化學(xué)品 細菌回復(fù)突變試驗方法 征求意見稿

4GB/T21786—XXXX化學(xué)品細菌回復(fù)突變試驗方法本文件規(guī)定了化學(xué)品回復(fù)突變試驗的范圍、術(shù)語和定義、試驗基本原則、試驗方法、試驗數(shù)據(jù)和報本文件適用于檢測化學(xué)品（有殺菌作用的除外）的致突變性。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列定義和術(shù)語適用于本文件。3.1回復(fù)突變試驗reversemutationtest在鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）或大腸桿菌（Escherichiacoli）中檢測需要氨基酸菌株的突變（分別為組氨酸和色氨酸），以產(chǎn)生一株不依賴外界提供氨基酸的菌株。3.2堿基對置換突變劑basepairsubstitutionmutagens能夠引起DNA堿基改變的物質(zhì)。在回復(fù)突變試驗中，這種改變可發(fā)生在細菌基因組的原發(fā)突變位點或第二個突變位點。3.3移碼突變劑frameshiftmutagens能夠引起DNA中一個或多個堿基對增加或缺失，從而改變RNA讀碼框的物質(zhì)。4試驗基本原則4.1細菌懸液分別在加入或不加入外源性代謝活化系統(tǒng)的條件下與受試物接觸。在平板摻入法中，將上述混合液與頂層瓊脂混合，再立即倒入基本培養(yǎng)基（底層瓊脂平板/最低營養(yǎng)瓊脂）上。在預(yù)孵育法中，先將細菌懸液與受試物混合進行預(yù)孵育，然后與頂層瓊脂混合，再立即倒入基本培養(yǎng)基上。上述平板培養(yǎng)2d～3d后，計數(shù)回復(fù)突變菌落數(shù)，并與溶劑對照組的自發(fā)回復(fù)菌落數(shù)進行比較。4.2細菌回復(fù)突變試驗有數(shù)種操作方法，其中最常用的是平板摻入法、預(yù)孵育法、振蕩培養(yǎng)法和懸浮培養(yǎng)法。還有用于檢測氣體或蒸汽的改良方法。5GB/T21786—XXXX4.3本文件所描述的主要是平板摻入法和預(yù)孵育法。這兩種方法在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下都能進行。有些化合物用預(yù)孵育法更有效，包括短鏈脂肪族亞硝胺、二價金屬、醛類、偶氮染料和重氮化合物、吡咯里西啶生物堿、烯丙基化合物和硝基化合物。已發(fā)現(xiàn)某些類別的化學(xué)品，用標(biāo)準(zhǔn)的方法并非總能檢測出陽性結(jié)果，如平板摻入法和預(yù)孵育法。這種情況應(yīng)視作“特例”，強烈建議采用替代方法進行檢測。文獻中，已用替代方法對下列“特例”進行了鑒定（同時提供了所用試驗程序的示例）?！疤乩币话惆ㄅ嫉玖虾椭氐衔?、氣體和揮發(fā)性化學(xué)物以及糖苷類。對標(biāo)準(zhǔn)方法的改動應(yīng)有科學(xué)依據(jù)。5試驗方法5.1試驗準(zhǔn)備5.1.1細菌5.1.1.1新鮮的細菌培養(yǎng)物應(yīng)培養(yǎng)至指數(shù)生長期晚期或穩(wěn)定期早期（濃度約為109個/ml）,不能使用穩(wěn)定期晚期的培養(yǎng)物。試驗中所用的培養(yǎng)物中的活菌滴度應(yīng)較高。活菌滴度可通過細菌生長曲線的歷史對照數(shù)據(jù)確定，或每次試驗時通過平板法測定活菌數(shù)量。5.1.1.2推薦的培養(yǎng)溫度為37℃。5.1.1.3至少應(yīng)使用5種菌株，包括4株鼠傷寒沙門氏菌（TA1535；TA1537或TA97a或TA97；TA98和TA100這些菌株在不同實驗室之間的檢測結(jié)果可靠且具有重復(fù)性。這4種菌株在初始回復(fù)突變位點有GC堿基對，已知它們可能無法檢測某些氧化型致突變物、交聯(lián)劑和肼類。