單味中藥對子宮肌瘤之實驗研究

單味中藥對子宮肌瘤之實驗研究

【關(guān)鍵詞】

吳茱萸

【摘要】

目的

觀察單味中藥對子宮肌瘤之影響。方法

應(yīng)用terazolium(MTT)反應(yīng)法,針對傳統(tǒng)中藥以50%乙醇之萃取物進(jìn)行子宮肌瘤細(xì)胞生長抑制試驗。結(jié)果

發(fā)現(xiàn)20種單味中藥(吳茱萸,王不留行,水蛭等)對子宮肌瘤細(xì)胞抑制率較正常子宮細(xì)胞明顯增高。結(jié)論

子宮肌瘤細(xì)胞半致死量濃度(IC50)之測定,較正常子宮細(xì)胞為低,顯示這些中藥對子宮肌瘤細(xì)胞較為敏感,應(yīng)可經(jīng)由細(xì)胞凋亡的途徑,而抑制子宮肌瘤細(xì)胞生長。

【關(guān)鍵詞】

王不留行；吳茱萸；水蛭；生黃芪；子宮肌瘤細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

EffectsofChineseherbonmyoma

【Abstract】

ByobserveinourthaditionalChineseHerbscureMyomaoftheuterusrepressgrowing

Useoftetrazolium(MTT)inourtraditionalChinese50%alcoholnaturalproductsrepreessgrowingtestthoseherbsaremoreeffectiveinrepressMyoma

Wefound20kindsofChineseHerbs(EvodiaeFeuctur,VaccariaeSemen,Hirudo，etc),thoseherbsaremoreeffectiveinrepressMyomacellthannormalMyoma

WeconcludethatDi-DargTangandVaccariaseediswelltolerated,safe,andeffective;ThetestshowsthatthoseherbsaremoresensitiveonMyomacell,Bcl-2proteincanrepressMyomacellbyapoptosis.

【Keywords】

vaccariaesemen;evodiaefeuctus;hirudo;astragaliradix;myomacell;apoptosis

子宮肌瘤是婦科最常見的良性腫瘤,由平滑肌纖維和結(jié)締組織組成,所以臨床上又稱子宮纖維瘤。子宮肌瘤好發(fā)于20～50歲的婦女,其中年齡＞40歲的婦女約有50%患有子宮肌瘤,但Cramer和Patel經(jīng)尸體解剖(autopsy)的統(tǒng)計后認(rèn)為子宮肌瘤的發(fā)生率高達(dá)75%［1］。

對于一個不需再生育的婦女而言,全子宮切除(totalhystectomy)是治療子宮肌瘤的方法之一,然而臺灣地區(qū)子宮切除術(shù)是否有過于泛濫的情形常受質(zhì)疑。有研究指出臺灣地區(qū)子宮切除率以臺北、臺中、高雄為高。變異大多可由醫(yī)療資源分布解釋,而子宮切除年齡最高分布在40～44歲占%。除癌細(xì)胞病變外,以生殖器脫垂的病變?yōu)樽罡?這可以由醫(yī)療不適當(dāng)性解釋［2］。因而子宮切除的適當(dāng)性除須由專家審視外,如果能有更多其他替代療法,也是對婦女的一種保障。

子宮肌瘤真正形成的原因,至今尚不清楚,但有不少研究認(rèn)為雌激素(estrogen)與黃體素(progesterone)與子宮肌瘤的生長有密切關(guān)系,這些激素又必須透過生長因子(growthfactor)才能運作［3］，而人絨毛膜促性腺激素(human，HCG)也能調(diào)節(jié)生長。黃體素可刺激子宮肌瘤上皮生長因子(epidermalgrowhfactor)產(chǎn)生，造成子宮肌瘤的增生和分化。子宮肌瘤雖然是由單一的細(xì)胞突變開始,而雌激素可增加雌激素接受體(estrogenreceptor,ER)與黃體素受體(progsteronereceptor,PR)也可促進(jìn)子宮肌瘤的增生。黃體素則對突變的正常子宮細(xì)胞有加速分裂和增生的作用［4］。

性腺激素釋放激素強化物(GnRHa)是經(jīng)由降低GnRH接受體而使性腺分泌減少,進(jìn)而使卵巢分泌雌激素和黃體素減少,而抑制子宮肌瘤生長［5］。根據(jù)國內(nèi)研究,GnRHa在連續(xù)注射到12周時,達(dá)到最大的療效,大部分的子宮肌瘤會縮小為原來的一半?？s小的百分比和未結(jié)合PR濃度成反比,而和未結(jié)合ER關(guān)系不大。因此GnRHa可縮小子宮肌瘤,部分取決于子宮肌瘤上未結(jié)合性激素接受體濃度所影響［6］。

