第四章 抗體制藥課件

第四章抗體藥物第四章抗體制藥抗體—應(yīng)用于免疫治療與免疫診斷免疫缺陷；腫瘤；感染；自身免疫病；超敏反應(yīng)；移植排斥；炎癥。第四章抗體制藥中和毒素；介導(dǎo)溶解病原微生物；介導(dǎo)溶解淋巴細(xì)胞；中和炎癥因子；作為靶向性載體?？贵w治療作用機(jī)制：第四章抗體制藥第一節(jié)概述第二節(jié)單克隆抗體第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改造第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程第五節(jié)抗體診斷試劑第六節(jié)抗體治療藥物第四章抗體制藥第一節(jié)概述1890年發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立了血清療法，開(kāi)抗體治療之先河。傳統(tǒng)免疫療法：例如現(xiàn)在仍在使用的破傷風(fēng)抗毒素血清。SARS病毒的免疫治療：例如鐘南山提倡使用的以SARS痊愈病人的血清來(lái)治療SARS病人。1937年，電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種球蛋白、乙種球蛋白、丙種球蛋白，那么抗體屬于哪一種蛋白？第四章抗體制藥抗體：能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白：具有抗體活性及化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。抗體=免疫球蛋白？抗體是生物學(xué)上功能的概念，而免疫球蛋白則是化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念?？贵w∈免疫球蛋白，免疫球蛋白≠抗體例如：多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞也能分泌一些同抗體分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似的球蛋白，即免疫球蛋白。第四章抗體制藥多克隆抗體：在作為診斷試劑使用的時(shí)候，容易發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生。單克隆抗體：高度特異性、均一性、來(lái)源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)，主要用于疾病的診斷與治療。診斷：例如利用單克隆抗體檢測(cè)與某些疾病有關(guān)的抗原、輔助臨床診斷或用放射性核素標(biāo)記的單抗進(jìn)行腫瘤顯像。治療：例如針對(duì)T淋巴細(xì)胞分化抗原CD3的單抗，可用作免疫抑制劑抑制器官移植中的排斥反應(yīng)，現(xiàn)已上市。以單抗為載體的藥物可對(duì)腫瘤進(jìn)行導(dǎo)向治療。第四章抗體制藥單抗介導(dǎo)的免疫療法缺陷：（1）鼠原性單抗具有抗原性，容易引起人抗鼠免疫反應(yīng)，從而降低藥物的半衰期。（2）完整的抗體分子太大，不易穿透實(shí)體瘤組織。解決辦法：（1）降低單抗的免疫原性（單抗的人原化或基因工程抗體）（2）降低單抗的分子量改進(jìn)的抗體：改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、超變區(qū)多肽（最小識(shí)別單位）。這些改進(jìn)抗體許多原來(lái)的鼠源性單抗的生物學(xué)活性消失，如激活補(bǔ)體、免疫調(diào)理、ADCC等，只保留了同抗原特異性結(jié)合的活性。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體單克隆抗體的制備一、抗原與動(dòng)物免疫二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定五、單克隆抗體的大量制備六、單克隆抗體的純化第四章抗體制藥第四章抗體制藥第四章抗體制藥一、抗原與動(dòng)物免疫（1）抗原的制備（2）免疫動(dòng)物的選擇（3）免疫方法：I.體內(nèi)免疫法：免疫原性強(qiáng)、抗原量多時(shí)應(yīng)用。一般在采集脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原，使對(duì)應(yīng)的B淋巴細(xì)胞克隆受到可靠的最大限度刺激后分裂增殖。II.體外免疫法：應(yīng)用于制備人源性單克隆抗體，或抗原免疫原性極弱且能引起免疫抑制時(shí)使用。具體方法就是制備脾細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，加入抗原刺激，然后分離脾細(xì)胞進(jìn)入融合。第四章抗體制藥二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的基本方法：取適量的脾細(xì)胞（1X108）與骨髓瘤細(xì)胞（2~3X107）進(jìn)行混合，在PEG作用下誘導(dǎo)融合，時(shí)間控制在2min內(nèi)，融后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。PEG：分子量和濃度大，則促融合率高，但粘度和毒性也大。常用分子量為4000，濃度為40~50%。為了提高融合率，也常用DMSO來(lái)提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。融合后的結(jié)果：脾-脾，瘤-瘤，脾-瘤及未融合的細(xì)胞。在正常培養(yǎng)基中，哪種細(xì)胞生長(zhǎng)速度最慢？第四章抗體制藥細(xì)胞DNA合成與HAT選擇培養(yǎng)基：（1）主途徑：由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過(guò)程。（2）輔助途徑：在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。選擇培養(yǎng)基：次黃嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT－細(xì)胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活與繁殖飼養(yǎng)細(xì)胞：能釋放生長(zhǎng)刺激因子，并能滿(mǎn)足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴(lài)性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞，常用為飼養(yǎng)細(xì)胞。