免疫組化幻燈

免疫組化幻燈主要講述的內容概述免疫組化的概念和優(yōu)點。免疫組化染色前的準備?？贵w的標記如何降低非特異性染色。免疫組織化學方法免疫組化結果的判定以及染好切片的關鍵免疫組織化學的應用。免疫酶組織化學染色圖片舉例。免疫組織化學又稱免疫細胞化學，其主要原理是用熒光素、生物素或地高辛等標記的抗體（或抗原）對細胞或組織內的相應抗原（或抗體）進行定性、定位或定量檢測，經過組織化學的呈色反應之后，用顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。凡是能作抗原、半抗原的物質，如蛋白質、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受體及病原體等都可應用相應的特異性抗體，將其用免疫細胞化學手段檢出，并研究。概念

1.高度的特異性抗原抗體反應是特異性最強的反應之一，免疫細胞化學所用的抗體必須是特異性強的多價或單價抗體，具有高度的認別能力，在抗原識別上可達到單個氨基酸的水平，這是其它組織化學方法難以相比的。免疫細胞化學的突出優(yōu)點是：

2.敏感性高現代免疫細胞化學采用各種有效方法最大限度保存細胞和組織內待檢物質的抗原性，采用各種增敏方法，使用高度敏感的和高親和力的抗體，保證可檢出細胞內超微量的抗原分子，用顯微鏡和電子顯微鏡觀察結果，因此，它是在細胞、分子水平或基因水平的檢測技術。

3.方法步驟統一若掌握一種技術操作方法步驟，則一通百通。

4.形態(tài)、機能和代謝密切結合是一種集定性、定位和定量密切結合；形態(tài)、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。7、在腫瘤病理學的研究和診斷中的其他應用(3)熒光強度隨時間延長而慢慢減弱；凡不屬于特異性抗原抗體反應所呈現的染色。免疫酶組織化學消除非特異性染色的幾種方法如許多腫瘤對化療不敏感，是由于瘤細胞內多藥耐藥基因(multidrugresistantgene)編碼的酶的活性增加所致。(2)敏感性及特異性不夠理想；現代免疫細胞化學采用各種有效方法最大限度免疫酶組織化學染色圖片舉例。免疫細胞化學的突出優(yōu)點是：當免疫組化結果與HE切片診斷有矛盾時,以HE切片診斷為準。激素受體和各種生長因子對正常組織的功能調節(jié)是必不可少的，同時也可影響著腫瘤的生物學行為。避免染色過程中標本干枯等方法。在對宮頸癌、小細胞肺癌的研究中已證實，c-myc表達增加者存活期縮短。量檢測，經過組織化學的呈色反應之后，用顯微鏡、熒用常規(guī)病理組織學方法要在一個組織中認出單個轉移性腫瘤細胞或幾個細胞是不可能的，而采用免疫組化方法則十分有助于微小轉移灶的發(fā)現?？乖迯统Ｒ?guī)石蠟切片的標本一般均采用甲醛固定，甲醛固定的部分組織細胞免疫組化的敏感性明顯降低，主要原因為甲醛固定過程中形成的醛鍵以及甲醛固定導致的蛋白與蛋白之間的交聯，均會封閉部分抗原決定簇，同時甲醛的這種交聯作用會影響細胞膜的通透性，使抗體分子難于滲入細胞內，從而影響染色效果。

化學方法(酶消化方法)

胰蛋白酶(trypsin)消化方法酶濃度一般為0.05%~0.1%,

胃蛋白酶(pepsin〉消化方法0.4%胃蛋白酶鏈霉蛋白酶(poruse)消化方法濃度為0.1%。

物理方法

單純加熱方法;

高壓加熱方法;