檢測這些物質(zhì)應(yīng)選用在初始回復(fù)突變位點有AT堿基對的大腸桿菌WP2菌株或鼠傷寒沙門氏菌TA102菌株。因此，推薦的菌株組合方案如下：鼠傷寒沙門氏菌TA1515和鼠傷寒沙門氏菌TA1537或TA97或TA97a和鼠傷寒沙門氏菌TA98和鼠傷寒沙門氏菌TA100和大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）或鼠傷寒沙門氏菌TA102為檢測交聯(lián)誘變劑，最好選用鼠傷寒沙門氏菌TA102或一種擅長修復(fù)DNA的大腸桿菌，如大腸桿菌WP2或大腸桿菌WP2（pKM101）作為受試菌株之一。5.1.1.4應(yīng)按已建立的操作規(guī)程進行菌種的培養(yǎng)制備、標(biāo)記鑒別和保存。每次復(fù)蘇凍存菌種的培養(yǎng)制品時，均應(yīng)進行氨基酸需求試驗（鼠傷寒沙門氏菌需要組氨酸，大腸桿菌需要色氨酸）。同樣，還應(yīng)進行其它的表型鑒定，包括有無R因子質(zhì)粒[即TA98，TA100和TA97a或TA97，WP2uvrA和WP2uvrA（pKM101）菌株對氨芐青霉素的抗性，以及TA102菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素的抗性]和特征性突變的存在（如鼠傷寒沙門氏菌的rfa突變使其對結(jié)晶紫敏感，大腸桿菌的uvrA突變和鼠傷寒沙門氏菌的uvrB突變使其對紫外線敏感）。這些菌株會產(chǎn)生自發(fā)回變，通過平板計數(shù)獲得的自發(fā)回變數(shù)應(yīng)在實驗室歷史對照數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，最好在文獻報道的范圍內(nèi)。5.1.2培養(yǎng)基應(yīng)用適宜的基本培養(yǎng)基（含Vogel-Bonner基本培養(yǎng)基E和葡萄糖）和含有組氨酸和生物素或色氨酸的頂層瓊脂，以供細菌完成少量細胞分裂。5.1.3代謝活化6GB/T21786—XXXX細菌應(yīng)在有或無適量代謝活化系統(tǒng)的條件下與受試物接觸。最常用的活化系統(tǒng)是經(jīng)酶誘導(dǎo)劑處理的，從嚙齒類動物肝制備的加輔助因子的后線粒體組分（S9）。所用的酶誘導(dǎo)劑包括Aroclor1254或苯巴比妥和?-萘黃酮聯(lián)合處理。常用的后線粒體組分濃度范圍是S9混合液的5%～30%（體積分數(shù)）。應(yīng)根據(jù)受試物的類別選擇代謝活化系統(tǒng)及其應(yīng)用條件。在某些情況下，適用于使用一種以上濃度的S9。對于偶氮染料或重氮化合物，應(yīng)選擇還原性代謝活化系統(tǒng)。5.1.4受試物/準(zhǔn)備在對菌株進行處理前，固體受試物應(yīng)溶解或混懸于合適的溶劑或賦形劑中，如需要可適度稀釋。液體受試物可直接加入測定體系或在處理前適度稀釋。受試物應(yīng)新鮮制備，除非有資料證明其貯存的穩(wěn)定性。5.2試驗條件5.2.1溶劑/賦形劑溶劑/賦形劑不應(yīng)與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且對細菌的存活和S9的活性無影響。若選用的不是常用的溶劑或賦形劑，應(yīng)有資料提供適合的理由。建議在可能的情況下，首先考慮使用水性溶劑或賦形劑。如受試物對水不穩(wěn)定，應(yīng)選用不含水的有機溶劑。5.2.2染毒劑量5.2.2.1應(yīng)根據(jù)受試物對細菌的毒性和在配制的最終混合物中的溶解度確定受試物所用的最高濃度。建議先進行預(yù)實驗測定受試物的毒性和溶解度?？蓪⒒貜?fù)突變菌落數(shù)目減少、背景菌苔減少或消失，或處理后的細菌存活程度等作為細胞毒性的指征。代謝活化系統(tǒng)的存在可能改變受試物的毒性。在實際試驗條件下，最終混合物出現(xiàn)肉眼可見的沉淀即判斷為不溶。