化學品 體外哺乳動物細胞基因突變試驗方法 征求意見稿

4GB/T21786—XXXX化學品體外哺乳動物細胞基因突變試驗方法本文件規(guī)定了化學品體外哺乳動物細胞基因突變試驗的范圍、術(shù)語和定義、試驗基本原則、試驗方法、試驗數(shù)據(jù)和報告。本文件適用于檢測體外哺乳動物細胞基因突變規(guī)范性引用文件。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語、定義和縮略語下列定義和術(shù)語適用于本文件。3.1突變mutagenic在基因或染色體結(jié)構(gòu)上的DNA堿基配對序列上發(fā)生遺傳改變。3.2正向突變forwardmutation從原型（野生型）轉(zhuǎn)變至突變型的基因突變，可引起酶活性和編碼蛋白的改變和丟失。3.3堿基對置換突變劑basepairsubstitutionmutagens能夠引起DNA中一個或幾個堿基對置換的物質(zhì)。3.4移碼突變劑frameshiftmutagens能夠引起DNA分子中單個或多個堿基對增加或缺失的物質(zhì)。3.5表型表達時間phenotypicexpressiontime新的突變細胞耗盡未改變的基因產(chǎn)物所需的時間。3.6突變頻率mutantfrequency所觀察到的突變細胞數(shù)與存活細胞數(shù)之比值。5GB/T21786—XXXX3.7相對總生長數(shù)relativetotalgrowth與陰性對照組細胞數(shù)相比，整個過程中所增加的細胞數(shù)，等于懸浮生長數(shù)乘以相對集落形成效率之積。3.8相對懸浮生長relativesuspensiongrowth與陰性對照組相比，整個表達期細胞增加的數(shù)量3.9細胞活性viability表達期結(jié)束后，接種在選擇性培養(yǎng)基中細胞形成集落的效力。3.10細胞存活率survival處理結(jié)束后，接種的處理細胞形成集落的效力，通常以與對照組細胞數(shù)的存活率比值表示。3.11克隆效率cloningefficiency細胞在低密度下生長，最后生成可以計數(shù)的集落的細胞的百分比。3.12有絲分裂重組mitoticrecombination在有絲分裂過程中，同源染色單體之間的重組可能導致DNA雙鏈斷裂或雜合性的喪失。3.13基因毒性genotoxic指所有類型的DNA或染色體損傷，包括DNA斷裂、加合、重排、突變、染色體畸變和非整倍體。并非所有類型的遺傳毒性效應都會導致基因突變或穩(wěn)定的染色體損傷。3.14細胞毒性cytotoxicity對于本指南而言，細胞毒性是指處理組與陰性對照的存活率比較顯著下降，說明受試物具有細胞毒3.15相對存活率relativesurvival（RS）RS是受試物細胞毒性的衡量指標。RS是指在受試物處理后的細胞克隆的效率(CE)，其與陰性對照克隆效率的百分比。注：受試物處理時引起的細胞死亡數(shù)要考慮。3.166GB/T21786—XXXXS9肝組分S9liverfractions應用9000g離心后的肝勻漿上清，即肝粗提物。3.17S9混合物S9mix肝臟S9組分和代謝酶活性所需輔因子的混合物。3.18溶劑對照solventcontrol單獨用于溶解化學藥品的對照組培養(yǎng)物。3.19未處理對照untreatedcontrol不接受處理(即不含試驗化學物和溶劑)，但與接受試驗化學物的處理培養(yǎng)物處理方式相同。4試驗原則4.1由于TK+/-突變?yōu)門K-/-細胞缺乏TK,突變體對嘧啶類似物三氟胸苷(TFT)細胞毒性效應產(chǎn)生抗性。而含TK豐富的細胞則對TFT敏感，從而引起細胞代謝抑制和細胞進一步分化。因此突變細胞能在TFT存在條件下迅速增長，而正常細胞由于含TK而無法生長增殖。同樣地，缺乏HPRT或XPRT的細胞分別因其對6-琉基鳥嘌呤(6-TG)和8-氮鳥嘌呤(8-AG)具有抗性可被挑選出來。如受試的是堿基類似物或與選擇劑在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物，則在進行任一哺乳動物細胞基因突變試驗時，應仔細考慮受試物的特性，判斷是否適合進行本試驗，例如，應研究受試樣品對突變細胞和非突變細胞可能存在的選擇性毒性。