第四章抗體制藥三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化篩選陽(yáng)性克?。撼Ｓ梅椒ㄓ蠩LISA，放免，熒光免疫等，經(jīng)過(guò)篩選可得到所需要的產(chǎn)單抗的細(xì)胞株。陽(yáng)性細(xì)胞的克隆化：指篩選得到的陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而得到細(xì)胞集團(tuán)的培養(yǎng)過(guò)程。一般經(jīng)過(guò)3次克隆，可得到純陽(yáng)性克隆?？寺』Ｓ梅椒橛邢尴♂尫ê蛙洯傊?。有限稀釋法：通過(guò)有限稀釋?zhuān)姑靠字欣碚撋现挥幸粋€(gè)細(xì)胞，通過(guò)飼養(yǎng)細(xì)胞的幫助成長(zhǎng)為克隆。第一次應(yīng)使用HT培養(yǎng)基，其后用正常培養(yǎng)基即可。軟瓊脂法：培養(yǎng)基中加入0.5%瓊脂，將克隆打碎后再繼續(xù)培養(yǎng)。第四章抗體制藥四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定雜交瘤細(xì)胞的鑒定：主要是染色體分析。正常鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)為40，全部是端著絲粒染色體；小鼠骨髓瘤的染色體數(shù)變異大，多為非整倍性，并且有中部著絲點(diǎn)染色體和亞中部著絲點(diǎn)染色體。雜交瘤細(xì)胞的染色體在數(shù)目上接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒。染色體數(shù)目多而集中的雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌高效價(jià)的抗體，而染色體數(shù)目少且分散的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力較低。其他鑒定：Ig類(lèi)和亞類(lèi)的鑒定；親和力鑒定；單克隆抗體的特異性、純度和識(shí)別抗原的相對(duì)分子量等進(jìn)行鑒定第四章抗體制藥五、單克隆抗體的大量制備體外培養(yǎng)法：（1）傳統(tǒng)培養(yǎng)方法：RPMI1640培養(yǎng)液，10~20%小牛或胎牛血清，但由于雜蛋白太多，純化困難。如采用無(wú)血清培養(yǎng)基（白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、乙醇胺），但產(chǎn)量低。一般來(lái)說(shuō)，可獲得10ug/ml的抗體。（2）懸浮培養(yǎng)方法：懸浮培養(yǎng)或用DEAE-SephadexA50作為載體進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。動(dòng)物體內(nèi)誘生法：在接種細(xì)胞前1~2周，注入降植烷（或液體石蠟)0.5ml破壞腹腔內(nèi)膜，接種1x106瘤細(xì)胞，生成腹水后抽取幾次可達(dá)10ml。優(yōu)點(diǎn)是抗體效價(jià)高，量多，但也存在純化困難的問(wèn)題。第四章抗體制藥六、單克隆抗體的純化（1）澄清和沉淀處理：腹水離心收集上清夜微孔濾膜過(guò)濾去除細(xì)胞等雜質(zhì)去除細(xì)菌、支原體等收集濾液50%飽和度的硫酸銨沉淀90%以上的單抗可被回收第四章抗體制藥（2）分離1）凝膠過(guò)濾：用于IgG,IgM類(lèi)抗體的純化。常用SephadexG200作分離介質(zhì)，可收集3個(gè)峰，最高峰為IgM，另2個(gè)峰為IgG，抗體回收率50~80%，純度95%以上。2）陰離子交換層析：用于IgG類(lèi)單抗的純化。例如：pH7.4，IgG1和IgG2能結(jié)合DEAE，隨離子強(qiáng)度逐漸升高，依次洗脫IgG2a、2b以IgG3。3）親和層析：用蛋白A親和純化IgG類(lèi)單抗。pH8.0,單抗結(jié)合；pH3.5,洗脫IgG2b；pH4.0,洗脫IgG3；pH4.5,洗脫IgG2a；pH6.0,洗脫IgG1第四章抗體制藥第四章抗體制藥抗細(xì)胞表面分子的單抗：抗CD3McAb：主要通過(guò)細(xì)胞清除、功能性受體封阻、免疫調(diào)變、刺激抑制細(xì)胞增殖等途徑殺傷成熟T細(xì)胞或阻斷機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)達(dá)到抗排斥目的。1986年美國(guó)FDA已批準(zhǔn)應(yīng)用小鼠抗CD3McAb治療急性腎移植排斥反應(yīng)。CD3McAb治療心、肝移植排斥反應(yīng)已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，正申請(qǐng)投放市場(chǎng)。第四章抗體制藥抗CD4McAb：具有干擾發(fā)育中的T細(xì)胞、阻礙CD4分子識(shí)別、清除CD4+T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞活化以及抑制對(duì)靶細(xì)胞的殺傷等作用?？勺鳛槊庖咭种苿┯糜谕N異體器官移植排斥反應(yīng)的治療、免疫耐受的誘導(dǎo)以及自身免疫性疾病的治療等。治療HIV感染，I期臨床試驗(yàn)。1991年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)年會(huì)上報(bào)道了用抗CD4McAb治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）。抗CD4嵌合抗體（Centocor公司）治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥也已進(jìn)入Ⅱ期臨床驗(yàn)證?？笴D4McAb（OrthoBiotech公司）預(yù)防器官移植排斥反應(yīng)已開(kāi)始臨床驗(yàn)。第四章抗體制藥抗細(xì)胞因子的單抗：抗IL1、TNFMcAb：抗炎抗體導(dǎo)向藥物治療：放射免疫療法抗體導(dǎo)向化學(xué)療法：甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、阿霉素免疫毒素療法：蓖麻毒素、白喉毒素第四章抗體制藥第四章抗體制藥第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改造抗體改造的目的：（1）降低免疫原性；（2）降低分子量鼠源性單抗存在的問(wèn)題：分子量大，穿透力低；抗原性強(qiáng)，易降低藥效及引起副作用?？贵w改造的原則：保持抗體與抗原特異性結(jié)合的能力第四章抗體制藥抗體基本結(jié)構(gòu)