微波方法微波方法將切片常規(guī)脫臘后水洗，放入盛有枸櫞酸緩沖液的容器中，置微波爐加熱沸騰，時間為5min×2次。加熱完畢，將切片缸在室溫下放置，使缸內溫度自然下降至40℃左右，蒸餾水洗，進入免疫組化染色?？贵w的標記為了使抗原-抗體可見，必須將抗體標記，利用標記物與其他物質的反應將陽性結果放大，并轉換成可見的熒光或呈現出顏色。免疫組化染色中比較成熟的標記物有：異硫氰酸熒光素、辣根過氧化物酶、鐵蛋白、膠體金、葡萄球菌A蛋白、生物素、放射形核素等。由于標記物和抗體結合，酶促反應的定位就間接地顯示抗原-抗體反應的定位。免疫組織化學染色中的非特異性著色凡不屬于特異性抗原抗體反應所呈現的染色。原因：組織方面：自發(fā)熒光、內源性過氧化物酶或堿性磷酸酶、內源性生物素等。試劑方面：抗體不純、標記酶或熒光不純或標記過量等。在滴加一抗前，采用非免疫動物血清封閉組織中的帶電集團，避免與第一抗體的非特異性結合。阻斷內源性酶。如3%的H2O2等。增加第一抗體的稀釋度調整孵育時間及反應溫度避免染色過程中標本干枯等方法。

免疫酶組織化學消除非特異性染色的幾種方法免疫組化染色方法(1)免疫熒光法(2)免疫酶標法(3)免疫膠體金法免疫熒光法的基本原理將已知的抗體分子標記上熒光素，再與相應的抗原起反應，形成的抗原抗體復合物因帶有熒光素，在熒光顯微鏡下可以觀察到發(fā)出熒光的免疫復合物結合部位，從而做出判斷。作為病理診斷，免疫熒光法具一些不足之處,如：(1)特異性抗體用量大；(2)敏感性及特異性不夠理想；(3)熒光強度隨時間延長而慢慢減弱；(4)需要昂貴的特殊顯微鏡。免疫酶組織化學方法

60年代學者Nakane等首創(chuàng)建立了酶標記抗體技術檢測組織中的抗原，免疫酶組織化學技術的特點：可用普通顯微鏡代替熒光顯微鏡；切片不易褪色，可長期保存；陽性細胞定位精確；組織結構清晰；可作免疫電鏡超微結構觀察等優(yōu)點。(三)免疫性疾病的輔助診斷為了使抗原-抗體可見，必須將抗體標記，利用標記物與其他物質的反應將陽性結果放大，并轉換成可見的熒光或呈現出顏色。腫瘤細胞增生是否活躍直接影響著臨床治療與預后。滴加生物素化的二抗；組織方面：自發(fā)熒光、內源性過氧化物酶或堿性磷酸酶、內源性生物素等。7、在腫瘤病理學的研究和診斷中的其他應用如對乳腺癌與激素受體關系的研究已有了較明確的結論，即雌激素受體陽性的乳腺癌患者預后優(yōu)于陰性者，而且陽性者對內分泌治療反應好、無瘤生存期延長。光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。免疫酶組織化學消除非特異性染色的幾種方法對癌基因(oncogenes)在腫瘤生物學中的價值已有大量的研究，用免疫組化的方法可對這些癌基因蛋白進行定位和定量的檢測，以探討其臨床意義。判斷一個腫瘤是否生長活躍方法較多，有核仁組成區(qū)嗜銀蛋白(AgNOR)的染色、3H-胸腺嘧啶攝入放射自顯影、流式細胞術(FCM)等，但實踐證明其中以免疫組化法對瘤細胞增生抗原進行定位定量最為簡便、可靠，主要是通過Ki-67和PCNA(prolifer-ationcellnuclearantigen)的單克隆抗體來實現的。常規(guī)石蠟切片的標本一般均采用甲醛固定，甲醛固定的部分組織細胞免疫組化的敏感性明顯降低，主要原因為甲醛固定過程中形成的醛鍵以及甲醛固定導致的蛋白與蛋白之間的交聯，均會封閉部分抗原決定簇，同時甲醛的這種交聯作用會影響細胞膜的通透性，使抗體分子難于滲入細胞內，從而影響染色效果。c-myc的過度表達則促進腫瘤的生長和發(fā)展，因而腫瘤的侵襲性增加。免疫組化染色中比較成熟的標記物有：異硫氰酸熒光素、辣根過氧化物酶、鐵蛋白、膠體金、葡萄球菌A蛋白、生物素、放射形核素等。穩(wěn)定性好，在～12范圍,60℃加熱15分鐘不失活標記抗體法不標記抗體法常用的免疫酶組織化學方法免疫酶組織化學常用的酶理想的標記酶的要求酶的活性高且穩(wěn)定終產物穩(wěn)定，不擴散，有良好的定位酶和抗體的結合不影響抗原和抗體的結合在組織中和體液中不存在內源性的酶及其底物應用最多的標記酶辣根過氧化物酶（HRP）穩(wěn)定性好，在～12范圍,60℃加熱15分鐘不失活穿透性強，溶解度大.底物為H2O2，DAB（3′，3-二氨基聯苯胺）為供氫體,反應式為：HRP.H2O2+DH2HRP+D+2H2O堿性磷酸酶（AP）ABC三步法(親和素-生物素-過氧化物酶連結法)