也就是說，在檢測與選擇劑結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物時，必須核實選擇系統(tǒng)／選擇劑特性。4.2在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下,懸浮或單層培養(yǎng)的細胞暴露于受試物一定時間(3-6小時）,然后將細胞傳代培養(yǎng),測定細胞毒性,并在選擇突變細胞前使其表型得到表達。細胞毒性一般通過檢測細胞處理后的相對集落形成效率(生存能力)或集落的相對總生長數(shù)。處理后的細胞在培養(yǎng)液中保持足夠時間后,根據(jù)所選細胞和突變位點的特性,使誘發(fā)的突變表型表達至臨近可觀察到的水平。突變率則通過在含選擇劑的培養(yǎng)基中接種已知數(shù)目的細胞檢測突變細胞數(shù),或在不含選擇劑的培養(yǎng)基中檢測集落形成效率(生存能力)。孵育適當時向后，計數(shù)細胞集落。根據(jù)選擇性培養(yǎng)液中奕變集落數(shù)和非選擇性培養(yǎng)液中集落數(shù)利用公式計算得出突變率。5試驗方法5.1試驗準備5.1.1細胞5.1.1.1本試驗有多種細胞類型可供選擇,包括L5178Y亞群、CHO、AS53、V79或TK6細胞。用多種于本試驗的細胞類型對化學性致突變物應具有明確的敏感性,高的集落形成效率以及穩(wěn)定的自發(fā)突變率。應檢測細胞是否被支原體感染,若已被感染則不能使用。5.1.1.2試驗設(shè)計時應預先確定敏感性和檢測能力(power)。所用細胞數(shù),培養(yǎng)皿/瓶數(shù)和所設(shè)受試物劑量組應能反應這些特定的參數(shù)。經(jīng)處理后仍存活的最小細胞數(shù)以及每一試驗階段所用的最小細胞數(shù)應根7GB/T21786—XXXX據(jù)自發(fā)突變率確定?？偟脑瓌t是所用細胞數(shù)至少是自發(fā)突變率倒數(shù)的10倍。但推薦應用的細胞數(shù)量是至少106個細胞。實驗室對所用的細胞體系應有合適的歷史數(shù)據(jù),以用于對試驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性進行評價。5.1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件本試驗宜選用適宜培養(yǎng)基和孵育條件(培養(yǎng)皿、溫度、CO3體積分數(shù)和濕度)。應根據(jù)試驗所用的選擇系統(tǒng)和細胞類型選擇適宜的培養(yǎng)基。特別重要的是所選的培養(yǎng)條件,應確保在表達期細胞呈最佳生長狀態(tài)且突變細胞和非突變細胞有形成集落的能力。5.1.3培養(yǎng)準備從菌種培養(yǎng)基得到的細胞經(jīng)繁殖后接種于培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)。需預先清除受試細胞中的已突變細胞。5.1.4代謝活化細胞株應在有或無外源性哺乳動物代謝活化系統(tǒng)的條件下與受試樣品接觸。最常用的活化系統(tǒng)是經(jīng)酶誘導劑處理的,從嚙齒類動物肝臟制備的加有輔助因子的線粒體組分(S9)。所用的酶誘導劑包括Aroclor1354或苯巴比妥和β-萘黃酮的聯(lián)合誘導S9通常用在培養(yǎng)基中應用的終體積分數(shù)范圍為1%-3%，但在最終測試培養(yǎng)基中可能增加到10%。應根據(jù)受試樣品的特點選擇代謝活化系統(tǒng)及其應用條件。在某些情況下,可能使用一個以上的S9濃度。隨著代謝活化系統(tǒng)的不斷發(fā)展,目前已構(gòu)建了含有能表達特殊活性酶的基因工程細胞系,可以為細胞提供內(nèi)源性代謝活化能力。但應按科學的方法選擇所用的細胞系(例如分析細胞色素P450同功酶與受試物代謝之間的相關(guān)性)。