快速有效篩選目標(biāo)微生物的新方法

宏基因組學(xué)

第一節(jié)什么是宏基因組學(xué)第二節(jié)宏基因組學(xué)技術(shù)流程第三節(jié)宏基因組學(xué)的應(yīng)用當(dāng)前1頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。第一節(jié)什么是宏基因組學(xué)背景知識(shí)：

迄今，人們對(duì)微生物世界的認(rèn)識(shí)基本都來(lái)源于對(duì)占細(xì)菌總種數(shù)不到1％的微生物的單個(gè)種群的孤立研究結(jié)果。然而微生物是通過(guò)其群落而非單一種群來(lái)執(zhí)行在自然界物質(zhì)與能量循環(huán)中的作用的，對(duì)微生物群落作為整體的功能認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于對(duì)其個(gè)體的認(rèn)識(shí)。這種狀況不利于全面認(rèn)識(shí)微生物在自然界所扮演的重要角色。為了獲得完整的環(huán)境微生物基因表達(dá)產(chǎn)物，早在1978年許多學(xué)者就提出了直接從環(huán)境中提取微生物DNA的思路，1998年，ARIADpharmaceutical公司的科學(xué)家Handelsman等首次提出宏基因組的概念。

當(dāng)前2頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。宏基因組(thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature)是指生境中全部微生物基因的總和。它包含了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物的基因總和，微生物主要包括環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌。宏基因組學(xué)(metagenomics)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系等為研究目的的新的微生物研究方法，也稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)或生態(tài)基因組學(xué)。它主要研究從環(huán)境樣品獲得的基因組中所包含的微生物的遺傳組成及其群落功能，為充分認(rèn)識(shí)和開發(fā)利用非培養(yǎng)微生物，并從完整的群落水平上認(rèn)識(shí)微生物的活動(dòng)、最大限度地挖掘微生物資源提供了可能

當(dāng)前3頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。第二節(jié)宏基因組學(xué)技術(shù)流程從環(huán)境中提取宏基因組DNA；用核酸內(nèi)切酶切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段并連接到合適的載體上；轉(zhuǎn)化宿主菌，形成一個(gè)重組的DNA文庫(kù)即宏基因組文庫(kù)；宏基因組文庫(kù)篩選。當(dāng)前4頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。宿主菌株的選擇主要考慮：1、在生態(tài)學(xué)方面的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：為高通量篩選提供了保障，而且不需要對(duì)底物進(jìn)行修飾；研究表明，不同微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)有明顯差異，不同的研究目標(biāo)應(yīng)選擇不同的宿主菌株。當(dāng)前8頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。宏基因組學(xué)為人類開發(fā)利用未培養(yǎng)微生物提供了新的思路和途徑，隨著宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和新的思路和途徑以及宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和完善，其應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒏訌V闊，更多的工業(yè)用酶將被商業(yè)化。當(dāng)前21頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。細(xì)胞提取法和直接裂解法宏基因組學(xué)(metagenomics)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系等為研究目的的新的微生物研究方法，也稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)或生態(tài)基因組學(xué)。通過(guò)DNA微陣列技術(shù)(基因芯片技術(shù))尋找環(huán)境基因組序列中的有用片段也是一種全新的篩選技術(shù)，它可以快速有效的識(shí)別和描述許多菌落的特征，并可應(yīng)用于大量保守基因的分離。宏基因組學(xué)(metagenomics)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系等為研究目的的新的微生物研究方法，也稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)或生態(tài)基因組學(xué)。當(dāng)前14頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。質(zhì)粒載體(如pUC18和pUC19)，插入片段一般小于10kb；在宏基因組克隆中，所謂轉(zhuǎn)化是指通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ顾拗骷?xì)胞處于感受態(tài)，從而攝取重組DNA的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程。當(dāng)前7頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。一、環(huán)境樣品DNA提取

提取步驟通常需要滿足兩個(gè)條件：①盡可能提取樣品所有微生物的基因，②保持片段的完整和純度。目前所開發(fā)的DNA提取方法有兩種：

細(xì)胞提取法和直接裂解法當(dāng)前5頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。直接裂解法：