子宮肌瘤屬于中醫(yī)醫(yī)學(xué)“積聚”“瘕”范圍,瘕是泛指腹腔內(nèi)的有形腫塊而言,所謂者,是指腹腔內(nèi)有形的腫塊,有一定的部位,屬血病。所謂瘕者,是指腹腔內(nèi)無形的氣塊,無一定的部位,屬氣病?！秲?nèi)經(jīng)?靈樞?水脹篇》謂;“石瘕生于胞中,寒氣客于子門,子門閉塞,氣不得通,惡血當(dāng)瀉不瀉,以留止,日益以大,狀如懷子,月事不以時下,皆生于女子,可導(dǎo)而下”?！缎ＷD人良方》謂“婦人腹中瘀者,由月經(jīng)閉積,或產(chǎn)后血未盡,或風(fēng)寒滯瘀,久而不消,則為積聚瘕矣”。因此中醫(yī)認(rèn)為,六淫之邪,七情內(nèi)傷,引起臟腑功能失調(diào),氣血不合,以致氣滯血瘀,新血與舊血凝聚成塊,結(jié)于胞室,日益長大而成子宮肌瘤。

子宮肌瘤臨床表現(xiàn)為月經(jīng)過多,經(jīng)期延長,周期縮短,或不規(guī)則子宮出血,常會伴有不同程度的貧血。中醫(yī)認(rèn)為,臟腑不合,氣滯血瘀,沖任失調(diào)是本病的主要原因,臨床上可以辨證分型治療。本病是以子宮出血為主要臨床癥狀,病久失血,而導(dǎo)致氣血兩虛,在治療時,除出血期以化瘀止血、平時破瘀消外,還必須結(jié)合補益氣血。對于瘕的治法,《內(nèi)經(jīng)》提出“堅者削之,結(jié)者散之,留者攻之,滯者導(dǎo)之”的原則;《女科經(jīng)綸》：“善治瘕者,調(diào)其氣而破其血,消其食而豁其痰,衰其大半而止”。

漢方醫(yī)學(xué)已有數(shù)千年之歷史,而且是累積經(jīng)驗的循證療法之一,由于化學(xué)藥物引起的藥害,以及食品添加物或清潔劑引起的公害等,引起人們對利用自然藥物的興趣,紛紛把目光轉(zhuǎn)向天然中藥。依據(jù)漢方的思想,絕大多數(shù)的婦女疾病是屬于體內(nèi)“血”的異常,中醫(yī)所謂的“血”,不單是指血液,也包括淋巴液或激素作用。中醫(yī)對女性的生理及病理獨具慧眼,其用藥經(jīng)驗可以說是數(shù)千年來累積而成。

中藥的運用是幾千年來前人智慧結(jié)晶所在,其內(nèi)容相當(dāng)豐富且千變?nèi)f化。從《內(nèi)經(jīng)》、《傷寒論》始,前人從藥物的升降浮沉,四氣五味,虛實補瀉,臟腑歸經(jīng),針對人體陰陽表里,寒熱虛實,把數(shù)百種藥物歸納,依據(jù)理論用于臨床。

本研究已建立細(xì)胞模式,以期能從天然產(chǎn)物中找出明確具有治療子宮肌瘤之中藥,為醫(yī)師臨床用藥提供參考,造福更多的婦女。

1

實驗材料

中藥材來源

本項研究所測試的中藥材來自臺北南京泰生堂參藥有限公司,實驗中藥材見表1。

表1

單味藥材50%酒精之萃取率略

儀器

(1)回轉(zhuǎn)式真空減壓濃縮機(jī)(SwitzerlandBUCHIRE111);(2)離心機(jī)Centrifuge5415C(Eppendorf);(3)冷凍干燥機(jī)(Eyela;Cool);(4)微量電子天秤(Shimazu,LibrorACF-200)；(5)顯微鏡(Olympus,Tokyo)；(6)二氧化碳培養(yǎng)箱(EspecBNA-211)；(7)血細(xì)胞計數(shù)器(Hemocytometer;Bright-line)；(8)組織培養(yǎng)角瓶(Corning)；(9)組織培養(yǎng)皿(Falcon)；(10)96-Well組織培養(yǎng)盤(Corning)；(11)微量吸管(Biohit)；(12)高溫滅菌器(Tomin1MedicalEquipmeneCo,LTD;TM-325)；(13)過濾膜(Coming)；(14)-80℃冰箱(EnviromentalEquip.Co;So-Low)。

