第十四章生殖工程-試管嬰兒

第十章生殖(shēngzhí)工程—試管嬰兒人工授精(réngōngshòujīng)、試管嬰兒、克隆技術(shù)共六十二頁

生殖工程發(fā)展簡史200年前，JohnHunter用注射器將一位尿道下裂的丈夫的精液(jīngyè)注入妻子的陰道內(nèi)懷孕。1953年，第一例冷凍精子人工授精成功，但人工授精技術(shù)一直到70年代才廣泛應(yīng)用于臨床1983年，我國首個利用冷凍精子人工授精嬰兒出生。1984年，美國WilliamPancoast首例報道供精人工受孕.1978年，世界第一例試管嬰兒LouisBrown在英國劍橋大學(xué)誕生，開創(chuàng)體外授精治療不孕新的里程碑。1988年，我國第一例試管嬰兒出生共六十二頁第一節(jié)人工受精人工受精：收集丈夫或自愿獻精者的精液，由醫(yī)師注入女性生殖道以達到受孕目的的一種技術(shù)。解決男性不育的主要方法(fāngfǎ)必須具備的三個條件：足夠數(shù)量和活力的精子正常的排卵至少一條輸卵管通暢和功能正常共六十二頁一、分類依據(jù)精液來源分為：夫精人工授精（AIH）：使用(shǐyòng)丈夫精子供精人工授精（AID）：自愿獻精者的精子依據(jù)操作方法：子宮人工授精：宮腔內(nèi)授精、宮頸內(nèi)授精、陰道內(nèi)授精輸卵管內(nèi)精液灌注：是人工授精的一種新方法共六十二頁二、接受人工授精婦女的條件有規(guī)則的月經(jīng)周期有正常排卵輸卵管必須通暢生殖器官無嚴重(yánzhòng)疾患三、AID供精者的選擇挑選體力和智力俱佳的已婚青壯年男性仔細檢查精液質(zhì)量，排除一切遺傳病和性傳播性疾病供方與受方不相識兼顧供者血型、身高、膚色及頭發(fā)顏色是否與患者丈夫一致共六十二頁五、人工授精治療程序（一）精液的采集和處理逆行射精者：采精前每4小時服碳酸氫鈉1克，使尿液pH值達到7.2~7.7，排空尿液，沖洗膀胱(pángguāng)，誘導(dǎo)排精，取膀胱內(nèi)容物，離心濃縮至1ml立即進行人工授精精液量及精子少的患者：多采集幾次濃縮后進行人工授精精液不液化：授精前加糜蛋白酶或胰蛋白酶使之液化精子活力差：加入咖啡因，終濃度為7.2mmol/L,提高精子活力，提高精子受精能力。共六十二頁（二）人工授精的方法1、子宮人工授精①宮腔內(nèi)授精：處理過的精子直接送入宮腔②宮頸內(nèi)授精：將精液注入宮頸內(nèi)③陰道內(nèi)授精：將精液注入子宮頸周圍將宮頸蓋上宮頸杯，將精液注入杯中，杯留放24小時2、輸卵管內(nèi)精液灌注原理：封閉子宮頸口后，向?qū)m腔內(nèi)注入4ml處理過精子懸液，利用子宮腔壓力(yālì)，使輸卵管內(nèi)口張開，精液進入輸卵管。共六十二頁第二節(jié)：試管嬰兒的培育方法第一代試管嬰兒：體外受精-胚胎移植術(shù)

1978英國1988中國

第二代試管嬰兒：單精子卵細胞漿內(nèi)顯微注射授精技術(shù)1992比利時1996中國第三代試管嬰兒：胚胎種植(zhòngzhí)前的遺傳學(xué)診斷

19901999中國第四代試管嬰兒：核移植技術(shù)1997英國2002年中國共六十二頁一、第一代試管嬰兒技術(shù)即常規(guī)的體外授精-胚胎移植(IVF-ET)

