解樣品。3、氯化鉀：該熱溶液可從鹽基交換管中的浮石里解析出維生素B1。4、鐵氰化鉀堿性溶液：氧化游離的維生素B1，生成硫色素。5、正丁醇：溶解紫外熒光物質(zhì)——硫色素試劑。注意事項(xiàng)

1、加熱酸性Kcl時不能使其沸騰，熱Kcl濾速較快，而不沸則是使其不至因過飽和而在洗滌中結(jié)晶析出阻塞交換柱。

2、紫外線會分解破壞維生素B1，所以維生素B1形成后要快速測定。

3、氧化中加鐵氰化鉀是整個實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，對每個樣品所加試劑的次序、快慢、振搖時間等都必須盡量一致，尤其是用正丁醇提取硫色素時必須保證準(zhǔn)確振搖90s。維生素C的測定維生素C又名抗壞血酸，自然界存在的有L－型、D－型兩種，D－型的生物活性僅為L－型的1/10。維生素C廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜中含量都很豐富。維生素C具有較強(qiáng)的還原性，對光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性，進(jìn)一步水解則生成2，3－二酮古樂糖酸，失去生理作用。食品分析中的所謂總抗壞血酸是指抗壞血酸和脫氫抗壞血酸二者的總量，不包括二酮古樂糖酸和進(jìn)一步的氧化產(chǎn)物。

還原型抗壞血酸脫氫抗壞血酸2，3－二酮古樂糖酸氧化氧化（－）適用類別固藍(lán)鹽比色法適用于還原型抗壞血酸含量測定。（二）實(shí)驗(yàn)原理在乙酸溶液中，抗壞血酸與固藍(lán)鹽B反應(yīng)生成黃色的草酰肼-2-羥基丁酰內(nèi)酯衍生物?？稍谄渥畲笪詹ㄩL（420nm）處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。

（三）儀器與試劑1．試劑（1）2mol／L乙酸溶液吸取11.6mL冰醋酸，加水稀釋至100mL。（2）0.5mol／L乙酸溶液吸取29mL冰醋酸，加水稀釋至100mL。（3）0.25mol／L乙二胺四乙酸二鈉溶液稱取9.3g乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）加水并加熱使之溶解，冷卻并稀釋至100mL。（4）蛋白質(zhì)沉淀劑①乙酸鋅溶液稱取22.0g乙酸鋅［Zn（CH3COO）2·2H2O］，加3mL冰醋酸溶于水并稀釋至100mL。。②亞鐵氰化鉀溶液稱取10.6g亞鐵氰化鉀［K4Fe（CN）6·3H2O］，加水溶解至100mL。

（5）顯色劑固藍(lán)鹽B（FastBlueSaltB）溶液準(zhǔn)確稱取0.2g固藍(lán)鹽B，加水于100mL棕色容量瓶中定容。該溶液在室溫下貯存可穩(wěn)定3d以上。（6）抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液精密稱取0．2000g抗壞血酸，加20mL2mol／L乙酸溶液，溶解后移入100mL棕色容量瓶中，用水定容并混勻。此溶液相當(dāng)于2.0mg／mL抗壞血酸（10℃下冰箱內(nèi)貯存可穩(wěn)定2d）。（7）抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液用移液管精密吸取5.0mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于100mL棕色容量瓶內(nèi)。加5mL2mol／L乙酸溶液并用水定容。此溶液相當(dāng)于100μg／mL抗壞血酸（臨用時配制）。2．儀器可見光分光光度計(jì)；搗碎機(jī)；離心機(jī)。（四）實(shí)驗(yàn)步驟1．樣品溶液的制備（1）非蛋白性食品①液體試樣抗壞血酸含量在0.2g／L以下的試樣，混勻后可直接取樣測定；抗壞血酸含量0.2g／L以上的試樣，用水適當(dāng)稀釋后測定。②水溶性固體試樣準(zhǔn)確稱取1.0～5.0g，精確至0.001g，加5mL2mol／L乙酸溶液研磨溶解后，移入100mL棕色容量瓶內(nèi)，加水定容。③蔬菜、水果樣品稱取鮮樣可食部分20.00～50.00g，加等量的2mol／L乙酸溶液用搗碎機(jī)搗成勻漿。稱取10.0～20.0g勻漿于100mL棕色容量瓶內(nèi)，加5mL2mol／L乙酸溶液，用水定容，過濾備用。不易過濾的樣液可用離心機(jī)離心分離，上清液供測定用。

（2）蛋白性食品固體試樣混勻后精密稱取5.0～10.0g，精確至0001g；液體試樣用移液管精密吸取5.0～10.0mL于100mL棕色容量瓶內(nèi)。加10mL2mol／L乙酸溶液，乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各75mL，加水定容。將全部溶液移入離心管內(nèi)，以3000r／min離心10min，上清液供測定用。同時取與處理試樣相同量的乙酸溶液、乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液，按同一方法做試劑空白對照。2．標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取一套10mL比色管，編號，按表3－12加入各試劑。試劑配加表各管加水稀釋至10mL，混勻并在室溫下放置20min后，用1cm比色皿，以零號管為參比，于420nm處測定吸光值。以抗壞血酸含量為橫