ABC法是利用親和素（卵白素）與生物素特有的高度親和力這一生物學性質,先將生物素與辣根過氧化酶（HRP）結合，形成生物素化HRP(B液)，然后與親和素(A液)按一定的比例混合，形成ABC復合物。用生物素化的二抗與一抗結合，再與ABC復合物結合，最后用底物顯色劑顯色。ABC復合物A液——親和素液B液——與生物素結合的過氧化物酶溶液組織方面：自發(fā)熒光、內源性過氧化物酶或堿性磷酸酶、內源性生物素等。物質，如蛋白質、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受體及病原體等都可應用相應的特異性抗體，將其用免疫細胞化學手段檢出，并研究。7、在腫瘤病理學的研究和診斷中的其他應用避免染色過程中標本干枯等方法。避免假陰性和假陽性的發(fā)生。(1)特異性抗體用量大；辣根過氧化物酶（HRP）(1)特異性抗體用量大；1%,

胃蛋白酶(pepsin〉消化方法0.ABC三步法(親和素-生物素-過氧化物酶連結法)物質，如蛋白質、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受體及病原體等都可應用相應的特異性抗體，將其用免疫細胞化學手段檢出，并研究。PSA陽性-前列腺癌轉移具有高度的認別能力，在抗原識別上可達到單個氨基(2)敏感性及特異性不夠理想；滴加ABC復合物；ABC復合物ABC法優(yōu)點：敏感性高，約為PAP法的8-40倍；特異性強，非特異性背景著色低；方法簡便，應用范圍廣。步驟：石蠟切片脫蠟至水；緩沖液洗；3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶;緩沖液洗；滴加非免疫動物血清20min步驟步驟

直接滴加第一抗體；

PBS沖洗；滴加生物素化的二抗；

PBS沖洗；

滴加ABC復合物；

PBS沖洗；

DAB顯色。

SP法或LSAB、SABC法(鏈親和素-過氧化物酶連結法)

用鏈親和素（SA）代替ABC復合物中的卵白素蛋白（親和素）即形成SP法。染色原理同ABC法。

LSAB法中由于采用鏈親和素，避免了與組織中內源性生物素結合的可能，所以背景染色低、放大效果高。其標記技術比PAP、ABC法更為簡便、敏感、特異，且價格較低而在我國逐漸普及。