主要解決女性因素的不育。主要應(yīng)用于：①雙側(cè)輸卵管缺如或完全阻塞，估計治療效果差或經(jīng)治療無效者；②行宮腔內(nèi)人工授精3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④需要贈卵，并有受孕的其它基本條件者。此項技術(shù)于1976年創(chuàng)立于英國，世界和中國的第一例試管嬰兒分別于1978年和1988年誕生。共六十二頁二、第二代試管嬰兒技術(shù)即單精子卵細胞漿內(nèi)顯微注射授精技術(shù)(ISCI)。依靠顯微注射系統(tǒng)，選擇吸取單個活精子，直接注入卵母細胞內(nèi)進行人工授精，主要解決男性因素的不育。主要應(yīng)用于：①嚴重的男性因素不育(嚴重少精癥、弱畸精癥、阻塞性無精癥、精子成熟障礙)；②常規(guī)的體外授精周期中，卵子不受精或受精率低下，可用該技術(shù)作為補救手段。此項技術(shù)于1992年創(chuàng)立于比利時，世界和中國的第一例第二代試管嬰兒分別于1992年和1996年誕生。它對家畜的育種和珍稀動物的拯救也具有重要的應(yīng)用價值。共六十二頁三、第三代試管嬰兒技術(shù)

即胚胎移植前的遺傳學(xué)診斷技術(shù)(PGD)顯微注射技術(shù)雖然提高了試管嬰兒技術(shù)的成功率，但也加大了胎兒畸形的風(fēng)險。在前兩代技術(shù)的基礎(chǔ)上，對植入前的胚胎進行篩選，選擇健康、正常、無遺傳性疾病(優(yōu)生)的胚胎植入子宮內(nèi)。這一技術(shù)和顯微注射技術(shù)的聯(lián)合運用，被稱為第三代試管嬰兒技術(shù)。主要適應(yīng)用于：遺傳性疾病、遺傳高危夫婦。世界和中國的第一例第三代試管嬰兒分別于1990和1999年誕生。共六十二頁四、第四代試管嬰兒技術(shù)，

即核移植技術(shù)

通俗地講，就是克隆人。但存在兩個問題：操作時帶入外源DNA、受體細胞線粒體遺傳。另外，需要指出的是隆人已經(jīng)不是傳統(tǒng)意義上的試管嬰兒，它只是男方或女方某一方的復(fù)制品，而不是精子和卵子結(jié)合的產(chǎn)物。隨著國外克隆羊(多利)的誕生，2002年2月中國誕生了克隆?！，F(xiàn)在，克隆人已經(jīng)不存在技術(shù)問題，存在的只是倫理道德問題。美國科學(xué)家于2001年10月首次成功克隆出早期人類胚胎，立即招來了許多抨擊。目前，國際社會正準備討論通過一項“關(guān)于禁止克隆人的國際公約”，公約將規(guī)定除非由于醫(yī)治某種疾病(不孕癥除外)，否則不能進行克隆人研究共六十二頁一、常規(guī)試管嬰兒培養(yǎng)技術(shù)——第一代試管嬰兒體外授精-胚胎移植術(shù)：體外讓卵子與精子(jīngzǐ)結(jié)合形成受精卵，在體外繼續(xù)培養(yǎng)8細胞左右，再將胚胎重新移植到母親子宮中，繼續(xù)發(fā)育生長直至足月分娩。主要解決女性因素的不育。適應(yīng)癥：①雙側(cè)輸卵管缺如或完全阻塞，估計治療效果差或經(jīng)治療無效者；②行宮腔內(nèi)人工授精3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④需要贈卵，并有受孕的其它基本條件者。

共六十二頁一、常規(guī)試管嬰兒培養(yǎng)技術(shù)——第一代試管嬰兒體外授精-胚胎移植術(shù)：體外讓卵子與精子結(jié)合形成受精卵，在體外繼續(xù)培養(yǎng)8細胞左右，再將胚胎重新移植到母親子宮中，繼續(xù)發(fā)育生長直至足月分娩。主要解決女性因素的不育。（一）主要適應(yīng)癥和禁忌癥：適應(yīng)癥：①輸卵管病變所致不孕：雙側(cè)輸卵管缺如或完全阻塞；②行宮腔內(nèi)人工授精(réngōngshòujīng)3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④子宮內(nèi)膜異位癥不孕；