對無細胞毒性的可溶性受試物，建議最高試驗劑量為5mg/皿或5μL/皿。對無細胞毒性但溶解度達不到5mg/皿或5μL/皿的受試物，在最終處理混合物中應(yīng)有一個或多個不溶濃度。在低于5mg/皿或5μL/皿時即出現(xiàn)細胞毒性的受試物，最高劑量為出現(xiàn)細胞毒性的劑量。沉淀不應(yīng)影響結(jié)果計數(shù)。 5.2.2.2在開始試驗時，至少應(yīng)選用5個可供分析的試驗劑量，劑量間隔一般為半對數(shù)（例如10）。在研究劑量-反應(yīng)關(guān)系時，也可采用更小的劑量間隔。5.2.2.3如果受試物含有大量可能具有致突變作用的雜質(zhì)，試驗濃度可超過5mg/皿或5μL/皿。5.2.3對照5.2.3.1每次試驗均應(yīng)設(shè)置平行的陽性和陰性（溶劑或賦形劑）對照，且應(yīng)在有或無代謝活化系統(tǒng)的條件下分別設(shè)置。應(yīng)選擇能夠證明每次試驗有效性的陽性對照物劑量。5.2.3.2對于采用代謝活化系統(tǒng)的檢測，應(yīng)根據(jù)試驗菌株類型選擇適宜的陽性物。下列化學(xué)品是適合進行代謝活化試驗的陽性物：9,10-二甲基蒽9,10-Dimethylanthracene[CASno.781-43-1]7,12-二甲基苯蒽7,12-Dimethylbenzanthracene[CASno.57-97-6]剛果紅CongoRed[CASno.573-58-0]（用于還原代謝活化法）苯并[a]芘Benzo(a)pyrene[CASNno.50-32-8]環(huán)磷酰胺（一水合物）Cyclophosphamide（monohydrate）[CASno.50-18-0（CASno.6055-19-2）]7GB/T21786—XXXX2-氨基蒽2-Aminoanthracene[CASno.613-13-8]2-氨基蒽不能單獨作為評價S9混合物活性的指示劑，如果選用2-氨基蒽，對每批S9還應(yīng)另選一種需要微粒體酶代謝活化的致突變物證實其活性，如苯并[a]芘或二甲基苯蒽。5.2.3.3對不加代謝活化系統(tǒng)的試驗，各菌株特異性的陽性對照物見表1。表1各菌株特異性對照物表N-乙基-N-硝基-N-亞硝基胍N-Ethyl-N-nitrN-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍N-Methyl-N-n5.2.3.4也可使用其它適合的陽性物。如可能，可考慮使用化學(xué)類別相關(guān)的陽性對照物。5.2.3.5陰性對照在每次試驗時除在試驗培養(yǎng)基中只加入溶劑或賦形劑外，其余方面應(yīng)與處理組相同。另外，如果沒有歷史對照數(shù)據(jù)證明所用溶劑或賦形劑無毒性作用或致突變作用，還應(yīng)設(shè)空白對照組（不進行任何處理）。5.3試驗步驟5.3.1受試物處理5.3.1.1平板滲入法：不需代謝活化時，通常將0.05mL或0.1mL受試物溶液、0.1mL新鮮的細菌培養(yǎng)液（約含108個活細胞）和0.5mL滅菌緩沖液與2.0mL頂層瓊脂混合。如需代謝活化系統(tǒng)，通常將0.5mL含足量后線粒體組分（體積約占代謝活化混合液總量的5%～30%）的代謝活化混合物與細菌和受試物/受試溶液一起與頂層瓊脂（2.0mL）混合。將上述混合液充分混合后倒在最低營養(yǎng)瓊脂上。待頂層瓊脂凝固后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5.3.1.2預(yù)孵育法：將受試物/受試溶液與受試菌株（約含108個活細胞）和滅菌緩沖液或代謝活化系統(tǒng)（0.5mL）在30℃~37℃預(yù)孵育20min。再與頂層瓊脂混合，然后倒在最低營養(yǎng)瓊脂上。通常用0.05mL或0.1mL受試物/受試溶液、0.1mL菌液，0.5mLS9混合物或滅菌緩沖液，與2.0mL頂層瓊脂混合。