子宮肌瘤細(xì)胞

由榮民醫(yī)院婦產(chǎn)科提供病理檢體。當(dāng)患者在婦產(chǎn)科門診,以內(nèi)診與超聲波掃描確診為子宮肌瘤,依臨床路徑安排入院手術(shù)治病者,以做本研究之素材。即由此類患者在手術(shù)切除后,立即切取肌瘤組織,放入轉(zhuǎn)輸液(DMEM)中,送實驗室做組織培養(yǎng)。

試藥與試劑

培養(yǎng)液

（1）DMEM(Dulbecco’sMinimumEssentialMedium)；（2）FetalBovineSerum(Hyclone:Cat)；（3）Penicillin-Strepetomycin(Seromed:CatNo.03-033-1B)；（4）L-Glutamine(Seromed:Cat)；（5）NAA(Mem-EagleNon-essentialAminoAcidsSolution)；（6）L-Glutamine200mM(Gibco:CatNo.25930-081)。

染色劑

（1）Trypanblue(Sigma)；（2）MTT:{3(4,5-dimethylthiazoled1-2-y1)-2,5-dipheyltetrasoliumbromide}(BoehringerMannheimGmbKCatNo.1465007)。

一般化學(xué)藥品

（1）DMSO(Merck,Germany,K251931,Max%H2O)；（2）SodiumHydrogenCarbonate(Merck,Germany,NaHCO3;Proanalysis)；（3）Isopropanol(Merck,Germany)。

測試藥品與酵素

（1）B-Estradiol(SigmaUSA)E-2758Lot79H0941；（2）Progesteronl(SigmaUSA)P-8783Lot80K0885；（3）Trypsin,%(SigmaUSA)Lot1077108；（4）Trypsin-EDTA(SigmaUSA)Lot1089908；（5）LSAB(Dako,Denmark,CodeNo.K0675)；（6）MonoclonalAnti-HumanProgesteronereceptors(Dako,Denmark,clonepgR636,1:50)。

2

實驗方法

單味藥之制備

將單味藥經(jīng)粉碎后,加十倍重量之50%酒精,60℃水浴回流抽取2h,趁熱過濾。同法兩次后合并濾液經(jīng)減壓濃縮制約1/10體積量。經(jīng)冷凍干燥得粉末狀濃縮物,其產(chǎn)率見表1所示,將冷凍粉末置于20℃冰柜中以備下列實驗使用。

一般溶液之配制

PBS(phosphatebuffersolution)之配制

將KCl，NaCl，NaH2PO4?及KH2PO4溶于次蒸餾500ml中,高壓減菌后使用。

MTT配制方法

稱取MTT5mg溶于10ml成濃度500μm,制完全溶解后以μm之過濾膜過濾。

檢測藥物之制備

實驗前將冷凍干燥之各種藥品精稱10mg,以1mlDMSO溶解,再用研缽細(xì)磨后,以μmmicrofilterunit過濾,分別調(diào)制成濃度為10mg/ml之stocksolution。每次檢測時,加入2μlstocksolution于每孔含198μl培養(yǎng)液中,使最后單位藥之濃度100μg/ml。

試驗細(xì)胞之制備

子宮肌瘤和正常子宮組織

從榮民醫(yī)院手術(shù)室取出后,置于含DMEM的試管中,以冰塊冷凍帶回實驗室,于1h內(nèi)切碎進(jìn)行組織培養(yǎng)。

子宮肌瘤和正常子宮組織

將其分別切成1mm之小塊,加入/mlcollagenasetypeⅡ和%trypsin各3ml,于37℃。4h后呈黏稠狀,用膠吸管打散細(xì)胞(pipetting),經(jīng)離心(1200r,4℃,5min)去上清液。加入DMEM,再離心后去上清液。加入5mlDMEM均勻分布于培養(yǎng)皿,2天換一次培養(yǎng)液,于5%CO237℃培養(yǎng)7～14天。待細(xì)胞生長形成單層細(xì)胞(monolayer)細(xì)胞數(shù)約1×106cells/ml既可使用。

