DB21T 2396-2015 水稻品種抗稻瘟病基因檢測 PCR法　

ICS65.020.01DB21DB21/T2396—2015水稻品種抗稻瘟病基因檢測PCR法遼寧省質量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2396—2015本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院提出。本標準由遼寧省農(nóng)村經(jīng)濟委員會歸口。本標準由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新中心負責起草。本標準主要起草人：陸曉春、鄭文靜、叢玲、趙家銘、王妍、張麗霞、白春明、王春語、朱振興、馬麗、李丹、王平、李金紅等。本標準由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新中心負責解釋。1DB21/T2396—2015本標準規(guī)定了檢測水稻品種抗稻瘟病基因的PCR檢測法，包括原理、儀器設備、試劑和材料、防污染措施、實驗步驟及結果分析。本標準適用于水稻品種中抗稻瘟病基因pita、pid2、pid3、pik、pikp、pikm、piks、pi21、pi36、pi372規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T19495.2轉基因產(chǎn)品檢測實驗室技術要求農(nóng)業(yè)部1485號公告--4—2010轉基因植物及其產(chǎn)品成分檢測DNA提取和純化3術語及縮略語下列術語及縮略語適用于本標準3.1正向引物：處于DNA雙鏈上游的引物，簡稱F引物。3.2反向引物：處于DNA雙鏈下游的引物，簡稱R引物。3.3內參引物：在聚合作用起始時，可以刺激合成另一種大分子，并與反應物以共價鍵形式連接的序3.4DNA:Deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸。3.5PrimeSTARHSDNAPolymerase:高保真DNA聚合酶。3.6PrimeSTARBuffer（5×):5×PCR反應液。3.7dNTPMixture（10mM）:單核苷酸混合液（10mM）。3.8PCR:Polymerasechainreaction。3.9TAE：Tris-Cl、冰醋酸、EDTA緩沖液。2DB21/T2396—20153.10Goldenview：核酸染料，替代溴化乙錠。3.11DNAMarker：標準分子量的核酸標記。3.12bp:Basepair,堿基對。3.13Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羥甲基氨基甲烷。4原理根據(jù)水稻抗病基因保守區(qū)序列設計特異性引物，提取不同水稻品種的DNA，對試樣進行PCR擴增，依據(jù)是否擴增獲得預期大小的DNA片段及特定的序列來判斷樣品是否攜帶該抗病基因。5儀器設備5.1臺式離心機。5.2PCR儀。5.3凝膠成像系統(tǒng)。5.4瓊脂糖電泳槽及電泳儀等電泳裝置。5.5恒溫水浴鍋。5.6分析天平：感量0.1g、0.01g和0.1mg。5.7具蓋塑料離心管：2mL，0.2mL。5.8研缽、研杵。5.9移液槍和吸頭：1000μL,200μL,10μL。5.10其它相關儀器設備6試劑和材料6.1供試水稻葉片或種子。6.2DNA提取試劑盒。6.3PrimeSTARHSDNAPolymerase。6.4PrimeSTARBuffer（5×)。6.5dNTPMixture（10mM）。6.6DNAMarker：可以清楚地區(qū)分100bp～1000bp的DNA片段。6.750×TAE緩沖液，使用時稀釋50倍。3DB21/T2396—20156.8加樣緩沖液。6.9引物見附錄A。除非另有說明，僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合GB/T6682規(guī)定的一級水。7防污染措施檢測過程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。8實驗步驟8.1水稻DNA提取按農(nóng)業(yè)部1485號公告--4—2010的規(guī)定執(zhí)行。8.2PCR反應8.2.1將試樣DNA、PrimeSTARBuffer（5×)、dNTPMixture、正向引物及反向引物及ddH2O置于冰上融化。8.2.2在0.2mL加蓋無菌離心管中，按先后順序加入：PrimeSTARBuffer（5×)6μLdNTPMixture(2.5mM)2.4μL正向引物及反向引物(100nM)0.2μL(終濃度:0.2μM~0.3μM)，試樣DNA1μL（20～100ng）ddH2O20.1μLPrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.3μL用移液槍抽打混勻，蓋上蓋子短暫離心，置于冰上待用。