物理法：凍融法、超聲法、玻璃球珠擊打法、液氮碾磨法

化學(xué)法：常用化學(xué)試劑有表面活性劑、鹽類、有機(jī)溶劑等

酶裂解法

依據(jù)提取樣品總DNA前是否分離細(xì)胞，可以分為原位裂解法和異位裂解法。當(dāng)前6頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。1、原位裂解法（直接提取法）原位裂解法是在環(huán)境樣品中加入DNA提取緩沖液，使細(xì)胞裂解然后從樣品中直接提取DNA并純化的方法。

優(yōu)缺點(diǎn)：該法提取的DNA產(chǎn)量較高，操作容易、成本低，但純度低，腐植酸等污染嚴(yán)重，往往還需要經(jīng)過(guò)純化處理才能滿足后續(xù)分子生物學(xué)操作的需要，此外，由于機(jī)械剪切作用較強(qiáng)，提得的DNA片段長(zhǎng)度有限（1-50Kb），常適用于構(gòu)建小片段插人文庫(kù)(以質(zhì)粒和噬菌體為載體)的DNA提取。

當(dāng)前7頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。2、異位裂解法異位裂解法是先把微生物細(xì)胞從環(huán)境樣品中分離出來(lái)，再?gòu)奈⑸锛?xì)胞提取DNA并純化。優(yōu)缺點(diǎn)：所得的DNA純度較高，但DNA產(chǎn)量及所包含的基因組信息的廣泛性不及直接提取法并且操作繁瑣、成本高、得率低。間接提取法提得的DNA片段長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)（20-500Kb），適合構(gòu)建黏粒（cosmid）文庫(kù)和細(xì)菌人工染色體（BAC）文庫(kù)。當(dāng)前8頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。

二、宏基因組文庫(kù)構(gòu)建當(dāng)前9頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。第一節(jié)什么是宏基因組學(xué)目前的研究工作已經(jīng)得到大批新基因，特別是在一些極端環(huán)境中的微生物宏基因組的研究中得到了一些具有特殊應(yīng)用價(jià)值的功能酶基因可以從底物推斷出未知的酶，進(jìn)而推斷基因的功能;宏基因組學(xué)具挑戰(zhàn)性的一項(xiàng)長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)是面對(duì)大量宏基因組序列片斷的指數(shù)式遞增，通過(guò)鄰接片段(Contigs)及染色體步移(walking)和亞克隆(clonetoclone)等手段重建那些尚未被培養(yǎng)的微生物的基因組。目前所開發(fā)的DNA提取方法有兩種：某些基因無(wú)需誘導(dǎo)即能表達(dá)；化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選(Screeningoncompoundstructure)是根據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在色譜中有不同的吸收峰值，通過(guò)比較轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入外源基因的宿主細(xì)胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖，篩選產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物的克隆子。迄今，人們對(duì)微生物世界的認(rèn)識(shí)基本都來(lái)源于對(duì)占細(xì)菌總種數(shù)不到1％的微生物的單個(gè)種群的孤立研究結(jié)果。底物誘導(dǎo)的篩選(Substrate-inducedgeneexpressionscreening，SIGEX)是利用合適的底物進(jìn)行誘導(dǎo)，使克隆子分解代謝基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行篩選的方法。當(dāng)前23頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。當(dāng)前5頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。轉(zhuǎn)化效率，重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性，宿主能否為相關(guān)功能基因提供必需的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系，對(duì)異源表達(dá)基因產(chǎn)物提供必需的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系，對(duì)異源表達(dá)基因產(chǎn)物是否有較強(qiáng)的相容性，以及目標(biāo)性狀(如抗菌性)及缺陷型等因素。當(dāng)前13頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。異位裂解法是先把微生物細(xì)胞從環(huán)境樣品中分離出來(lái)，再?gòu)奈⑸锛?xì)胞提取DNA并純化。從環(huán)境中提取宏基因組DNA；1、載體系統(tǒng)選擇常用的克隆載體有:質(zhì)粒載體(如pUC18和pUC19)，插入片段一般小于10kb；Cosmid(黏粒載體，如pWE15)，插入片段30～45kb；BAC(細(xì)菌人工染色體，如pBeloBAC11)，插入片段大于100kb。當(dāng)前10頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。選擇合適的載體系統(tǒng)，應(yīng)考慮以下因素:

所提DNA的質(zhì)量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的載體拷貝數(shù)、使用的宿主以及篩選方法等。如對(duì)腐殖質(zhì)含量較高或剪切較嚴(yán)重的DNA樣品適宜構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)，小片段的文庫(kù)適用于篩選新的與代謝相關(guān)的單基因或小操縱子。而對(duì)于含較大基因簇或大片段的DNA樣品則適宜構(gòu)建Cosmid、Fosmid或BAC文庫(kù)，從而篩選由較大基因簇編碼的復(fù)雜代謝途徑或能夠表征環(huán)境中未培養(yǎng)微生物基因組的較大基因片段。

當(dāng)前11頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。

2、宿主系統(tǒng)選擇

宿主菌株的選擇主要考慮：轉(zhuǎn)化效率，重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性，宿主能否為相關(guān)功能基因提供必需的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系，對(duì)異源表達(dá)基因產(chǎn)物提供必需的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系，對(duì)異源表達(dá)基因產(chǎn)物是否有較強(qiáng)的相容性，以及目標(biāo)性狀(如抗菌性)及缺陷型等因素。

研究表明，不同微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)有明顯差異，不同的研究目標(biāo)應(yīng)選擇不同的宿主菌株。鑒于7O%的抗生素來(lái)源于放線菌的事實(shí)，若以尋找抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)為目標(biāo)，選擇鏈霉菌為宿主較理想；而篩選新的酶則采用大腸桿菌為宜。當(dāng)前12頁(yè)，共25頁(yè)，星期日?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了抗生素及維生素生物合成相關(guān)基因簇的克隆，以及水解酶類和氧化還原酶類編碼的基因。宏基因組學(xué)(metagenomics)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系等為研究目的的新的微生物研究方法，也稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)或生態(tài)基因組學(xué)。功能驅(qū)動(dòng)的篩選(Function-drivenscreening)即基于活性的篩選。傳統(tǒng)的新型酶的篩選方法限制了篩選的廣泛性和有效性。當(dāng)前13頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。優(yōu)點(diǎn)：為高通量篩選提供了保障，而且不需要對(duì)底物進(jìn)行修飾；基于序列的篩選策略可以利用基因芯片技術(shù)大大提高篩選效率，有可能篩選到某一類結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)中的新分子，但必須對(duì)相關(guān)基因序列有一定的了解，較難發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)。它包含了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物的基因總和，微生物主要包括環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌。當(dāng)前14頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。優(yōu)點(diǎn)：不依賴克隆基因在宿主菌株中的表達(dá)。宿主菌株的選擇主要考慮：但是某些基因的表達(dá)不僅受底物誘導(dǎo)，還可受其他因子的誘導(dǎo)；當(dāng)前24頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。底物誘導(dǎo)的篩選(Substrate-inducedgeneexpressionscreening，SIGEX)是利用合適的底物進(jìn)行誘導(dǎo)，使克隆子分解代謝基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行篩選的方法。BAC(細(xì)菌人工染色體，如pBeloBAC11)，插入片段大于100kb。3、轉(zhuǎn)化

在宏基因組克隆中，所謂轉(zhuǎn)化是指通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ顾拗骷?xì)胞處于感受態(tài)，從而攝取重組DNA的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程。其方法有CaC12法和電穿孔法。CaC12法即用高濃度的Ca2+誘導(dǎo)細(xì)胞使其成為能攝取外源DNA的感受狀態(tài)，該方法自建立以來(lái)已廣泛用于以大腸桿菌為受體的重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，但該方法轉(zhuǎn)化效率不高。電穿孔法是用高壓脈沖電流擊破宿主細(xì)胞膜或擊成小孔，從而使外源DNA由小孔進(jìn)入細(xì)胞，該方法轉(zhuǎn)化效率較高。當(dāng)前13頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。三、宏基因組文庫(kù)篩選1功能驅(qū)動(dòng)的篩選2化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選3序列驅(qū)動(dòng)的篩選4底物誘導(dǎo)的篩選當(dāng)前14頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。1功能驅(qū)動(dòng)的篩選