5.1.5受試物/準備固體受試樣品應該溶解或混懸于合適的溶劑或賦形劑中,在處理細胞前如需要可進行適度稀釋。液體受試樣品可直接加入測定體系或在處理前適度稀釋。應使用新鮮制備的受試物,否則應有資料證明溶液貯存是穩(wěn)定的。氣體或者揮發(fā)性試驗化學品應該根據(jù)標準步驟進行適當測試，如在密封的培養(yǎng)容器。除非已有數(shù)據(jù)證明受試物可以穩(wěn)定保存，否則試驗化學品應該在試驗前制備。5.2試驗條件5.2.1溶劑/賦形劑溶劑/賦形劑不應與受試樣品發(fā)生化學反應,且對細胞的存活和S9的活性無影響。若選用的不是常用的溶劑或賦形劑,應有資料支持其適用性。建議盡可能用水或二甲基亞砜作溶劑。一般有機溶劑不應超過1%(v/v)，水溶劑(鹽水或水)不應超過10%(v/v)。如果所用溶劑/賦形劑尚未確定(例如乙醇或丙酮)，則應有數(shù)據(jù)證明其與試驗化學品和試驗系統(tǒng)的相容性，以及在所用濃度下無遺傳毒性來支持其使用。在缺乏這些支持數(shù)據(jù)的情況下，添加未處理的對照以證明所選溶劑沒有產(chǎn)生有害或誘變效應。5.2.3接觸濃度5.2.3.1在確定最高濃度時應考慮受試物的細胞毒性,溶解度和pH值或滲透性的變化。5.2.3.2在正式試驗中，細胞的毒性需在有或無代謝活化系統(tǒng)存在的條件下分別測定,可用細胞完整性和生長程度作為指標,例如細胞集落形成效率(存活能力)或相對總生長數(shù)。在預試驗中先測定細胞毒性和溶解性有利于正式試驗的設(shè)計。8GB/T21786—XXXX5.2.3.3至少應設(shè)立4個受試物濃度（不包括陽性組和對照組）以滿足測試要求。每個濃度至少有兩次重復測試。每次測試的數(shù)據(jù)應該有單獨報告，但是在結(jié)果分析中可以放在一起進行分析。如有細胞毒性,濃度設(shè)計應涵蓋產(chǎn)生最大毒性到產(chǎn)生最小或不產(chǎn)生毒性的范圍。如最高濃度可產(chǎn)生細胞毒性,那么細胞存活能力(相對集落形成效率)或相對總生長數(shù)應達到10%～30%范圍內(nèi)(但不應低于10%)。如果有數(shù)據(jù)表明受試物毒性低或者沒有細胞毒性，不同濃度的梯度在3~3倍之間即可；最高濃度至少達到10mM,3mg/mLor3μL/mL，當測試化學品的成分不確定時，例如未知或可變成分的物質(zhì)、復雜反應產(chǎn)物或生物材料(即未知或可變成分的化學物質(zhì))、環(huán)境提取物等，最高濃度可能需要更高(例如5mg/mL)；在沒有足夠的細胞毒性的情況下，增加各組分的濃度。但應該注意的是，這些要求對人類藥物可能有所不同。5.2.3.4相對不溶的受試樣品應盡量使其在培養(yǎng)條件下達到溶解度的限值。應觀察細胞染毒時終處理液中不溶的證據(jù)。在處理開始和結(jié)束時評價其溶解度可獲得有價值的資料,因為在試驗體系中有細胞、S9和血清等成分存在,受試樣品的溶解度在染毒過程中可能發(fā)生改變。不溶現(xiàn)象可通過肉眼觀察。5.2.4對照5.2.4.1每次試驗均應在有和無代謝活化系統(tǒng)的條件下同時設(shè)置的陽性和陰性(溶劑或賦形劑)對照。在使用代謝活化系統(tǒng)時,選用的陽性物應是需要活化才具有致突變作用的間接致突變物。5.2.4.2可用作陽性對照的化學品有以下幾種,見表1。表1可用作陽性對照的化學品TK（小和大HprtTK（小和大No.50-18-0(6055-19-35.2.4.3也可以使用其他適合的陽性對照參比物。如某試驗室有5-溴3'-脫氧尿苷[CASNo.59-14-3]的歷史性數(shù)據(jù),則也可以將其作為陽性對照參比物。如可能,也可考慮使用與受試物在化學結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物作為陽性對照。5.2.4.4在每次試驗時,陰性對照除在試驗培養(yǎng)基中只加入溶劑或賦形劑外,其余處理應與各處理組相同。另外,如果沒有歷史數(shù)據(jù)證明所用溶劑或賦形劑無毒性作用或致突變作用,還應設(shè)不做任何處理的空白對照組。