IGS法(免疫金法)：

用金標記代替酶標記。

IGS的基本原理是先用特異性抗體與抗原反應，隨后用金標記的間接抗體或A蛋白再與特異性抗體結合，再用乳酸銀處理，銀顆粒沉積在金顆粒上，還原銀顯示為黑褐色。

免疫組化結果的判斷原則

每批染色都要有特異性陽性對照和陰性對照為基礎,才能對染色結果做判斷。

陽性表達必須在細胞和組織特定的抗原部位才能視為陽性。

陰性結果不能視為抗原不表達,即陰性結果無判斷意義;陽性結果有強弱、多少之分,

當免疫組化結果與HE切片診斷有矛盾時,以HE切片診斷為準。

應用“反證法,確保免疫組化在診斷病理中的準確性。

避免假陰性和假陽性的發(fā)生。免疫組織化學的應用H2O2+DH2HRP+D+2H2OABC三步法(親和素-生物素-過氧化物酶連結法)VEGF免疫組化實驗操作步驟加熱完畢，將切片缸在室溫下放置，使缸內溫度自然下降至40℃左右，蒸餾水洗，進入免疫組化染色。避免染色過程中標本干枯等方法。如對乳腺癌與激素受體關系的研究已有了較明確的結論，即雌激素受體陽性的乳腺癌患者預后優(yōu)于陰性者，而且陽性者對內分泌治療反應好、無瘤生存期延長。為了使抗原-抗體可見，必須將抗體標記，利用標記物與其他物質的反應將陽性結果放大，并轉換成可見的熒光或呈現出顏色。(2)敏感性及特異性不夠理想；化學方法(酶消化方法)免疫組化結果的判斷原則應用免疫組化方法，可以大大提高病理診斷的準確率，有利于疾病的臨床診治。當免疫組化結果與HE切片診斷有矛盾時,以HE切片診斷為準。c-myc的過度表達則促進腫瘤的生長和發(fā)展，因而腫瘤的侵襲性增加。陰性結果不能視為抗原不表達,即陰性結果無判斷意義;陽性結果有強弱、多少之分,當免疫組化結果與HE切片診斷有矛盾時,以HE切片診斷為準。(一)提高病理診斷的準確性病理診斷當屬堅信不疑的，但在實際工作中要做到100%是不可能的。采用免疫組化檢查后，部分疑難病例最后獲得正確診斷。應用免疫組化方法，可以大大提高病理診斷的準確率，有利于疾病的臨床診治。1、激素受體及生長因子的檢測在預后及治療方面的應用激素受體和各種生長因子對正常組織的功能調節(jié)是必不可少的，同時也可影響著腫瘤的生物學行為。應用免疫組化方法，可對腫瘤內各種激素受體與生長因子進行定位、定量分析，這已廣泛應用于腫瘤臨床工作。(二)在腫瘤病理學的研究和診斷中的應用如對乳腺癌與激素受體關系的研究已有了較明確的結論，即雌激素受體陽性的乳腺癌患者預后優(yōu)于陰性者，而且陽性者對內分泌治療反應好、無瘤生存期延長。相似的結果也見于子宮內膜癌和卵巢癌。2、癌基因蛋白表達的臨床及預后方面的研究應用對癌基因(oncogenes)在腫瘤生物學中的價值已有大量的研究，用免疫組化的方法可對這些癌基因蛋白進行定位和定量的檢測，以探討其臨床意義。雖然癌基因的種類繁多，但目前已有腫瘤臨床意義的卻十分有限，主要是c-erbB-2、c-myc、ras和p53。在乳腺癌的研究中發(fā)現表達cerbB-2的浸潤性乳腺癌患者預后差。惡性度高者陽性率高。在卵巢癌中陽性率為30%，而且提示，陽性表達的卵巢癌者預后要差。c-myc是作用于核內DNA的癌基因，可剌激DNA的合成。c-myc的過度表達則促進腫瘤的生長和發(fā)展，因而腫瘤的侵襲性增加。在對宮頸癌、小細胞肺癌的研究中已證實，c-myc表達增加者存活期縮短。p21是一種ras癌基因蛋白，己發(fā)現在肝細胞癌、大腸癌中表達增高，在卵巢癌亦有過度表達的報道。對于其預后意義則仍有一些不同的看法。3、對腫瘤細胞增生程度的評價腫瘤細胞增生是否活躍直接影響著臨床治療與預后。判斷一個腫瘤是否生長活躍方法較多，有核仁組成區(qū)嗜銀蛋白(AgNOR)的染色、3H-胸腺嘧啶攝入放射自顯影、流式細胞術(FCM)等，但實踐證明其中以免疫組化法對瘤細胞增生抗原進行定位定量最為簡便、可靠，主要是通過Ki-67和PCNA(prolifer-ationcellnuclearantigen)的單克隆抗體來實現的。4、發(fā)現微小轉移灶用常規(guī)病理組織學方法要在一個組織中認出單個轉移性腫瘤細胞或幾個細胞是不可能的，而采用免疫組化方法則十分有助于微小轉移灶的發(fā)現。5、在腫瘤分期上的意