(一)重鏈（heavychain，H）

2條

輕鏈（lightchain，L）2條

(二)可變區(qū)（variableregion,V區(qū)）恒定區(qū)（constantregion,C區(qū)）

(三)超變區(qū)（

hyper-variableregion,HVR),又稱(chēng)

互補(bǔ)決定區(qū)(complementarydetermining

region,CDR）

骨架區(qū)（frameworkregion,

FR）

(四)鉸鏈區(qū)（hingeregion）第四章抗體制藥第四章抗體制藥一、人-鼠嵌合抗體提取瘤細(xì)胞的mRNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄VH,VL基因特異性引物PCR形成人-鼠嵌合的V-C區(qū)基因質(zhì)粒上游啟動(dòng)子、前導(dǎo)肽序列、下游剪切供體信號(hào)、增強(qiáng)子克隆到人抗體的輕、重鏈C區(qū)基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞脂質(zhì)體介導(dǎo)篩選陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)、表達(dá)人-鼠嵌合抗體第四章抗體制藥第四章抗體制藥二、改形抗體Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR區(qū)），不是整個(gè)可變區(qū)。H鏈和L鏈各有三個(gè)CDR，其余為框架區(qū)。改形抗體：用鼠源性單抗的CDR序列替換人Ig分子中的CDR序列，可使人Ig分子具有鼠源性單抗的抗原結(jié)合特異性，又因抗體中鼠源部分比例少而基本消除了免疫原性，又稱(chēng)CDR移植抗體。第四章抗體制藥改形抗體問(wèn)題：抗體親和力下降，甚至喪失活性，原因是人Ig分子的框架區(qū)中的一些氨基酸與鼠Ig的CDR區(qū)不協(xié)調(diào)。解決方案一：將鼠與親和性有關(guān)的殘基引入人Ig的框架區(qū)中，可顯著提高抗體的親和力。解決方案二：選擇與鼠源性單抗同源性最大的人Ig分子為框架區(qū)序列，再將人Ig中較為獨(dú)特的殘基替換成鼠CDR區(qū)附近的框架區(qū)殘基。第四章抗體制藥模板替換：用與鼠對(duì)應(yīng)部分有較大同源性的人框架區(qū)替換鼠框架區(qū)。表面重塑：對(duì)鼠CDR及框架區(qū)表面殘基進(jìn)行鑲嵌或重塑使其類(lèi)似于人抗體CDR輪廓或人框架區(qū)。補(bǔ)償變換：在人的框架區(qū)選擇與CDR有相互作用，與抗體的親和力有密切關(guān)系或?qū)蚣軈^(qū)空間結(jié)構(gòu)折疊起關(guān)鍵作用的殘基進(jìn)行改變，以補(bǔ)償完全的CDR移植。定位保留：在人源化的改形抗體中保留了鼠源性抗體可變區(qū)中參與抗原結(jié)合的氨基酸殘基，包括CDR區(qū)和框架區(qū)中的一些關(guān)鍵殘基。第四章抗體制藥三、小分子抗體人-鼠嵌合抗體雖然能部分解決鼠源性單抗抗原性問(wèn)題，但不能解決抗體分子量大，不易穿透組織的缺點(diǎn)。基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單抗的V區(qū)（即保留了CDR區(qū)），而Ig分子的C區(qū)不表達(dá)，因此其分子量?jī)H為原抗體的1/80~1/3。第四章抗體制藥小分子抗體（1）Fab片斷抗體：包含有重鏈的VH+CH1以及完整的輕鏈。（2）FV抗體：由VH和VL組成。（3）單鏈抗體：由抗體VH和VL通過(guò)一段連接肽連接而成的重組蛋白，具有分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性小的特點(diǎn)，且易與效應(yīng)分子相連接，構(gòu)建多種新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異性抗體的理想元件。（4）單域抗體：由VH或VL單個(gè)可變區(qū)組成，只有抗體分子的1/12，表面疏水性強(qiáng)，與抗原特異性結(jié)合的能力弱。