共六十二頁適應(yīng)癥：⑤無排卵或黃素化卵泡未破裂(pòl(fā)iè)綜合征；⑥子宮頸病變，阻礙精子進入；⑦一方生殖細胞缺如；⑧子宮發(fā)育異?；蛉比纾?/p>

⑨選擇性生育。禁忌癥：①年齡：40歲以上不適于IVF；②過度肥胖者；③高催乳素血癥造成的不孕；④嚴重的盆腔粘連者。

共六十二頁（二）卵子的收集1、獲得可受精卵的方法①自然周期法：②藥物誘發(fā)超數(shù)排卵法：③誘發(fā)排卵常用藥物及其作用機制克羅米酚、人絕經(jīng)期促性腺激素（hMG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）、FSH2、采卵的方法①腹腔鏡手術(shù)(shǒushù)取卵②超聲波導(dǎo)向采卵共六十二頁3、卵子成熟度的判定從理論上講，成熟的卵母細胞在排卵前已完成第一次成熟分裂，第一極體的排出是卵成熟的標志。經(jīng)驗性評估卵母細胞成熟度的方法①根據(jù)卵丘細胞的伸展度②依據(jù)(yījù)卵泡的大?、鄹鶕?jù)卵丘細胞內(nèi)脂肪顆粒多少④根據(jù)卵-放射冠-卵丘復(fù)合體的特點成熟型：直徑3~5mm或更大，卵丘細胞之間距離大，放射冠分散，透明帶可見。未成熟型：直徑1~1.5mm，緊密放射冠，看不清透明帶共六十二頁成熟(chéngshú)的卵母細胞共六十二頁未成熟卵母細胞共六十二頁（三）精子的準備1、精液的采集與人工授精相同2、精液分析形態(tài)、細菌、免疫、細胞遺傳學(xué)關(guān)于精子受精(shòujīng)能力的評價：①保持直線性向前運動能力的精子受精能力強②正常精子多而畸形精子少，受精能力強穿卵實驗陽性，受精能力強3、精液的加工處理目的：洗滌精子、去除精漿、增強精子活力、精子獲能共六十二頁穿卵實驗(shíyàn)陽性共六十二頁（四）體外授精及體外培養(yǎng)1、孵育卵細胞：使卵母細胞在體外進一步成熟2、檢查精子活力，調(diào)節(jié)精子濃度3、人工授精：向孵育好的卵細胞中加入適量精子5~10萬4、換液培養(yǎng)：人工受精后14~16h觀察，如出現(xiàn)雌、雄原核，卵周隙有第二極體，表明受精成功，隨后將受精卵轉(zhuǎn)移到生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，使其卵裂并發(fā)育，以便(yǐbiàn)適時施行胚胎移植。共六十二頁（五）胚胎移植與妊娠監(jiān)護

ET是試管嬰兒試驗中的最后一步，也是最重要一關(guān)1、胚胎的移植：2~16細胞（卵裂球）時移植；2~4胚胎/次2、妊娠監(jiān)護：放射免疫方法檢測血、尿中hCG6天：血中hCG升高，8天：尿中hCG升高3周：超聲檢查胚囊位置，5周：胚胎大小和胎心波動3、影響ET的因素：①移植時，母體子宮內(nèi)膜與胚泡發(fā)育(fāyù)不同步；②穿刺取卵時黃體受損，使黃體功能不足；③移植過程中，胚泡損傷或子宮內(nèi)膜損傷共六十二頁4、提高受精率，卵裂率，早期胚胎率

關(guān)鍵在于不斷提高體外配子及胚胎培養(yǎng)(péiyǎng)技術(shù)

共培養(yǎng)技術(shù)提高受精卵、胚胎質(zhì)量及妊娠率。共培養(yǎng)：指卵子和精子體外受精后，置于一定濃度共培養(yǎng)細胞的條件培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。共培養(yǎng)細胞：自體細胞或異體細胞子宮內(nèi)膜細胞、顆粒細胞、輸卵管上皮細胞共六十二頁（六）“試管嬰兒”的成功率

1、成功率：體外受精率：85%~90%卵裂率（體外培養(yǎng)成功率）：80%胚胎移植(yízhí)后妊娠率：20%~25%2、畸形發(fā)生率：1987~1991年總計出生6248例試管嬰兒，有某種畸形的新生兒187例，占總數(shù)的2.8%。這與自然妊娠分娩的新生兒畸形發(fā)生率相當(dāng)。