在預(yù)孵育過程中，將試管放入搖床振蕩培養(yǎng)以便通氣。5.3.1.3為了充分評價結(jié)果的變異度，每個劑量水平應(yīng)做三個平行平板。如有科學(xué)的理由也可做兩個平行平板。偶爾丟失一個平板的數(shù)據(jù)并不一定使測試無效。5.3.1.4氣態(tài)或揮發(fā)性物質(zhì)應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆绞竭M行試驗，如在密封容器中進行。5.3.2培養(yǎng)將試驗中的所有平板置于37℃培養(yǎng)48h～72h。培養(yǎng)結(jié)束后，計數(shù)每個平板的回復(fù)突變菌落數(shù)。8GB/T21786—XXXX6試驗數(shù)據(jù)和報告6.1數(shù)據(jù)處理6.1.1應(yīng)列出每個平皿的回復(fù)突變菌落數(shù)。還應(yīng)記錄陰性對照（溶劑對照，有時還有空白對照）和陽性對照組各皿的回復(fù)突變菌落數(shù)。6.1.2應(yīng)列出受試物各組、陰性對照（溶劑對照/空白對照）和陽性對照每皿的回復(fù)突變菌落數(shù)、平均回復(fù)突變菌落數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。6.1.3對明確的陽性結(jié)果無需進行驗證試驗?？梢山Y(jié)果最好通過改進條件進一步試驗來明確。陰性結(jié)果需視具體情況而定。如認為陰性結(jié)果無需進行驗證試驗，應(yīng)說明理由。在隨后的試驗中應(yīng)改進試驗參數(shù)以擴大評價條件范圍，可改進的參數(shù)包括劑量間距、處理方法（平板摻入法或溶液預(yù)孵育等）和代謝活化條件。6.2結(jié)果評價和解釋6.2.1陽性結(jié)果判定有幾個標(biāo)準(zhǔn)。受試物各組回復(fù)突變菌落數(shù)在試驗范圍內(nèi)的增加呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，和/或至少有一個菌株在有或無代謝活化系統(tǒng)下，在一個或多個劑量下每皿回復(fù)突變菌落數(shù)出現(xiàn)可重復(fù)的增加。應(yīng)首先考慮結(jié)果的生物學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)方法可用于幫助評價試驗結(jié)果，但統(tǒng)計學(xué)顯著性不能作為陽性反應(yīng)判定的唯一因素。6.2.2不符合以上標(biāo)準(zhǔn)的受試物則被認為在本試驗中無致突變性。6.2.3雖然大多數(shù)試驗都能得出明確的陽性或陰性結(jié)果，但極少數(shù)試驗不能對受試物活性做出明確判斷。無論重復(fù)試驗多少次，結(jié)果仍不明確或可疑。6.2.4細菌回復(fù)突變試驗的陽性結(jié)果表明，受試物可引起鼠傷寒沙門氏菌和/或大腸桿菌的基因組發(fā)生堿基置換或移碼突變誘發(fā)的點突變。陰性結(jié)果表明在本試驗條件下，受試物不引起試驗菌株的突變。6.3試驗報告試驗報告應(yīng)包含以下信息：6.3.1受試物a)名稱和識別碼如CAS編號（如已知）；b)物理性質(zhì)和純度；c)與試驗實施相關(guān)的物理化學(xué)特性；d)受試物的穩(wěn)定性（如已知）。6.3.2溶劑/賦形劑a)選擇溶劑/賦形劑的理由；b)受試物在溶劑/賦形劑中的溶解度和穩(wěn)定性（如已知）。6.3.3細菌a)所用菌株；9GB/T21786—XXXXb)每次培養(yǎng)加入的細菌數(shù)；c)菌株特征。6.3.4試驗條件a)每皿加入受試物的量（mg/皿或μg/皿），劑量選擇的依據(jù)，每個劑量的平皿數(shù)；b)選用的培養(yǎng)基；c)代謝活化系統(tǒng)的類型和成分，包括判斷可接受的標(biāo)準(zhǔn)；d)處理過程。6.3.5結(jié)果a)