（5）最小識(shí)別單位：由單個(gè)CDR區(qū)構(gòu)成的小分子抗體，具有與抗原結(jié)合的能力，但親和力低，也稱(chēng)超變區(qū)多肽。第四章抗體制藥第四章抗體制藥單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)：（1）可去除許多造成非特異性反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性表面蛋白，腫瘤顯像的背景更清晰。（2）更容易滲透到腫瘤組織中，增加有效藥物的濃度。（3）分子量小，抗原性小，能消除人抗鼠的排異反應(yīng)，從而延長(zhǎng)在人體內(nèi)的半衰期。

單鏈抗體的構(gòu)建方法一：雜交瘤細(xì)胞提取mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNAPCR擴(kuò)增VH和VL基因合成接頭用接頭將VL的C端和VH的N端或VH的C端與VL的N端連接單鏈抗體單鏈抗體第四章抗體制藥接頭：又稱(chēng)linker，必須能使重、輕鏈可變區(qū)自由折疊，使抗原結(jié)合位點(diǎn)處于適當(dāng)?shù)臉?gòu)型，并盡可能減少蛋白酶攻擊和防止單鏈聚集。Linker長(zhǎng)度為14~25個(gè)氨基酸為宜，目前最常用的為15肽序列（Gly4Ser）3。方法二：噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，可用于單鏈抗體的構(gòu)建。單鏈抗體可在大腸桿菌中表達(dá)，有3種表達(dá)方式（1）直接在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（2）與其他菌體蛋白融合表達(dá)成融合蛋白（3）分泌表達(dá)具有功能的單鏈抗體：將單鏈抗體基因與引導(dǎo)分泌的信號(hào)肽基因相連接，使表達(dá)產(chǎn)物分泌出來(lái)，獲得有活性的可溶性表達(dá)產(chǎn)物。第四章抗體制藥四、雙功能抗體（1）化學(xué)交聯(lián)法：用化學(xué)試劑交聯(lián)Ig分子表面的巰基。（2）生物學(xué)方法：將分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞與分泌另一種抗體的脾細(xì)胞融合，形成可分泌兩種親代抗體和雜種抗體的雜種-雜交瘤細(xì)胞。（3）基因工程法：用接頭連接不同抗體的VH和VL區(qū)，使它們不能形成鏈內(nèi)的分子內(nèi)配對(duì)，讓其形成原抗體的分子內(nèi)配對(duì)，構(gòu)建雙特異性抗體（SCFV)2。第四章抗體制藥雙功能抗體的優(yōu)點(diǎn)：避免了化學(xué)交聯(lián)對(duì)抗體的損害，又可定向結(jié)合抗原部位，減少非特異性分布和副作用。雙功能抗體抗腫瘤：雙功能抗體的一個(gè)臂識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，另一個(gè)臂識(shí)別免疫效應(yīng)細(xì)胞及分子，如CD3、毒素、藥物等，介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、LAK細(xì)胞或毒素與藥物發(fā)揮細(xì)胞毒作用。CD3分子的主要功能是參與TCR/CD3復(fù)合體的裝配和穩(wěn)定以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)NK細(xì)胞或T細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，在高劑量IL-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)下成為能夠殺傷NK不敏感腫瘤細(xì)胞的殺傷細(xì)胞，稱(chēng)為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（lymphokineactivatedkillercells,LAK）。第四章抗體制藥