試驗細(xì)胞之染色

將初代培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞,培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中,利用免疫組織化學(xué)方法,經(jīng)染色、照相后,作為試驗細(xì)胞鑒別區(qū)分之用。組織培養(yǎng)之新鮮標(biāo)本于培養(yǎng)基中,以PBS溶液清洗,再以%過氧化氫溶液浸泡30min,經(jīng)PBS溶液清洗10min,接著進(jìn)行免疫化學(xué)染色,所使用的單株抗體為抗人類黃體素接受抗體(monoclonalanti-humanprogesteronereceptorsantibody)。以適當(dāng)濃度之單株抗體與培養(yǎng)細(xì)胞作用約1h,經(jīng)PBS溶液洗10min后,以經(jīng)生物素標(biāo)示之二次抗體(biotinylatedsecon

daryantibodies)作用30min,在經(jīng)PBS溶液清洗10min后,以經(jīng)具有過氧化酶之卵蛋白作用30min,經(jīng)PBS溶液清洗10min后,以呈色劑(DAB,3,3-diaminobenzidine)呈色5min,以PBS溶液清洗,以蘇木精做對比染色,之后置于鏡下觀察照相［7～9］

Bcl-2蛋白之制備

利用%trypsin將細(xì)胞處理成懸浮液后,將細(xì)胞稀釋成2×106cells/ml。各取出1ml植入6孔培養(yǎng)盤中,使每孔約含2×106個細(xì)胞,放入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。次日,細(xì)胞生長形成單層細(xì)胞(monolayer)后,倒掉培養(yǎng)液,更換新鮮培養(yǎng)液后備用。同時各孔加入estradiol或progesterone(stocksolution濃度各為10μg/ml、100μg/ml)(13)1μl后24h,再加入中藥(stocksolution濃度為10mg/ml)10μl使?jié)舛瘸蔀?00μg/ml。24h后沖下細(xì)胞,離心(120XXr）20min去上清液后加RIPA30μl備用。第一組Estradiol(10ng/ml)；第二組Estradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三組Estradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四組Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五組Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六組對照組。

Westernblot分析法［10，11］

利用BioquantProtein(200μl)將細(xì)胞萃取物定量,按比例取出加入proteindye

3μl。將Totalproteinloading至10%SDS-PSGE后,以80V電泳3h,利用電轉(zhuǎn)印槽(Electrotransfertank)以270mA1h,將蛋白質(zhì)面SDS轉(zhuǎn)至PVGEmembrane后,加入Blockingsolution(1%BovineserumBSA)1h,分別加入Bcl-2rabbitpolyclonalIgG,α-tubulinmousemonoclonalIgM(1∶1000)4℃置1夜,再以PBST清洗,分別加入anti-rabbitIgG和anti-mouseIgG(1∶5000)1h后,再以PBST清洗后加呈色劑至呈色為止,再以清水洗去呈色劑后曬干。

半致死量濃度(Theconcentrationof50%inhibition,IC50）之測定

實驗前將冷凍干燥之各種藥品分別經(jīng)稱2、4、6、8、10、12、14、16mg以DMSO1ml溶解,再用研缽細(xì)磨后,以μlmicrofilterunit過濾,分別調(diào)至成不同濃度之stocksolution。每well加入stocksolution2μl于含198μl培養(yǎng)基中,使最后中藥濃度為40、80、120、160、200、240、280、320mg/ml。第二天觀察細(xì)胞生長情形,進(jìn)行Tetrazolium反應(yīng)法(MTTassay,計算其IC50）。

細(xì)胞毒殺百分率之計算公式

CI%=1-(實驗組之OD值/對照組之OD值）×100%。

統(tǒng)計學(xué)方法

各藥物之抑制率分別以平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示之,統(tǒng)計皆用student’st-test方法計算。

3

實驗結(jié)果

單味藥對子宮肌瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞毒性百分比(CytotxicityIndex)之比較;在20種單味藥中，王不留行、吳茱萸、生雞內(nèi)金、水蛭(100μg/ml)對子宮肌瘤的細(xì)胞毒性百分比(CytotoxityIndex)較正常細(xì)胞高很多,見表2～4、圖1。

圖1

中藥對子宮肌瘤細(xì)胞毒性百分比

表2

單味藥對正常細(xì)胞和子宮肌瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性百分比

（略）

表3

王不留行對不同濃度子宮肌瘤細(xì)胞毒性百分比

（略）

表4

王不留行對子宮肌瘤細(xì)胞之IC50略

半致死量濃度在不同細(xì)胞之測定結(jié)果,王不留行汲水置在子宮肌瘤細(xì)胞的濃度,都小于正常細(xì)胞的濃度,顯示子宮肌瘤細(xì)胞對于這些中藥較為敏感,也較正常細(xì)胞有效。

