DB36T 1036-2018 芝麻細菌性青枯病診斷及檢測技術(shù)規(guī)程　

DB36TechniquelyRulesforDiagnosisandDetectionofSesameBacterialW江西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 2 3 4本標準按照GB/T1.1-2009給本標準起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所、江西生物科技職1芝麻細菌性青枯病診斷及檢測技術(shù)規(guī)程本標準規(guī)定了芝麻細菌性青枯病（Sesamebacterialwilt）診斷及檢測技術(shù)的術(shù)語和定義、癥狀診斷、病原菌形態(tài)學鑒定與致病性測定和病原細菌染色體上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在16S～23SrRNA基因區(qū)間的一段高度可變序列，該區(qū)域種間多態(tài)性豐富，而種內(nèi)卻非常保守，這4病原菌形態(tài)學鑒定與致病性測定4.1菌株分離與形態(tài)學鑒定4.1.1菌株分離采集典型的芝麻細菌性青枯病標本，剪取病健交界處病莖3cm～4cm，經(jīng)75%酒精消毒、滅菌水沖洗后，剪去兩頭取中間段置于裝有5ml～10ml無菌水的試管中靜置5min左右至懸浮液變混濁，用接種環(huán)蘸2行光學顯微鏡下菌體的革蘭氏染色、鞭毛染4.1.2形態(tài)學鑒定3mm。在2,3,5-氯化三苯基四氮唑（簡稱TZC，下同）選擇性培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72h，產(chǎn)生的菌落呈不規(guī)則圓形，具流動性，中心呈紅色至桔紅色，邊緣為白色，菌落直徑24.2菌株致病性測定4.2.1接種體制備將形態(tài)學鑒定為青枯菌(R.solanacerum)的菌株于NA平板上培養(yǎng)活化48h后，配成1×108CFU/ml菌懸4.2.2接種期4.2.3接種方法在26℃~30℃溫室保濕條件下，采用以下3種方法接種：——剪葉接種：選擇完全展開的葉片，用滅菌剪刀蘸取菌液剪——針刺接種：用滅菌的小號注射器抽取菌液，在莖桿中部葉腋處針刺注射菌液，每株注射菌液——傷根灌菌液接種:用小鐵鏟從距莖基2cm～3cm處斜插入土，隨后每株灌入菌液30ml。4.2.4結(jié)果調(diào)查5.1特異性引物合成5.3瓊脂糖凝膠電泳取擴增樣品5μl，加入1μl6倍上樣緩沖液（6×loadingbuffer），混勻，點樣于1.0%的瓊脂糖凝膠（含0.05μl/mlEB或Goldview）上樣孔中，用0.5×TBE緩沖液在5V/cm～8V/cm電壓條件下電3對5.3獲得的陽性克隆進行序列測定。將測定得到的各菌株16SrRNA序列、ITS序列與GenBank中核4A.1NA培養(yǎng)基牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖或蔗糖10g，瓊脂18g～20g，蒸餾水1000ml，pH7.4～7.6。高壓濕熱121℃滅菌2A.2TZC培養(yǎng)基配制200ml蒸餾水中。加熱溶化后，裝入250ml三角瓶中，每瓶裝200ml。121℃高壓濕熱滅菌5B.1.116S引物序列分別為5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′B.1.2ITS引物序列為5′-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3′；5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′。擴增片段大小為5916PCR