第四章抗體制藥五、抗體融合蛋白（1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fcγ

（2）配基-Ig型嵌合蛋白，如IL-2-Ig，應(yīng)用較為成熟。（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3（4）受體-FV型融合蛋白（5）酶-抗體型融合蛋白：即為抗體酶，當(dāng)抗體酶和腫瘤結(jié)合后，給與前體藥物，在酶的轉(zhuǎn)化下成為有效藥物，可提高組織內(nèi)藥物濃度，提高藥效，降低毒副作用。第四章抗體制藥第四章抗體制藥抗體融合蛋白的構(gòu)建：將第一個(gè)蛋白的終止密碼子去除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的共表達(dá)?？贵w融合蛋白也需用到linker，一般3~5個(gè)氨基酸即可，如加入一段疏水性和一定伸展性的較長(zhǎng)肽段，可較好緩解兩種蛋白的相互干擾。抗體融合蛋白，可用原核或真核細(xì)胞表達(dá)。第四章抗體制藥原核表達(dá)：（1）分泌至菌體外表達(dá)，成為有活性的可溶性融合蛋白；（2）包含體形式表達(dá)，需溶解后重新折疊成有活性的蛋白質(zhì)。真核表達(dá)：能正確折疊和糖基化，但產(chǎn)量低。融合蛋白的純化，采用常規(guī)離子交換或親和層析的方法。第四章抗體制藥第四章抗體制藥第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程抗體發(fā)展的三個(gè)階段：（1）1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表，特點(diǎn)是用抗原免疫動(dòng)物可獲得多克隆抗體。（2）1975年Kohler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體為代表。（3）1994年Winter以基因工程及噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)制備噬菌體抗體庫(kù)，從而制備基因工程抗體。第四章抗體制藥一、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法1、獲取目的基因：提取mRNA—反轉(zhuǎn)錄—獲得抗體某一特定基因區(qū)段?？贵w基因的組合多為單鏈抗體，也有用linker組合成功能分子。2、抗體庫(kù)技術(shù)的載體：常用噬粒，具有噬菌體和質(zhì)粒的共同特點(diǎn)?？贵w蛋白和噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌體的表面，感染大腸桿菌，使目的克隆得以擴(kuò)增。第四章抗體制藥構(gòu)建噬菌體抗體載體時(shí)，在抗體基因與gⅢ基因之間引入了一個(gè)琥珀終止密碼子，抗體基因的重組子若轉(zhuǎn)化含有琥珀抑制基因XLBlue的宿主菌，抗體基因和gⅢ基因成為一個(gè)開(kāi)放閱讀框架，這時(shí)抗體就能借助噬菌體外殼蛋白而呈現(xiàn)在噬菌體表面。如將重組子轉(zhuǎn)化不帶有琥珀抑制基因的宿主菌，由于抗體基因與gⅢ基因之間的終止密碼子抑制了gⅢ基因的表達(dá)，便產(chǎn)生可溶性的Fab抗體。第四章抗體制藥3.淘篩：吸附—洗脫—擴(kuò)增

