《保健食品中14種真菌毒素含量的高通量快速測(cè)定 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》

ICS67.050

CCSX04

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GDFCAXXX—2023

保健食品中14種真菌毒素含量的高通量快

速測(cè)定超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

DeterminationofmycotoxinscontentinhealthfoodsbyLiquidchromatography

-tandemmassspectrometry

2023-XX-XX發(fā)布2024-XX-XX實(shí)施

廣東省食品流通協(xié)會(huì)??發(fā)布

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GDFCA

XXX—2023

保健食品中14種真菌毒素含量的高通量快速測(cè)定超高效液相色譜

-串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍

本文件描述了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行保健食品中14種真菌毒素含量的高通量快速測(cè)

定的方法。

本文件適用于口服液、片劑、膠囊、顆粒劑、糖果制品等劑型保健食品中黃曲霉毒素(AFTB1，AFTB2，

AFTG1，AFTG2)、伏馬毒素（FB1，F(xiàn)B2，F(xiàn)B3）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、

T-2毒素、雜色曲霉素（ST）、赭曲霉毒素A（OTA）、桔青霉素（CIT）和展青霉素（PAT）14種真菌毒

素含量的測(cè)定，保健食品原輔料及其他植物性食品可參照?qǐng)?zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

試樣中的真菌毒素，用2%甲酸乙腈溶液提取，提取液經(jīng)氯化鈉鹽析后用分散固相萃取凈化除雜，凈

化液經(jīng)氮吹濃縮、復(fù)溶、定容后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）測(cè)定，外標(biāo)法定量。

5試劑和材料

除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

5.1乙腈（C2H3N,CAS號(hào)：75-05-8）：色譜純。

5.2甲酸（CH2O2,CAS號(hào)：64-18-06）。

5.32%甲酸乙腈溶液：準(zhǔn)確吸取20mL甲酸（5.2），用乙腈（5.1）定容到1000mL。

5.4甲醇（CH4O,CAS號(hào)：67-56-1）。

5.5乙酸（C2H4O2,CAS號(hào)：77671-22-9）。

5.6甲醇乙酸水溶液：準(zhǔn)確吸取4mL,用純水定容到100mL。取其中90mL溶液，加入10mL甲醇（5.4），

混勻。

5.7乙酸銨（C2H7NO2,CAS號(hào)：631-61-8）。

5.8氯化鈉（NaCl,CAS號(hào)：7647-14-5）。

5.9無水硫酸鎂（MgSO4,CAS號(hào)：7487-88-9）。

5.10真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：14種真菌毒素的中文名稱、英文名稱、CAS號(hào)、分子式及相對(duì)分子量參見附

錄A的表A.1，均為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度≥95%。

5.11標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取適量（精確至0.1mg）真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈（5.1）溶解并定容至

10mL。儲(chǔ)備溶液避光-20℃儲(chǔ)存，有效期1年

3

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5.12混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取適量14種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈（5.1）溶解稀釋定容配制成嘔吐毒

素（DON）、展青霉素（PAT）、桔青霉素（CIT）濃度為5000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，伏馬毒素B1(FB1)、

伏馬毒素B2(FB2)、伏馬毒素B3(FB3)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉毒素A(OTA)、T-2毒素(T-2)、雜

色曲霉素(ST)濃度為500ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，黃曲霉毒素B1(AFTB1)、黃曲霉毒素B2(AFTB2)、黃曲霉

毒素G1(AFTG1)、黃曲霉毒素G2(AFTG2)濃度為50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃冰箱中避光保存。

6儀器和設(shè)備

6.1液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀：配有電噴霧離子源（ESI）。

6.2分析天平：感量0.001g和0.01mg。

6.3渦旋振蕩器。

6.4超聲儀。

6.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥14000r/min

6.6氮吹儀。

7試樣的制備

7.1固態(tài)試樣

將固體飲料、糖果制品、片劑研細(xì)，混勻，均分成50~100g兩份，分別裝入潔凈容器內(nèi)；膠囊連同

膠囊殼一起搗碎，混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

7.2液體試樣

將其充分?jǐn)嚢杈鶆颍殖?0~100g兩份，分別裝入潔凈容器，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于常溫儲(chǔ)存?zhèn)?/p>