功能驅(qū)動(dòng)的篩選(Function-drivenscreening)即基于活性的篩選。是根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性而進(jìn)行篩選的方法。優(yōu)點(diǎn)：只要基因能在宿主中表達(dá)，就可以根據(jù)基因表達(dá)特性進(jìn)行篩選，能迅速找到可用于工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)的酶等蛋白質(zhì)和抗生素等天然產(chǎn)物；缺點(diǎn)：目的基因必須能在宿主中進(jìn)行功能表達(dá)，而基因表達(dá)與否除了和宿主有關(guān)外，還決定于基因本身的完整性，這就要求一方面要選擇合適的宿主菌株，另一方面要求克隆到基因或基因簇的全長(zhǎng)，一旦克隆過(guò)程中基因的某個(gè)組件遭到破壞將使基因無(wú)法表達(dá)，也就不能根據(jù)表型加以篩選。篩選工作量大、效率低。當(dāng)前15頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。2化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選(Screeningoncompoundstructure)是根據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在色譜中有不同的吸收峰值，通過(guò)比較轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入外源基因的宿主細(xì)胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖，篩選產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物的克隆子。這一方法可直接篩選到新結(jié)構(gòu)化合物，但不一定有生物活性，且工作量大、成本高。當(dāng)前16頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。3序列驅(qū)動(dòng)的篩選序列驅(qū)動(dòng)的篩選(Sequence-drivenscreening)是根據(jù)已知功能的基因序列設(shè)計(jì)探針或PCR引物，通過(guò)核酸雜交或PCR擴(kuò)增來(lái)篩選具有目標(biāo)序列的克隆子。優(yōu)點(diǎn)：不依賴克隆基因在宿主菌株中的表達(dá)。缺點(diǎn)：必須對(duì)相關(guān)基因序列有所了解，無(wú)法篩選宏基因組文庫(kù)中那些和現(xiàn)有基因序列完全不同的新基因(即未知基因)。當(dāng)前17頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。PS：通過(guò)DNA微陣列技術(shù)(基因芯片技術(shù))尋找環(huán)境基因組序列中的有用片段也是一種全新的篩選技術(shù)，它可以快速有效的識(shí)別和描述許多菌落的特征，并可應(yīng)用于大量保守基因的分離?；谛蛄械暮Y選策略可以利用基因芯片技術(shù)大大提高篩選效率，有可能篩選到某一類結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)中的新分子，但必須對(duì)相關(guān)基因序列有一定的了解，較難發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)。當(dāng)前18頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。4底物誘導(dǎo)的篩選底物誘導(dǎo)的篩選(Substrate-inducedgeneexpressionscreening，SIGEX)是利用合適的底物進(jìn)行誘導(dǎo)，使克隆子分解代謝基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行篩選的方法。優(yōu)點(diǎn)：為高通量篩選提供了保障，而且不需要對(duì)底物進(jìn)行修飾；可以從底物推斷出未知的酶，進(jìn)而推斷基因的功能;缺點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)性和適應(yīng)性很敏感，用于誘導(dǎo)的底物必須要進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，若不能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，則無(wú)法誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)；但是某些基因的表達(dá)不僅受底物誘導(dǎo)，還可受其他因子的誘導(dǎo)；某些基因無(wú)需誘導(dǎo)即能表達(dá)；某些本可誘導(dǎo)表達(dá)的基因由于宿主的改變而無(wú)法誘導(dǎo)表達(dá)。而且FACS（熒光激活細(xì)胞分揀術(shù)）對(duì)進(jìn)樣設(shè)備的要求也比較高。當(dāng)前19頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。第三節(jié)宏基因組學(xué)的應(yīng)用當(dāng)前20頁(yè)，共25頁(yè)，星期日。1、在生態(tài)學(xué)方面的應(yīng)用

宏基因組在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用主要是土壤與水體。目前其在土壤微生物研究中的應(yīng)用主要包括兩方面：一、進(jìn)行土壤微生物及其資源的挖掘。目前的研究工作已經(jīng)得到大批新基因，特別是在一些極端環(huán)境中的微生物宏基因組的研究中得到了一些具有特殊應(yīng)用價(jià)值的功能酶基因二、揭示土壤微生物的多樣性及其與環(huán)境之間的關(guān)系。

在水體中的應(yīng)用：海洋蘊(yùn)涵著非常豐富的微生物資源，目前已應(yīng)用宏基因組技術(shù)研究了多種海洋次生代謝產(chǎn)物合成途徑，其中最為經(jīng)典的是研究海洋聚酮類和非核糖體肽類的生物合成基因簇。