DB21T 2589-2016 東部白松種源相關(guān)序列多態(tài)性(SRAP)分子鑒定實驗方法　　

DB21DB21/T2589—2016東部白松種源相關(guān)序列多態(tài)性（SRAP）分子鑒定實驗方法TechnicalregulationsofmolecularidentificationmethodfordifferentprovenancesofPinusstrobuswithSRAP遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 1 2 2 2 5 6 7 9 本標準依據(jù)GB/T1.1-2009的本標準的附錄A、附錄B、附錄C和附錄D為規(guī)范性附錄，附錄E為資1本標準適用于利用相關(guān)序列多態(tài)性（SRAP）法對東部白松種源件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用3.1相關(guān)序列多態(tài)性sequence-relatedamplifiedpolymorph利用一對引物對開放閱讀框（openreadingframes，ORFs）進行擴增，因個體不同以及物種的內(nèi)在耐熱DNA聚合酶作用下，于體外快速大量特異擴增待定DNA一對引物在兩個或兩個以上不同材料基因組DNA之間擴增，得到數(shù)目不同或2選用東部白松新鮮針葉為材料提取基因組DNA。選取適量樣品，裝入凍存管，液氮速凍，置于超低），3凝膠上電泳，穩(wěn)壓90V，電泳緩沖液為1×TBE，325nm紫外燈下觀察，），），4認邊條與兩玻璃板均對齊后，將其放入封膠框中并用夾子固定在配制1%的瓊脂糖凝膠，徹底煮沸后用膠頭滴管吸取，沿底邊從左至右緩緩灌注入封膠框中，避免在50mL8%非變性聚丙烯酰胺儲備液中加入100μL10%將固定有封好玻璃板的制膠板向后傾斜放置，配好的8%非變性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁緩慢5將膠小心取出，用雙蒸水沖洗一次后迅速放入10%冰乙酸中，水平搖床輕搖3min～5min，放凈固選取電泳圖上清晰、易于辨認的多態(tài)性條帶進行記錄和統(tǒng)計，根據(jù)DNA分子量標準（將待測種源的電泳結(jié)果與原種源的標準譜帶相比較，從而鑒定出該種源的6me1me2me3me4me5me6me7me8me9me107B.10.5mol/LEDTA-二鈉（pH8.0）8.0，用超純水定容至100mL，高壓滅將24.22g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于160mL水中，用濃鹽酸（HCl）調(diào)劑pH至8.0，用超純將58.44g氯化鈉（NaCl）溶于160mL水中，定容至200mL，高壓滅菌，4CTAB-free緩沖液的成分為250mmol/LNaCl、200mmol/LTris-HClEDTA（0.5mol/LpH8.0）。在6（pH8.0）、100mL50mmol/LEDTA（pH8.0），定容至1004×CTAB提取緩沖液的成分為4%（質(zhì)量濃度）溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、10（1mol/LpH8.0）、20mmol/LEDTA（0.5mol/LpH8.0）和1.4mol/LNaCl（5mol/L）。在500mLEDTA（pH8.0）和280mL5mol/LNaCl，定容至1000mL，高壓滅菌，4），溶液透明（確保所有瓊脂糖顆粒均完全熔化），冷卻至50℃~60℃,加入EB（1mg/mL）溶液使其終濃度為0.5μg/mL，混勻后倒入放完全凝固后放入電泳槽中，然后向槽內(nèi)加入1×TBE稀釋緩沖液至液面剛好沒過8B.106×DNA上樣緩沖液電泳(DN6×DNALordingBuffer，其中含0.05%（質(zhì)量分數(shù)）溴酚藍、0.05%（質(zhì)量分數(shù)）二甲苯青、30的比例，混合DNA樣品和DNA上樣緩沖液，直接加到點樣孔即可。9表C.210%過硫酸銨（ammoniump過硫酸銨（ammoniumpersu表C.310倍三羥甲基氨基甲烷-硼酸-冰乙酸（glacialaceticDB21/T