共六十二頁二、顯微授精——第二代試管嬰兒

主要目標：幫助精子穿過透明帶

顯微授精技術(shù)(jìshù)透明帶鉆孔技術(shù)（PZD）

透明帶下授精（SUZI）

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）

針對男性少、弱、畸精癥或阻塞性無精癥共六十二頁（一）顯微(xiǎnwēi)授精技術(shù)發(fā)展簡史1962年Hiramoto首次將海膽精子直接注入海膽卵中1966年Graham將青蛙精子注入未受精的蛙卵中，PN形成1988年第一個通過精子微注射受精的子代動物（小鼠）誕生(dànshēng)1988年lanzendorf等人首次報道人精子直接注入卵胞漿中PN形成1992年P(guān)alermo等人報道卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）嬰兒誕生1996年我國首例ICSI在中山醫(yī)科大學(xué)獲得成功（莊廣倫）共六十二頁（二）IntracytoplasmicSpermInjection(ICSI)定義：指用顯微操作術(shù)將單個精子注入卵胞漿的過程適應(yīng)癥：①嚴重精子質(zhì)量異常②既往常規(guī)IVF失敗患者③嚴重的抗精子抗體患者④無精子癥患者⑤未成熟卵以及冷凍保存(bǎocún)的卵母細胞⑥常規(guī)IVF失敗未受精卵母細胞共六十二頁ICSI操作程序促排卵和卵子(luǎnzǐ)的采集卵子體外培養(yǎng)精子的采集及處理顯微注射①精子制動②卵胞漿內(nèi)精子注入③放開卵母細胞，培養(yǎng)16~24h4~8-細胞或囊胚后，移植母體子宮中共六十二頁共六十二頁共六十二頁共六十二頁共六十二頁影響(yǐngxiǎng)ICSI成功的主要因素ICSI成功與否主要看受精、卵裂及妊娠率，除技術(shù)因素外，徑自、卵子狀態(tài)及卵子激活(jīhuó)等都直接影響其成功。①顯微操作技術(shù)對ICSI的影響體外操作過程不超過5分鐘注射針內(nèi)徑5~8微米之間固定針外徑120微米，內(nèi)徑15~40微米②精子狀態(tài)對ICSI的影響共六十二頁影響ICSI成功(chénggōng)的主要因素

③卵子對ICSI的影響卵子狀態(tài)(zhuàngtài)卵母細胞成熟程度女性年齡影響卵子質(zhì)量卵子激活以放出第二極體、形成雌雄原核為標志并最終啟動卵子代謝的一系列變化