④再次感染大腸桿菌，使特異的噬菌體抗體淘篩。①噬菌體吸附靶抗原。②反復(fù)洗滌去除非特異性結(jié)合。③洗脫并收集與抗原結(jié)合的噬菌體。4.表達(dá)與鑒定目的克隆經(jīng)過(guò)鑒定后，導(dǎo)入感受態(tài)菌株，其產(chǎn)物用westernblot檢測(cè)。第四章抗體制藥二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)1、模擬天然全套抗體庫(kù)：建庫(kù)的外源基因?yàn)槿梭w多克隆細(xì)胞的總mRNA；使用的通用引物來(lái)自多個(gè)人體，具有人的種屬普遍性?？贵w的VH和VL隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性。2、避開(kāi)了人工免疫和雜交瘤技術(shù)3、可獲得高親和力的人源化抗體：在噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)中，VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程。第四章抗體制藥三、基因工程抗體的表達(dá)1、原核表達(dá)2、真核細(xì)胞表達(dá)3、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)第四章抗體制藥第五節(jié)抗體診斷試劑一、血清學(xué)鑒定用的抗體類(lèi)試劑（1）沙門(mén)氏菌屬診斷血清（2）志賀氏菌屬診斷血清（3）病原性大腸桿菌診斷血清診斷血清的制備：制備抗原O抗原，H抗原免疫動(dòng)物采血測(cè)定效價(jià)抗血清防腐劑包裝診斷血清的使用：玻片上做凝集反應(yīng)。第四章抗體制藥HBsAg的診斷血清：反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)紅細(xì)胞甲醛處理吸附抗HBs抗體抗原+抗體紅細(xì)胞凝集懷孕診斷試劑：妊娠試驗(yàn)是利用孕婦尿液及血清中含有HCG的免疫學(xué)特點(diǎn)，檢測(cè)體內(nèi)有無(wú)HCG的方法。目前臨床上應(yīng)用廣泛的早早孕診斷試紙，也稱(chēng)單克隆抗體早孕檢測(cè)，其原理是應(yīng)用膠體金標(biāo)記抗體，加入金標(biāo)記后，直接在試紙上顯示為紅色，方便快捷。第四章抗體制藥抗ABO血型系統(tǒng)血清：根據(jù)紅細(xì)胞膜上的A、B凝集原和血清內(nèi)抗A、抗B凝集素的不同，將紅細(xì)胞血型分為O、A、B、AB四型。第四章抗體制藥二、免疫標(biāo)記技術(shù)用抗體1、熒光抗體診斷試劑：用熒光色素，如FITC（黃綠色熒光）、羅丹明（亮橙紅色熒光）等標(biāo)記抗體，即為熒光抗體。（1）熒光抗體制備：①抗體的準(zhǔn)備：加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液（緩沖液容量為總量的1/10），使最后蛋白濃度為20mg/ml，置冰槽中電磁攪拌5～10min。②準(zhǔn)備熒光素：每毫克蛋白加0.01mg熒光素。③結(jié)合（標(biāo)記）：邊攪拌邊將熒光色素漸漸加入球蛋白溶液并繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右。④透析：結(jié)合完畢后，將球蛋白的溶液離心（2500r/min）20min，除去沉淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析（0～4℃）過(guò)夜。⑤過(guò)柱：取透析過(guò)夜的標(biāo)記物過(guò)G-25或G-50柱，分離游離熒光素，以PBS洗脫，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定。第四章抗體制藥（2）熒光抗體質(zhì)量鑒定：F/P比值的測(cè)定。F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求F/P的克分子比值為1～2。過(guò)高時(shí)，非特異性染色增強(qiáng)；過(guò)低時(shí)，熒光很弱，降低敏感性。第四章抗體制藥（3）免疫熒光測(cè)定方法：直接法和間接法。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)鑒定食管癌細(xì)胞表達(dá)MMP-2，胞漿中綠色熒光為MMP-2，細(xì)胞核紅色熒光為PI復(fù)染。第四章抗體制藥流式細(xì)胞儀檢測(cè)：待測(cè)標(biāo)本制備成單細(xì)胞懸液通過(guò)熒光染色后進(jìn)入充滿(mǎn)鞘液的流動(dòng)室，鞘液壓力與樣品流壓力是不同的，當(dāng)二者的壓力差異達(dá)到一定程度時(shí)，鞘液裹挾著樣品流中細(xì)胞排成單列逐個(gè)經(jīng)過(guò)激光聚焦區(qū)。如果我們將細(xì)胞中感興趣的部分特異性的標(biāo)上熒光染料，那麼這些染料將在細(xì)胞通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)時(shí)受激光發(fā)出特定波長(zhǎng)的熒光,通過(guò)一定波長(zhǎng)選擇通透性的濾色片,我們可將不同波長(zhǎng)的散射光、熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)，并送到不同的光電倍增管中，經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)換、放大，數(shù)字化處理，我們就可以在計(jì)算機(jī)直觀的統(tǒng)計(jì)染上各種熒光染料的細(xì)胞各自的百分率。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，我們可以利用FC同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多種不同特征；如果對(duì)具有某種特征的細(xì)胞有興趣，我們還可以利用流式的分選功能將其分選出來(lái)，以便進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。第四章抗體制藥