8.2.3將離心管置于PCR儀中，反應程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s，55℃~61℃退火30s72℃延伸30s～60s（每對引物的退火溫度及延伸時間參見附錄A29個循環(huán)，72℃總延伸5min，4℃保存。8.3PCR產(chǎn)物電泳8.3.1用200mL玻璃燒杯稱取瓊脂糖0.5g，加入1×TAE緩沖液50mL。8.3.2杯口用錫箔紙蓋好，置微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。8.3.3瓊脂糖冷卻至50℃左右時加入2.5μLGoldenview，混勻，迅速將膠倒至模具中，放置上樣梳。8.3.4待膠完全凝固后，拔下上樣梳，置于盛有1×TAE緩沖液的電泳槽中。8.3.5吸取5μLPCR反應液，與1μL加樣緩沖液混勻，上樣，130v電泳0.5h～1.0h。8.3.6電泳結束后，取下瓊脂糖膠，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶大小，并照相。8.4PCR產(chǎn)物測序4DB21/T2396—2015將25μL的PCR產(chǎn)物提交至DNA測序技術機構，測序。9結果分析9.1判定原則9.1.1模板質量的檢測所有參試品種的DNA，需用水稻內參引物（Primer9）檢測，以確定DNA模板的濃度及純度適宜,如用水稻內參引物（Primer9）擴增時無特異性PCR產(chǎn)物，則需重新提取試樣DNA。9.1.2結果判定原則鑒定水稻品種中是否攜帶抗稻瘟病基因時，如不能擴增出特定長度的PCR產(chǎn)物，則可判斷試樣中不含有相應的抗病基因；如可擴增出特定長度的PCR產(chǎn)物，則需結合電泳結果和測序結果共同分析。9.2Pita9.2.1電泳結果分析用附錄A中Primer1擴增，如該品種攜帶Pita抗病基因，則其PCR產(chǎn)物應為467bp，電泳圖中其產(chǎn)物片段應處于DNAMarker的400bp～500bp間；反之，如無PCR產(chǎn)物或PCR片段長度與467bp差距較大則認為參試品種不攜帶Pita抗病基因。9.2.2測序結果分析PCR產(chǎn)物的序列與附錄B所示序列seq-1分析在431bp～433bp處，如堿基序列為GCT則該品種所含抗病基因則為Pita的抗病等位基因；反之，如該品種在431bp～433bp處測得的序列為TCT或其它序列，則認為參試品種含有Pita的感病等位基因。9.3Pid29.3.1電泳結果分析用附錄A中Primer2擴增，如該品種攜帶Pid2抗病基因，則其PCR產(chǎn)物應為496bp，電泳圖中其產(chǎn)物片段應處于DNAMarker500bp左右；反之，如無PCR產(chǎn)物或產(chǎn)物片段長度與496bp差距較大則認為參試品種不攜帶Pid2抗病基因。9.3.2測序結果分析PCR產(chǎn)物的序列與附錄B所示序列seq-2分析在263bp～265bp處，如堿基序列為ATA則該品種所含抗病基因則為Pid2的抗病等位基因；反之，如為ATG或其它序列，則認為參試品種含有Pid2的感病等位基因。9.4Pid39.4.1電泳結果分析用附錄A中Primer3擴增，如該品種攜帶Pid3抗病基因，則其PCR產(chǎn)物應為550bp，電泳圖中其產(chǎn)物片段應處于DNAMarker500bp～600bp間；反之，如無PCR產(chǎn)物或產(chǎn)物片段長度與550bp差距較大則認為參試品種不攜帶Pid3抗病基因。5DB21/T2396—20159.4.2測序結果分析PCR產(chǎn)物的序列與附錄B所示序列seq-3分析在232bp～234bp處，如堿基序列為CAG則該品種所含抗病基因為Pid3的抗病等位基因；反之，如為TAG或其它序列，則認為參試品種含有Pid3的感病等位基因。9.5Pik/Pikp/Pikm/Piks9.5.1電泳結果分析用Primer4擴增，如該品種攜帶Pik/Pikp/Pikm/Piks抗病基因，則其PCR產(chǎn)物應為992bp，電泳圖中其產(chǎn)物片段應處于DNAMarker1000bp左右；反之，如無PCR產(chǎn)物或產(chǎn)物片段長度與1000bp差距較大則認為參試品種不攜帶Pik/Pikp/Pikm/Piks抗病基因。