共六十二頁ICSI的風(fēng)險(fēngxiǎn)與出生缺陷與ICSI操作無關(guān)卵巢過度刺激綜合征、多胎妊娠、異位妊娠與ICSI操作有關(guān)(yǒuguān)基因缺陷垂直傳播外源DNA污染共六十二頁三、細胞核移植(yízhí)技術(shù)----第四代試管嬰兒（一）、概論什么是克隆(kèlónɡ)？“clone”：單性生殖，本意是指通過無性形式由單個細胞產(chǎn)生的和親代非常相似的后代。動物克?。褐敢粋€動物經(jīng)無性繁殖或孤雌生殖而產(chǎn)生的多個后代，克隆的所有成員遺傳物質(zhì)完全相同。共六十二頁人有無(yǒuwú)自然單性生殖？古代傳說：軒轅黃帝之母“感電光繞頭而有娠”，生黃帝1955年，Spuwary,相信人類有單性生殖至今尚無一例經(jīng)得起嚴格的科學(xué)檢驗生物進化證明：有性生殖是從無性生殖發(fā)展而來，刻意對人進行(jìnxíng)無性生殖意味著退化！共六十二頁細胞核移植(yízhí)是指將發(fā)育不同時期的胚胎或成體細胞核經(jīng)顯微手術(shù)和細胞融合方法移植到去核卵母細胞中，或?qū)Ⅲw細胞核直接注入去核卵母細胞中，重新組成(zǔchénɡ)胚胎并使之發(fā)育成子代個體?？寺〖夹g(shù)之所以引人關(guān)注，是因為它在醫(yī)療和畜牧業(yè)方面有深遠意義共六十二頁克隆(kèlónɡ)研究大事記1938年，德國科學(xué)家Spemann首次提出動物細胞克隆(kèlónɡ)設(shè)想1952年，美國學(xué)者Briggs和King首先在青蛙身上進行克隆實驗1970年，克隆青蛙取得突破進展1981年，胚胎克隆鼠成功1984年，胚胎克隆羊成功共六十二頁共六十二頁克隆(kèlónɡ)研究大事記1994年，用發(fā)育120個細胞階段的胚胎(pēitāi)細胞核移植成功，獲得克隆牛1997年，英國Wilmut體細胞克隆羊成功“多莉”1998年，英國PPL醫(yī)療公司，克隆?！案ミd先生”1998年，克隆鼠克隆出克隆鼠1999年，美國克隆第一只雄性鼠2000年，美國牛耳皮細胞克隆6頭牛2001年，美國克隆出第一個靈長類動物恒河猴共六十二頁共六十二頁二、哺乳動物細胞核移植(yízhí)方法（一）重構(gòu)卵的形成1、供體細胞和受體細胞的選擇和處理供體細胞：即細胞核的來源(láiyuán)早期胚胎細胞、干細胞、體細胞受體細胞：提供去除核后的只含有細胞質(zhì)的細胞

MII期卵母細胞、受精卵、融合后2細胞胚共六十二頁2、細胞核移植

包括(bāokuò)受體細胞核去除和供體細胞核移入受體細胞核的去除(qùchú)移核帶下移植胞質(zhì)內(nèi)注射共六十二頁共六十二頁細胞融合融合方法：化學(xué)融合、病毒融合、電融合

電融合：通過外加脈沖電場來改變細胞膜通透性，從而促進膜內(nèi)外物質(zhì)交換，當(dāng)細胞膜緊密(jǐnmì)接觸時，電擊可以使接觸膜上形成孔洞，導(dǎo)致細胞融合。融合液：0.27mol/L蔗糖液、甘露醇溶液電融合方法共六十二頁（二）重構(gòu)卵的活化(huóhuà)處理一般電融合完成后，卵子因電刺激而被激活，但也有的核移植重構(gòu)卵還需進一步充分激活才能發(fā)育。應(yīng)用(yìngyòng)較多的化學(xué)激活劑有7%乙醇、離子霉素、星形孢菌素等共六十二頁共六十二頁（三）移核胚的體外培養(yǎng)(péiyǎng)和胚胎移植與IVF-ET相同體外培養(yǎng)(péiyǎng)一段時間觀察發(fā)育能力將胚胎輸入輸卵管或子宮克隆動物誕生共六十二頁共六十二頁（四）影響(yǐngxiǎng)核移植的一些因素受體因素卵母細胞胞漿卵母細胞活化(huóhuà)時間卵母細胞年齡：不成熟或老化卵母細胞去核時去掉胞漿的多少共六十二頁四）影響核移植的一些(yīxiē)因素供體因素：供體核是克隆的主體，而受體無核胞漿只是提供發(fā)育的一個環(huán)境，因此供體細胞是影響(yǐngxiǎng)核移植胚發(fā)育的更關(guān)鍵因素。供體細胞的種類、分化程度和其所處細胞周期均影響核移植胚發(fā)育。共六十二頁（五）提高(tígāo)核移植成功率的方法選用MII期卵母細胞，在移植操作完成之后，避免或減少對卵母細胞的刺激，防止(fángzhǐ)過早活化。在操作完成一段時間后再用適當(dāng)?shù)拇碳な孤涯讣毎罨９w細胞選擇分化程度低的胚胎細胞和胎兒細胞并且處于G1或Go期細胞，克隆成功率較高。共六十二頁（六）核移植實驗(shíyàn)結(jié)果的檢測

為了保證核移植實驗結(jié)果的可靠性，有必要對實驗結(jié)果進行驗證性檢驗。毛色等在內(nèi)的表型特征遺傳(yíchuán)