第四章抗體制藥2、免疫組化抗體診斷試劑（1）酶標(biāo)抗體：用酶標(biāo)記抗體，常用酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，底物為二氨基聯(lián)苯胺（DAB），兩者作用后生成棕褐色沉淀物。（2）酶標(biāo)抗體的制備：1）原理：HRP經(jīng)NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。第四章抗體制藥2）步驟：稱(chēng)取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中，加入0.2ml新配的0.1MNaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mMPH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過(guò)夜，再加20μl0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0～9.5；立即加入10mgIgG(抗體，或SPA5mg)在1ml0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)；加0.1ml新配的4mg／mlNaBH４液，混勻，再置4℃2小時(shí)，最后將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15MPH7.4PBS透析，4℃過(guò)夜。第四章抗體制藥腫瘤組織免疫組化圖片第四章抗體制藥3、ELISA法抗體診斷試劑ELISA法原理：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。第四章抗體制藥HBsAg酶標(biāo)診斷試劑HBeAg酶標(biāo)診斷試劑HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶標(biāo)診斷試劑測(cè)定HIV抗原的酶標(biāo)抗體試劑甲胎蛋白（AFP）酶標(biāo)抗體診斷試劑：診斷原發(fā)性肝癌癌胚抗原（CEA）的酶標(biāo)抗體試劑：診斷消化道惡性腫瘤改進(jìn)的酶標(biāo)抗體：抗體+生物素+酶標(biāo)的抗生物素，該系統(tǒng)可起放大作用，靈敏度更高。第四章抗體制藥4、放射免疫用抗體診斷試劑

氯胺T是對(duì)甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中逐漸分解形成次氯酸，是一種氧化劑。在偏堿溶液中（pH7.5），氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成二碘酪氨酸。第四章抗體制藥放免測(cè)定原理：當(dāng)標(biāo)記抗原、非標(biāo)記抗原和特異性抗體三者同時(shí)存在于一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)，由于標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對(duì)特異性抗體具有相同的結(jié)合力，因此兩者相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗體。由于標(biāo)記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物形成的量就隨著非標(biāo)記抗原的量而改變。非標(biāo)記抗原量增加，相應(yīng)地結(jié)合較多的抗體，從而抑制標(biāo)記抗原對(duì)抗體的結(jié)合，使標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物相應(yīng)減少，游離的標(biāo)記抗原相應(yīng)增加，亦即抗原抗體復(fù)合物中的放射性強(qiáng)度與受檢標(biāo)本中抗原的濃度呈反比。第四章抗體制藥

競(jìng)爭(zhēng)法放免測(cè)定原理第四章抗體制藥三、導(dǎo)向診斷藥物放射免疫顯像（radioimmunoimaging,RII）是將針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的特異性抗體用放射性核素標(biāo)記后注入人體，隨血液流達(dá)腫瘤組織，與腫瘤的相關(guān)抗原結(jié)合，從而使腫瘤組織局部放射性濃聚超過(guò)正常組織，然后用體外顯像技術(shù)獲得腫瘤的陽(yáng)性顯像圖。第四章抗體制藥1、放射免疫顯像的優(yōu)點(diǎn)：（1）在體內(nèi)定位腫瘤準(zhǔn)確度高（2）在體內(nèi)可檢出0.5cm大小的病灶，并可檢測(cè)肺、腦等部位的轉(zhuǎn)移灶（3）小分子抗體容易到達(dá)腫瘤部位（4）抗體在腫瘤部位，可保留6~9日（5）能觀察抗體在血中的半衰期和可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)第四章抗體制藥裸鼠乳腺癌組織CEA染色陽(yáng)性(免疫組化400×)注射131I標(biāo)記的2CEA單抗第四章抗體制藥第六節(jié)抗體治療藥物抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物包括：放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物毒素偶聯(lián)的抗體藥物第四章抗體制藥毒素偶聯(lián)的抗體藥物免疫毒素：毒素和抗體的交聯(lián)物，現(xiàn)在常用的免疫毒素為重組免疫毒素。毒素的來(lái)源：白喉毒素