DB3212T 2050-2022 鴨甲型肝炎病毒1型與3型熒光定量PCR鑒別診斷技術(shù)規(guī)范　　

CCS11.020B41DB3212泰州市地方標(biāo)準(zhǔn)2022-05-10發(fā)布2022-05-10實(shí)施IDB3212/T2050—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院提出。本文件由泰州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局歸口。本文件起草單位：江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院、國家水禽基因庫（江蘇）。本文件主要起草人：吳雙、吳植、朱善元、王健、孫國波、林夢(mèng)舟、紀(jì)榮超、謝軍、呂海玲。1DB3212/T2050—2022鴨甲型肝炎病毒1型與3型熒光定量PCR鑒別診斷技術(shù)規(guī)范本文件定了鴨甲型肝炎病毒1型與3型核酸檢測(cè)的反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR鑒別診斷的操作技術(shù)規(guī)范。本文件適用于泰州市所屬區(qū)域鴨甲型肝炎病毒1型與3型的檢測(cè)、疫情監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4儀器設(shè)備與試劑4.1儀器設(shè)備4.1.1組織勻漿儀。4.1.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（12000g以上）。4.1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（QuantStudio3Real-timePCRSystem）。4.1.5水浴鍋（室溫～100℃)。4.1.8超凈工作臺(tái)。4.2試劑4.2.1RNA提取試劑Trizol（分析純）。4.2.2氯仿（分析純）。4.2.3異丙醇（分析純）。4.2.4焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水（超純水）：配制方法見附錄A.1。4.2.570%乙醇（分析純）：配制方法見附錄A.2。5樣品采集與處理采集發(fā)病、瀕死或病死雛鴨的肝臟、脾臟、胰腺等新鮮組織樣品。與磷酸鹽緩沖液（PBS，配制方法見附錄A.3）按照體積比1:10的比例制成組織勻漿液；反復(fù)凍融3次，8000r/min～10000r/min條件下保存?zhèn)溆?，需托運(yùn)時(shí)應(yīng)確保冷藏或冰凍狀態(tài)運(yùn)輸。6引物設(shè)計(jì)2DB3212/T2050—20226.1DHAV-1標(biāo)準(zhǔn)品引物上游引物F：5'-AACACCTGTTTGGGAGGCAATG-3'，下游引物R：5'-GGGCAGGGAGTGGAAAGAAGAGGATTGTGCTACCATTGCTGGTG-3'，用于擴(kuò)增目的條帶429bp大小的基因片段。DHAV-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物F：5'-CAGGCCAACTCGACCAAT-3'，R：5'-GGCTTTTTGAGACCCATA-3'，探針為5'-FAM-CACATCAGAGGCAACTTTTGGCAGACT-BHQ1-3'。6.2DHAV-3標(biāo)準(zhǔn)品引物上游引物F：5'-GCACACTCTTATACAATGGACAATC-3'，下游引物R：5'-GTGTTGTGTAGGTTGGTGCAGGTAG-3'，5'-CCCATTTTATTCTGTTACACCTTTACG-3'，R：5'-TGTCCAAATATACAACCTGCTAAAAGTC-3'，探針為5'-VIC-CCCACACGACCCATGCCAGCAT-BHQ1-3'。上、下游引物和探針的使用濃度均為10pmol/μL。參考序列見附錄B。7病毒RNA提取7.1病毒RNA提取可以使用市售商品化RNA提取試劑盒或?qū)嶒?yàn)室操作方法。使用市售商品化RNA提取試劑盒為宜，按照使用說明提取RNA。7.2實(shí)驗(yàn)室操作方法7.2.1取250μL組織勻漿上清液加入1.5mLDEPC處理的滅菌指形管（配置方法見附錄A.4）中，加入480μLRNA提取試劑Trizol，混勻后室溫靜置5min～10min；7.2.2加入200μL氯仿，劇烈振蕩混勻，室溫放置2min～3min；7.2.34℃、12000r/min離心10min，取上清400μL，加入0.4mL的異丙醇，反復(fù)多次顛倒混勻，-20℃5min；7.2.44℃、12000r/min離心10min，棄上清（動(dòng)作迅速），加70%乙醇（DEPC水配置）600μL；7.2.54℃、12000r/min離心5min，傾去液體，瞬離，用微量移液器盡量吸凈液體，置超凈工作臺(tái)內(nèi)放置10min～15min。7.2.6沉淀干燥后加入20μLDEPC處理水，輕輕混勻溶解離心管壁上核酸RNA，提取的病毒全基因RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增或保存于-20℃冰箱備用。8病毒RNA反轉(zhuǎn)錄8.1病毒RNA反轉(zhuǎn)錄可以使用市售商品化RNA提取試劑盒或?qū)嶒?yàn)室操作方法。使用市售商品化反轉(zhuǎn)錄試劑盒為宜，按照使用說明反轉(zhuǎn)錄。8.2實(shí)驗(yàn)室操作方法1.5μL6nt隨機(jī)引物，2.5μLTaq聚合酶緩沖液，1μLdNTP（10mmol//Leach），0.5μLRNA酶抑制劑（20U/μL），0.5μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）。反應(yīng)條件為：42℃60min，70℃15min。9雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)9.1反應(yīng)體系與反應(yīng)條件雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：12.5μL2×PremixExTaq（ProbeqPCR），0.5μL50×ROXReferenceDye，DHAV-1與DHAV-3上下游引物（10μmol/L）各0.625μL，探針分別為0.75μL與0.5μL，1.0μLDNA模板，滅菌超純水7.25μL。反應(yīng)條件：95℃30s，95℃5s，60℃31s；40個(gè)循環(huán)。9.2試驗(yàn)對(duì)照3DB3212/T2050—2022每次檢測(cè)設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽性對(duì)照為接種了DHAV-I和DHAV-372h～96h的SPF鴨胚（或雞胚）尿囊液；陰性對(duì)照為未感染的健康SPF鴨胚（或雞胚）尿囊液；以不加模板的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。9.3結(jié)果判斷當(dāng)陽性對(duì)照樣品DHAV-I和DHAV-3均出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，空白對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效（參考附錄C.1）。若CT值小于36，且具有典型S型擴(kuò)增曲線則判定為檢測(cè)陽性；若CT值大于36，或無典型S型擴(kuò)增曲線則判定為檢測(cè)陰性。此外，臨床樣品檢測(cè)靈敏度參考附錄C.2，反應(yīng)的組間和組內(nèi)重復(fù)性數(shù)據(jù)參考附錄C.3。4DB3212/T2050—2022相關(guān)試劑的配制A.1焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水于超純水按0.1%加入DEPC，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌20min，冷卻備用。A.270%乙醇取無水乙醇70mL加入滅菌超純水25mL，定容至100mL，-20℃保存?zhèn)溆?。A.30.01M磷酸鹽緩沖液（PBS）NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.12H2O2.9gKH2PO40.2g將上述試劑溶于800mL滅菌雙蒸水中，定容至1000mL，121℃高壓滅菌30min，4℃保存?zhèn)溆谩.4DEPC處理指形管及微量移液器槍頭將待處理的指形管及微量移液器槍頭放入燒杯中，加適量的含0.1%DEPC的超純水，37℃振搖24h～48h，121℃高壓30min，高壓完畢后立即倒掉DEPC水，121℃再次高壓滅菌15min后，置超凈工作臺(tái)敞口干燥待用。5DB3212/T2050—2022參考基因序列B.1DHAV-1熒光定量PCR擴(kuò)增序列CAGGCCAACTCGACCAATTCCTGGCACATCAGAGGCAACTTTTGGCAGACTGTTTATGTGGACTCAATCAGGAAGTCTTTCAGTTTTTATGGGTCTCAAAAAGCCB.2DHAV-1標(biāo)準(zhǔn)品序列AACACCTGTTTGGGAGGCAATGGTTAGTTATGACTGTGCAACACGCTTCAACTGTGCAAGAGTTGGACCTCCAAGTTCCAGACAGAGGACATGCCTCTCTCATTCGGTTCTTTGCCTATTTTTCTGGAGAGATCATTCTTACCATTGTTAACAATGGCACTACACCAGCAATGGTAGCACACTCCTATTCTATGGATGACCTCAGTTCAGAGTATGCTGTTACAGCAATGGGAGGTGTGATGATTCCTGCTAACAGTGCCAAAAATATTTCTGTACCATTCTACTCTGTAACACCACTCAGGCCAACTCGACCAATTCCTGGCACATCAGGGGCAACTTTTGGCAGACTGTTCATGTGGACTCAATCAGGAAGTCTTTCAGTTTTTATGGGTCTCAAAAAGCCAGCTCTCTTCTTTCCACTCCCTGCCCB.3DHAV-3熒光定量PCR擴(kuò)增序列CCCATTTTATTCTGTTACACCTTTACGCCCCACACGACCCATGCCAGCATCTCAGGGGGGTGGCTTGACTTTTAGCAGGTTGTATATTTGGACAB.4DHAV-3標(biāo)準(zhǔn)品序列GCACACTCTTATACAATGGACAATCTCACTTCTGAATATGCTGTCACTGCCATGGGGGGTATTCTTATCCCAGCAAACTCTGCCAAGAATATTAATATCCCATTTTATTCTGTTACACCTTTACGCCCCACACGACCCATGCCAGCATCTCAGGGGGGTGGCTTGACTTTTAGCAGGTTGTATATTTGGACACAATCAGGAAGTGTTTCTGTTTTTATGGGCCTCCATAAGCCAGCTTTGTTTTTCCCACTACCTGCACCAACCTACACAACAC6DB3212/T2050—2022雙重TaqMan熒光定量PCR方法參考結(jié)果C.1該檢測(cè)方法結(jié)果成立條件應(yīng)用本研究建立的雙重TaqMan熒光定量PCR方法對(duì)DHAV-1、DHAV-3，無菌超純水（陰性對(duì)照空白對(duì)照，AIV、GPV、DRV、NDRV、MDRV、NDV、DTMUV、DEV、MDPV、DuCV等10種主要鴨病毒性疫病的DNA或cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，DHAV-1和DHAV-3應(yīng)出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，其它10種鴨常見病毒核酸、陰性對(duì)照和空白對(duì)照均為陰性擴(kuò)