DB37T 3005-2017 豬流行性腹瀉病毒分離與RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

DB37/T3005—2017豬流行性腹瀉病毒分離與RT-PCR檢測(cè)技術(shù)山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T3005—2017本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳家強(qiáng)、陳智、陳蕾、趙鵬偉、郭立輝、于江、李俊、杜以軍、孫文博、叢曉燕、時(shí)建立、王金寶。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。1DB37/T3005—2017本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬腸道內(nèi)容物、排泄物或乳汁樣品中豬流行性腹瀉病毒的分離與檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DEPC水：DEPC(Diethypyrocarbonate)處理并滅菌后的去離子水。DMEM:細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)。雙抗：青霉素、鏈霉素混合液(Penicillin-StreptomycinSolution)。CPE:致細(xì)胞病變效應(yīng)(cellcytopathiceffect)。4儀器與試劑除另有規(guī)定，本方法試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》,所用化學(xué)試劑應(yīng)為分析純。4.1病毒分離需要的儀器與試劑4.1.220000g高速冷凍離心機(jī)。4.1.3高壓滅菌鍋。4.1.437℃二氧化碳細(xì)胞箱。4.1.5II級(jí)生物安全柜。4.1.6超低溫冰箱：可控溫至-70℃。4.1.8雙抗(100×)(青霉素10000IU/mL,鏈霉素10000μg/mL)。4.1.10Vero細(xì)胞。4.1.11新生胎牛血清。2DB37/T3005—20174.1.14一次性10mL吸管。4.2.3PCR儀。4.2.5普通冰箱。4.2.6超低溫冰箱：可控溫至-70℃。外R5'-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3',PEDV內(nèi)F5'-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3',PEDV內(nèi)R5'-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3'。5方法采集腹瀉豬的排泄產(chǎn)物0.5g～0.7g或采集乳汁0.5mL～0.7mL。12000r/min4℃離心15min,收取上清，過(guò)濾除菌置的比例添加處理好的上清，同時(shí)加入終濃度為5μg/mL的胰酶，37℃吸附1h(注意期間每隔20min輕搖一次)。之后加入終濃度為5μg/mL胰酶的維持液(不含血清)。37℃培養(yǎng)3d,其間逐日觀察。傳5.4病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)3DB37/T3005—20175.4.1.1取250μL處理后的樣品或病毒培養(yǎng)物于1.5mL離心管中，加入750μLTrizol充分混勻，冰上靜置5min。5.4.1.2加入200μL三氯甲烷，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min后，以12000rpm4℃離心15min。5.4.1.3吸取500μL上清轉(zhuǎn)移至新1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇。-20℃放置20min,以12000rpm4℃離心15min。5.4.1.4棄去上清，用1mL預(yù)冷的75%乙醇輕輕沖洗1.5mL離心管，以12000rpm4℃離心5min。5.4.1.5棄去上清，以7500rpm4℃離心5min,吸取殘留液體，在冰盒上靜置5min~15min,使5.5第一鏈cDNA合成5.5.1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，詳見(jiàn)附錄B.15.5.2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?qū)⑴浜玫姆磻?yīng)體系輕輕混勻，如用0ligo(dT)18(0.1μg/μL),42℃孵育30min。如用RandomPrimer(N9)(0.1μg/μL),25℃孵育10min,42℃孵育30min。85℃加熱5min滅火反轉(zhuǎn)錄酶。5.5.3PCR的條件取1/10-1/5體積(2μL～4μL)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為PCR模板。每次PCR均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照具體參數(shù)詳見(jiàn)附錄B.2。外PCR反應(yīng)條件：95℃,5min;94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s;30cycle;72℃,6結(jié)果判定6.1病毒分離檢測(cè)6.2樣品檢測(cè)沒(méi)有420bp條帶判為陰性。4(資料性附錄)試劑的配制無(wú)水乙醇25mLA.21%瓊脂糖凝膠瓊脂糖0.5×TAE緩沖液A.3細(xì)胞生長(zhǎng)液含10%的胎牛血清和1%雙抗的DMEM。A.5接種病毒后維持液含1%雙抗的DMEM(不含血清)。5DB37/T3005—2017(規(guī)范性附錄)RT-PCR反應(yīng)體系成分12×TSReactionMixRandomPrimer(N19)(0.1μg/μL)orOligo(dT)18(0.1μg/μL)成分3EasyScriptTMRTEnzymeMix成分4RNA50ng~5μg成分5DEPC水補(bǔ)至20μL表B.2PCR反應(yīng)體系成分12μL~4μL成分2Fo