Bcl-2蛋白質(zhì)Westernblot分析法結(jié)果：正常子宮細(xì)胞和子宮肌瘤細(xì)胞在Estradiol(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2的變化。Myometriumcell和Myomacell的第二組比第三組顏色較淡,第五組比第四組顏色較淡,顯示Bcl-2較少。子宮肌瘤中Bcl-2protein受Progesterone(100ng/ml)刺激而增加,受Estradiol(10ng/ml)刺激而減少,因此第四組顏色要比第三組深,Bcl-2顯示溶媒對實驗結(jié)果影響不大,正常子宮細(xì)胞和子宮肌瘤細(xì)胞各有六組;第一組Etradiol(10ng/ml)；第二組Etradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三組Etradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四組Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五組Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六組對照組。

子宮肌瘤細(xì)胞加入王不留行的Bcl-2測定：正常子宮細(xì)胞和子宮肌瘤細(xì)胞在Estradio(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2蛋白質(zhì)的變化Myometrium和Myomacell的Westenblot第二組。第五組色較淡,顯示Bcl-2較少。

4

討論

在本實驗中單味藥三菱、莪術(shù)、生雞內(nèi)金、水蛭對子宮肌瘤的細(xì)胞毒性百分比反而比正常細(xì)胞較低。三菱、莪術(shù)辛苦,性平和,入肝、脾二經(jīng)能入血分以破血瘀,又能走氣分以氣消積,可抑制血小板聚集及血栓形成,也可擴(kuò)張血管改善微循環(huán)。生雞內(nèi)金、水蛭主術(shù)惡血、瘀血、月閉,破血瘕積聚。生雞內(nèi)金不僅能加強消積化瘀之功效,亦顧護(hù)脾胃,亦可以散血去瘀、消腫定痛,水蛭會產(chǎn)生類似前列腺環(huán)素(prostacyclin,PGI2)可抑制血小板凝集、降低血壓并釋放出胞漿素原(plaminogen)［12］。

王不留行有催乳通經(jīng)、消腫

止痛的功能,臨床上用于乳痛、睪丸炎、流行性腮腺炎。其禁忌走而不守,血證慎用,孕婦忌用。其所含王不留行皂苷(Vacsegoside),經(jīng)酸水解可生成王不留行次皂苷(Vaccaroside)及黃酮類(Saponaretin)、棉子糖(Raffinose)、香豆素、蛋白質(zhì)等。在藥理作用上具有抗早孕作用,可增加血漿和子宮組織cAMP,有抗感染作用可抑制前列腺增生,具有類似雌激素功用,對切除卵巢之白鼠可產(chǎn)生作用［13～15］。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)在除去功能不良的細(xì)胞上扮演重要角色,而Bcl-2protein可經(jīng)由一些growthfactor改變合成速率,進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡［16～18］。Bcl-2protein是一種抑制細(xì)胞凋亡基因產(chǎn)物,在子宮肌瘤中正常細(xì)胞為多。子宮肌瘤中Bcl-2protein受Progesterone(100ng/ml)刺激而增加,受estradiol(10ng/ml)刺激而減少,但在本實驗中,其增加或減少的程度并不如王不留行減少的程度來的明顯。經(jīng)由細(xì)胞凋亡而殺死肌瘤細(xì)胞,比傳統(tǒng)藥物所引發(fā)的細(xì)胞壞死(necrosis),較不易引發(fā)大范圍的周邊組織發(fā)炎或感染反應(yīng),避免對于患者產(chǎn)生更大地傷害［18］。

5

結(jié)論

藥理實驗和臨床效果可能會有些差異,可能是由于藥物在體內(nèi)吸收、代謝加上相加、相克效應(yīng)而有不同的反應(yīng),因此要發(fā)展改進(jìn)實驗?zāi)Ｊ?使其更加接近中醫(yī)辨證的實際狀。

經(jīng)由細(xì)胞毒性抑制率實驗結(jié)果得知,單味藥中以吳茱萸、王不留行、生雞內(nèi)金和水蛭效果最好。由半致死量濃度IC50在不同細(xì)胞之測定結(jié)果,更可得知這些中藥對于子宮肌瘤細(xì)胞較為有效。

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