用。

8測(cè)定步驟

8.1樣品預(yù)處理

8.1.1固態(tài)試樣或半固態(tài)試樣：稱取2g（精確到0.01g）樣品置于50mL離心管中，加入5mL水，

渦旋5min，再加入V110mL含2%甲酸乙腈溶液，渦旋3min后超聲提取30min；加入1g氯化鈉，渦旋3min，

于12000r/min條件下離心5min。吸取6mL上清液置于內(nèi)含200mgC18填料和1g無水硫酸鎂的10mL離

心管中，渦旋震蕩3min，于12000r/min下離心5min；移取V22.5mL上清液，于40℃氮?dú)獯蹈?，用V31mL

甲醇乙酸溶液（5.6）復(fù)溶，渦旋振蕩3min，于14000r/min條件下離心30min，上清液上機(jī)測(cè)定。

8.1.2液體試樣：稱取2g（精確到0.01g）樣品置于50mL離心管中，渦旋5min，再加入V110mL

含2%甲酸乙腈溶液，渦旋3min后超聲提取30min；加入1g氯化鈉，渦旋3min，于12000r/min條件下

離心5min。吸取6mL上清液置于內(nèi)含200mgC18填料和1g無水硫酸鎂的10mL離心管中，渦旋震蕩3min，

于12000r/min下離心5min；移取V22.5mL上清液，于40℃氮?dú)獯蹈?，用V31mL甲醇乙酸溶液（5.6）復(fù)

溶，渦旋振蕩3min，于14000r/min條件下離心30min，上清液上機(jī)測(cè)定。

8.2混合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取空白試樣，按上述方法處理制得其空白基質(zhì)溶液，準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用空白基質(zhì)溶液

稀釋成黃曲霉毒素（AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2）濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0ng/mL，伏

馬毒素（FB1、FB2、FB3）、雜色曲霉素（ST）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、T-2毒

素（T-2）濃度為1.0、2.5、5.0、10、25、50ng/mL，桔青霉素（CIT）、展青霉素（PAT）、嘔吐毒素

（DON）濃度為10、25、50、100、250、500ng/mL的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。供超高效

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以上述溶液中各真菌毒素的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8.3儀器參考條件

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8.3.1液相色譜參考條件如下（適用于展青霉素外的其他毒素）：

a)色譜柱：KinetexF5色譜柱（2.1×100mm，2.6μm），或性能相當(dāng)者。

b)流速：0.4mL/min。

c)柱溫：40℃。

d)進(jìn)樣量：5μL。

e)流動(dòng)相及梯度洗脫程序見表1。

表1梯度洗脫程序表

時(shí)間/minA:0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液/%B:甲醇/%

0955

6.08020

8.08020

15.01090

18.01090

18.1955

20.0955

8.3.2液相色譜參考條件如下（適用于展青霉素）：

a)色譜柱：UltraAQC18色譜柱（2.1×100mm3μm），或性能相當(dāng)者。

b)流速：0.3mL/min。

c)柱溫：40℃。

d)進(jìn)樣量：5μL。

e)運(yùn)行時(shí)間：10min。

f)流動(dòng)相及梯度洗脫程序見表2。

表2梯度洗脫程序表

時(shí)間/minA：水/%B：甲醇/%

0955

3.0955

6.0595

8.0595

8.1955

10.0955

8.3.3質(zhì)譜參考條件如下：

a)離子源：電噴霧離子源源（ESI﹢/-）；

b)掃描模式：正、負(fù)離子掃描；

c)監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；

d)離子源溫度：550℃；

e)碰撞氣：高純氮?dú)猓稍餁?、霧化氣、鞘氣等均為氮?dú)饣蚱渌线m氣體；

f)離子噴霧電壓：5500V；

g)霧化氣壓力：50psi；

h)氣簾氣壓力：40psi；

i)輔助加熱氣壓力：50psi；

j)碰撞氣壓力：中檔；

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k)質(zhì)譜優(yōu)化條件參數(shù)見表3。

表3真菌毒素的UPLC-MS-MS優(yōu)化參數(shù)