9.5.2測序結果分析PCR產(chǎn)物的序列與附錄B所示序列seq-4比對，如在685bp～687bp處堿基序列為GAG且在754bp～756bp處為CCT，則該品種所含抗病基因為則為Piks的抗病等位基因；如在685bp～687bp處堿基序列為CAG且在754bp～756bp處為CCT，則該品種所含抗病基因為Pikm的抗病等位基因；如在685bp～bp687處堿基序列為AAG且在754bp～756bp處為CAT，則該品種所含抗病基因為Pik的抗病等位基因；如在685bp～687bp處堿基序列為AAG且在754bp～756bp處為GAT，則該品種所含抗病基因為Pikp的抗病等位基因；反之，待檢品種在上述區(qū)域序列與幾種等位基因均不符，則認為參試品種不含有Pik及其它幾個抗病等位基因。9.6Pi219.6.1電泳結果分析用Primer5擴增，如該品種攜帶Pi21抗病基因，則其PCR產(chǎn)物應為633bp，反之，如無PCR產(chǎn)物或產(chǎn)物片段長度與633bp差距較大則認為參試品種不攜帶Pi21抗病基因。9.6.2測序結果分析PCR產(chǎn)物的序列與附錄B所示序列seq-5比對，如在138后及在321后分別有ctgccgcagccgccgccgccg21個及tgcaagccggaggagccgccgaagccgccgccggagaagccgccgccg及48個堿基的缺失（即去除前后引物結合的位置，參試品種序列應與seq-5所示序列一致則該品種所含抗病基因為Pi21的抗病等位基因；反之，若待檢品種不存在上述特定序列的缺失，則認為參試品種不含有Pi21抗病基9.7Pi369.7.1電泳結果分析用Primer6擴增，如該品種攜帶Pi36抗病基因，則其PCR產(chǎn)物應為452bp，電泳圖中其產(chǎn)物片段應處于DNAMarker400bp～500bp間；反之，如無PCR產(chǎn)物或產(chǎn)物片段長度與452bp差距較大則認為參試品種不攜帶Pi36抗病基因。9.7.2測序結果分析PCR產(chǎn)物的序列與附錄B所示序列seq-6分析在271bp～273bp處，如堿基序列為AGT則該品種所含抗病基因則為Pi36的抗病等位基因；反之，如為AAT或其它序列，則認為參試品種含有Pi36的6DB21/T2396—2015感病等位基因。9.8Pi379.8.1電泳結果分析用Primer7擴增，如該品種攜帶Pi37抗病基因，則其PCR產(chǎn)物應為600bp，電泳圖中其產(chǎn)物片段應處于DNAMarker600bp附近；反之，如無PCR產(chǎn)物或產(chǎn)物片段長度與600bp差距較大則認為參試品種不攜帶Pi37抗病基因。9.8.2測序結果分析PCR產(chǎn)物的序列與附錄B所示序列seq-7比對，如在295bp～297bp處堿基序列為GTA，且在319bp～321bp處堿基序列為ATG，則該品種所含抗病基因則為Pi37的抗病等位基因；如在295bp～297bp處堿基序列為GCA或其它序列，以及在319bp～321bp處堿基序列為ATC、ATA或ATT或其它序列，則認為參試品種含有Pi37的感病等位基因。9.9Pi5用Primer8擴增，如該品種攜帶Pi5抗病基因，則其PCR產(chǎn)物應為1105bp；反之，如無PCR產(chǎn)物或產(chǎn)物片段長度與1105bp差距較大則認為參試品種不攜帶Pi5抗病基因。7DB21/T2396—2015（規(guī)范性附錄）用于擴增抗稻瘟病基因的引物抗病基因退火溫度(℃)延伸時間PitaPrimer1FACTTCATGTTTGTCTGTACAGCA30RTCAAACAATCATCAAGTCAGPid2Primer2FGATATGTAGGCACTAACTTCTTC30RCCAAGATACACAGATCCAAACCPid3Primer3FCATGACAACCCTTCAGACAT30RACAGAGCAGGAACTTCAGATPik/Pikp/Pikm/PiksPrimer4FGCAGAGTTCATCAGATCCGAGCT60RGCTGATATGTTGTCGATGAGATGPi21Primer5FAAGGTGGAGTACGACGTGAA60RTCACATGATGGAGCAGGCGTTPi36Primer6FGTTCATGATATGGTGCTCGATC30RTCCGGCAGCTCTTCTATTGTACPi37Primer7FAATGAACTGAAGACCATGCTGGA40RTGGAAGTACATCTCGTCTAGAAGPi5Primer8FCCAAGTGCAACTAGAGGTATGGT70RGTGCATCATCTTCAGATATCAGG水稻內參引物Primer9FTCAGCAACTGGGATGATATGGAG30RGCCGTTGTGGTGAATGAGTAAC8DB21/T2396—2015（規(guī)范性附錄）擴增子序列抗病基因序列編號抗稻瘟病基因擴增DNA片段PitaSeq1ACTTCATGTTTGTCTGTACAGCACCATGCATGACTTTTGTGGAAGGAGCAATGCCGAGTGTGCAAAGGTTAAATCTAAGGTTCAATGCCAACGAGTTCAAGCAGTATGACTCTAAGGAGACAGGGTTGGAACACTTGGTCGCCCTTGCAGAGATCTCTGCAAGAATTGGGGGCACTGATGATGATGAATCAAACAAAACTGAAGTGGAGTCTGCCTTGAGGACTGCAATTCGCAAGCATCCGACGCCGAGCACTCTTATGGTTGATATACAATGGGTGGATTGGATCTTTGGTGCTGAAGGGAGAGACTTGGATGAAGATTTGGCACAACAAGATGATCACGGGTATGGATTTTTCATTCTATTCCCAGGTTACAACTTACAAGGATTATTGAGCTTCTTTCTTTCTCTGCCGTGGCTTCTATCTTTACCTGCTATGCATCTTCAACCTGACTTGATGATTGTTTGAPid2Seq2GATATGTAGGCACTAACTTCTTCCCTCCTGCGGCTAAGACGAACCTTACGGGTTGTAAGAGTGCCTGTACAGGCAACTGCTCTTGTGTTGCTGTGTTCTTTGATCAATCTTCAGGCAATTGTTTCCTTTTCAACCAGATCGGAAGCTTGCAGCACAAAGGTGGGAATACAACTCGTTTCGCATCTTTTATCAAGGTATCAAGCAGAGGAAAAGGTGGGAGTGATAGTGGCAGTGGGAAGCACAATACCATTATTATTGTCATTATACTCGGAACTTTGGCTATCATAGGCGTCCTTATTTATATTGGTTTCTGGATCTACAAGAGGAAGAGGCATCCTCCACCATCACAAGACGACGCTGGTTCATCGGAAGATGATGGATTTCTGCAAACAATATCCGGAGCACCAGTGCGGTTCACTTACAGGGAGCTCCAGGATGCGACAAGCAACTTCTGTAACAAGCTTGGTCAGGGAGGGTTTGGATCTGTGTATCTTGGPid3Seq3CATGACAACCCTTCAGACATTACTACTCATGGAAGCTAGTTCTCAAATGGTTCATCACCTAGGCTCTCTTGTGGAGTTAAGAACCTTTCGTATCAGCAAGGTGCGAAGTTGCCATTGTGAGCAGTTGTTCATGGCCATCACTAATATGATTCATCTTACCCGTCTTGGGATCCAGGCAGACAGTAGTCAAGAAGTGCTGCATCTTGAATCACTTAAACCTCCTCCTCTACTTCAGAAACTTTTCTTGCAAGGTACATTATCTCATGAATCATTACCTCATTTCGTGTCTGTAAGCAATCTGAATAACCTCACGTTTCTACGTCTTGCTGGGTCAAGAATTGACGAAAATGCATTCCTTAATCTTGAGGGATTACAGCAGTTGGTAAAGCTACAGCTTTATGATGCATATGATGGAATGAATATATACTTCCATGAGAACTCATTTCCAAAGCTCAGAATACTGAAAATATGGGGTGCCCCACACCTGAATGAAATTAAGATGACAAAAGGAGCTGTGGCAAGCCTAACAGATCTGAAGTTCCTGCTCTGTPik/Pikp/Pikm/PiksSeq4GCAGAGTTCATCAGATCCGAGCTGGAGGCCGTGCACTCTCTCCTCACCCCAAATATCTTGGGGAGGATGGGGGATGACGATGCGGCGTGCAAGGATGGCTTGATTGCGGAGGTCCGGGAGCTGTCCTACGACCTGGATGATGCCGTCGACGACTTCTTGGAGCTCAATTTCGAGCAGCGAAGAAGCGCAAGCCCTTTCGGTGAGCTCAAGGCAAGAGTTGAGGAGCGTGTCTCCAATCGCTTCTCTGACTGGAAGCTACCGGCGGCGAGCCTTCCGCCGTCGTCGGTACACCGTCGAGCTGGCTTGCCGCCACCAGATGCAGGGCTGGTGGGGATGCACAAACGTAAGGA9DB21/T2396—2015AGAGCTCATCGAGTTGCTGGAACAAGGGAGCAGTGATGCTTCACGATGGCGCAAGCGAAAACCTCATGTCCCCCTCAGGATAATGGGAGGGGAAATGCAAAAAATCGTGTTCAAGATTCCCATGGTGGACGATAAGAGCCGTACAAAAGCAATGTCATTGGTTGCAAGTACGGTTGGAGTGCACTCGGTTGCAATCGCCGGTGACCTAAGAGACCAGGTTGTGGTGGTCGGTGATGGCATTGACTCCATCAATCTGGTCTCTGCGCTCCGGAAGAAGGTGGGCCCTGCGATGTTTCTGGAGGTCAGCCAAGTAAAGGAAGATGTGAAGGAGATAACGGCGATGCTTGCGCCGGTGAAATCCATATGTGAATTTCACGAGGTCAAAACAATTTGCATCCTTGGATTGCCAGGGGGAGGCAAAACAACGATTGCCCGAGTACTATATCATGCATTGGGAACGCAGTTCCAATGCCGGGTTTTCGCATCAATCTCTCCAAGTTCCAGCCCCAGTCCCAATCTAACAGAGACTCTTGCAGACATTTTCGCTCAAGCACAACTAGGAGTAACTGATACACTTAGCACACCATATGGTGGGAGTGGGACCGGGAGAGCTCTTCAACAACATCTCATCGACAACATATCAGCPi21Seq5AAGGTGGAGTACGACGTGAAGAACAACAGGGTGATCGTGCGCGGGAAGTTCGACCCGGAGAAGCTGTGCAAGAAGATCTGGTGCAAGGCCGGCAAGATCATCAAGGAGATCCTCATCGTCGACGTCTGGCCGCCGCCGTGCAAGCCGCCGCCGTGCGAGAAGCCTCCGGAGGACTGCAAGCCCAAGCCCTGCCATTGCTGCAGCTGCGAGAAGCCCAAGCCCAAGCCCAAGCCCTGCCACTGCGAGAAGCCCAAGCCCTGTCACTGCGAGAAGCCCAAGCCATGCGAGAAGCCGCCGCCGAAGCCGGAGTGCAAGCTGGTGCCGTACCCTTACCCGGTGCCGTACCCGTACGCCGGGCAGTGGTGCTGCCCAAAGCCTGAGCCGCCGAAGCCGCCGCCGGAGCCACCGAAGGAGCCGGAGCCGCCGAAGCCGTGCGGGTGCTCGCACGCCTTCGTGTGCGTCTGCAAGCCGGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGTGCGGGTGCTCGGGGGGCCACGGGAACTGCGGCTGCGGCATCAGGCCGTGGCCGCCGCAGGTGTGGCCGCCGCCGCCCGTCTGCCCGCCGCCGCCGTGGTGCTACACCGAGGACAACGCCAACGCCTGCTCCATCATGTGAPi36Seq6GTTCATGATATGGTGCTCGATCTAGCTCGTTCATTGACAAGTGAACAAAACTTTGTCACCGTATTGGATAACGATGAGCAACGGAAACCTGAAAGCACCAATGCTCGTAGGTTGGCCCTGCACCGTACGAGTATCACGAGCTATCGATTTGTTAATATGGATATGAAGAAAGTGAGGTCATTTGTTGCCACTGAGTGCAATAATGGCAATAATAGTGTGGCACCACCAAGGTTCCAAGTTTTACGTGTGTTGTCCTTGGACAAATGTAGTGGTATGGAGGATTATTACATAGAAAGTATCTTGCAGTATGCTGGAAGGCTGGGTCACCTGAGGTGCCTCCAGCTTTCCTCACACACAGAGTTTCATAGGCTCCCTAAAGAATTAGGAGATCTCAAGTTTCTAAAAATACTGGACTTGGGTGATTGTGGCGGTACAATAGAAGAGCTGCCGGAPi37Seq7AATGAACTGAAGACCATGCTGGAGAAAGCCAAGGAGTTCCGTGAGCTGATTCACTTACCTGCTGGTAATAGTCTTGAGGGTCCCAGTGTACCAACAATTGTTGTTCCTGTAGTGACATCGCTATTGCCGCCAAGAGTATTTGGTCGCAACATGGATCGCGATCGCATAATACATCTTCTTACTAAGCCAATGGCTACTGTTTCTAGCTCAGTCGGCTACTCTGGTTTGGCCATTGTTGCACATGGAGGAGCAGGAAAATCCACCTTAGCACAATGTGTTTACAATGACAAGAGGGCACAAGAACATTTTGACGTCAGGATGTGGGTCTGCATCTCACGCAAACTTGATGTTCATCGCCATACACGTGAGATTATCGAGTCAGCAACAAATGGAGAGTGCCCTCGTGTGGACAATCTTGATACTCTCCAGTGCAGATTGAAGGACATAATGCAAAAATCAGAGAAATTCCTGCTTGTGTTGGATGACGTCTGGTTTGATGAATCCGTCAATGAGAGGGAATGGGACCAGTTGCTTGATCCTCTTGTTTCTCAGCAGGAGGGGAGCAGAGTTTTGGTGACTTCTAGACGAGATGTACTTCCADB21/T2396—2015Pi5Seq8CCAAGTGCAACTAGAGGTATGGTAC