化合物母離子子離子去簇電壓/V碰撞能量/eV保留時(shí)間/min

黃曲霉毒素B1313.1(+H)285.0a/241.015031/4512.7

黃曲霉毒素B2315.1(+H)287.0a/259.015035/4012.5

黃曲霉毒素G1329.0(+H)243.0a/283.015037/3412.3

黃曲霉毒素G2331.0(+H)245.0a/285.015040/3712.0

伏馬毒素B1722.4(+H)334.3a/352.311059/5413.4

伏馬毒素B2706.4(+H)336.4a/354.311757/4914.2

伏馬毒素B3706.4(+H)336.2a/354.411554/4713.9

+a

T-2毒素489.2(+NH4)245.1/387.121036/2613.8

雜色曲霉素325.0(+H)281.0a/309.921050/3314.6

桔青霉素251.0(+H)233.0a/191.016021/3512.1

赭曲霉毒素A402.0(-H)358.1a/211.0-150-27/-3714.1

嘔吐毒素297.0(+H)203.0a/157.012018/273.07

展青霉素152.9(-H)108.9a/80.8-80-12/-213.45

玉米赤霉烯酮317.1(-H)175.0a/273.1-100-34/-2714.4

a為定量離子

8.4超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定

8.4.1定性測(cè)定

將基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，記錄基質(zhì)匹配混合標(biāo)

準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液中各化合物的保留時(shí)間，在相同條件下，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時(shí)

間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的某組分峰的保留時(shí)間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對(duì)子離子的質(zhì)

荷比一致，樣品溶液中的定性離子相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較時(shí)，

相對(duì)偏差不超過表4規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在相應(yīng)的被測(cè)物。

表4定性確定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

相對(duì)離子豐度＞50%＞20%~50%＞10%~20%≤10%

允許的相對(duì)偏差±20%±25%±30%±50%

8.4.2定量測(cè)定

在儀器最佳工作條件下，將基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀

中，擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量計(jì)算試樣溶液中各待測(cè)組分濃度。試樣溶液中各待測(cè)物的響應(yīng)值均

應(yīng)在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。14種真菌毒素典型色譜圖參見附錄B。

8.4.3空白試驗(yàn)

取空白試樣，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行測(cè)定。。

9結(jié)果計(jì)算和表述

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試樣中真菌毒素的含量按式（1）計(jì)算，計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值：

CVV

X13····················································(1)

V2m

式中：

?——試樣中待測(cè)組分含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

c——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或單點(diǎn)校準(zhǔn)得到的待測(cè)組分溶液濃度，單位為微克每升（μg/L）；

?1——試樣提取液體積，單位為毫升（mL）；

?2——用于凈化分取的樣品體積，單位為毫升（mL）；

?3——樣品經(jīng)精華洗脫后的最終定容體積，單位為毫升（mL）；

?——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）或吸取試樣的體積，單位為毫升（mL）。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

10靈敏度和準(zhǔn)確度、精密度

10.1靈敏度

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的檢出限為0.2μg/kg，伏馬毒素B1、

伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、T-2毒素、雜色曲霉素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的檢出限為2μg/kg，

展青霉素、桔青霉素、嘔吐毒素檢出限為20μg/kg。

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的定量限為0.5μg/kg，伏馬毒素B1、

伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、T-2毒素、雜色曲霉素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的定量限為5μg/kg，

展青霉素、桔青霉素、嘔吐毒素的定量限為50μg/kg。

10.2準(zhǔn)確度

本方法中固體基質(zhì)和液體基質(zhì)的加標(biāo)回收率要求70%~120%。

10.3精密度

本方法在重復(fù)性下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過20%。

A

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附錄A

（資料性）

14種真菌毒素的中文名稱及英文名稱、CAS號(hào)、分子式及相對(duì)分子量

14種真菌毒素的中文名稱及英文名稱、CAS號(hào)、分子式及相對(duì)分子量，見表A.1。

表A.114種真菌毒素中文名稱及英文名稱、CAS號(hào)、分子式及相對(duì)分子量

序號(hào)中文名稱英文名稱CAS號(hào)分子式相對(duì)分子量

1黃曲霉毒素B1AflatoxinB11162-65-8C17H12O6312.27

2黃曲霉毒素B2AflatoxinB27220-81-7C17H14O6314.29

3黃曲霉毒素G1AflatoxinG11165-39-5C17H12O7328.27

4黃曲霉毒素G2AflatoxinG27241-98-7C17H14O7330.29

5伏馬毒素B1FumonisinB1116355-83-0C34H59NO15721.83

6伏馬毒素B2FumonisinB2116355-84-1C34H59NO14705.83

1422359-85-

7伏馬毒素B3FumonisinB3C34H59NO14705.83

0

8T-2毒素T-2toxin21259-20-1C24H34O9466.53

Sterigmatocyst

9雜色曲霉素10048-13-2C18H12O6324.28

in

10赭曲霉毒素AOchratoxinA303-47-9C20H18ClNO6403.813

11玉米赤霉烯酮Zearalenone17924-92-4C18H22O5318.36

12展青霉素Patulin