5.3試驗步驟9GB/T21786—XXXX5.3.1受試樣品處理5.3.1.1在有或無代謝活化系統(tǒng)存在的情況下,分別使增殖細胞與受試樣品接觸適當時間(通常3h～6h即有效)。接觸時間也可延長至一個或多個細胞周期。5.3.1.3在試驗的每個階段，用于每個試驗(對照和處理)培養(yǎng)的最小細胞數(shù)應基于自發(fā)突變頻率。一般原則是：在試驗的所有階段，處理和傳代的細胞，在每個培養(yǎng)瓶自發(fā)突變體不高于10。自發(fā)突變頻率在5~30×10-6之間。如果自發(fā)突變頻率為5×10-6，且自發(fā)突變數(shù)在10及以上時，可導致90%的細胞毒性(10%RS)，此時，細胞數(shù)至少30×106。此外，在突變選擇或表細胞培養(yǎng)時，細胞的數(shù)量不應低于300萬個。5.3.3存活能力、生存能力和突變率的檢測5.3.3.1在受試物染毒末期,細胞經(jīng)洗滌、培養(yǎng),以檢測存活能力,并使突變體的表型獲得表達。細胞毒性的檢測通常以染毒后開始測定的相對集落形成效率(存活能力)或相對總生長數(shù)來表示。5.3.3.3每個突變位點的新誘發(fā)突變體,其最佳表型表達需要經(jīng)過(有)最短時間(HPRT和XPRT位點突變需要至少7d～9d,TK至少3d)。細胞在含選擇劑和不含選擇劑的培養(yǎng)液中生長,以分別測定突變體數(shù)目和集落形成效率。生存能力的檢測(用于計算突變效率)可以從表達期結(jié)束時開始,通過檢測接種在非選擇性培養(yǎng)基中的細胞來實施。5.3.3.3如果受試物在L5178YTK+/-試驗中為陽性,至少應測定一個受試樣品濃度(最高的陽性濃度)以及陰性和陽性對照中的集落大小。如受試樣品在L5178YTK+/-試驗結(jié)果為陰性,應測定陰性和陽性對照的集落大小。6試驗數(shù)據(jù)和報告6.1結(jié)果的處理6.1.1數(shù)據(jù)應包括處理組和對照組的細胞毒性和生存能力,集落計數(shù)和突變率。如L5178YTK+/-試驗結(jié)果為陽性,應分別計數(shù)至少一個受試樣品濃度(最高陽性濃度)以及陰性和陽性對照的大集落和小集落數(shù)。在TK+-試驗中,集落計數(shù)標準為正常生長集落(大集落)和慢生長集落(小集落)。小集落的成因是突變細胞受到嚴重的遺傳損傷,導致倍增期延長,細胞數(shù)量增加緩慢,典型的此類損傷范圍包括從整個基因的缺失至細胞核內(nèi)可見的典型染色體畸變。小的突變集落的誘發(fā)與化學品誘發(fā)顯著的染色體畸變有關(guān)。損傷較輕的突變細胞生長速率與親代細胞相似，可形成較大的集落。6.1.2應提供存活能力(相對集落形成效率)或相對總的生長率數(shù)據(jù)。突變率可以用存活細胞數(shù)中突變細胞數(shù)所占比例來表示。6.1.3應提供每次培養(yǎng)的試驗數(shù)據(jù)。此外,所有數(shù)據(jù)應以表格形式列出。6.1.4對明確的陽性結(jié)果無需進行驗證試驗。意義不明確的結(jié)果最好通過改進試驗條件進一步試驗來澄清。陰性結(jié)果需視具體情況決定。如認為陰性結(jié)果無需進行驗證試驗,應提供依據(jù)。對可疑或陰性結(jié)果,在以后的試驗中應改進試驗參數(shù)以擴大試驗條件范圍,可改進的參數(shù)包括濃度間隔、代謝活化條件等。落大小。在使用TK6細胞株的TK+/-試驗中,也應測定集落大小。6.2結(jié)果評價和解釋6.2.1陽性結(jié)果判定有多個標準。如有劑量反應關(guān)系,或突變率增加,且結(jié)果可重復。應首先考慮結(jié)果的生物學意義。統(tǒng)計學方法可用于幫助試驗結(jié)果評價,但統(tǒng)計學意義不能作為陽性反應判定的唯一因素。GB/T21786—XXXX6.2.3不符合以上標準的受試樣品則被認為在本試驗體系中無致突變性。6.2.3盡管大多數(shù)試驗都能給出明確的陽性或陰性的結(jié)果,但也不排除極少數(shù)情況不能對受試物活性做出明確判斷,例如,無論重復試驗多少次,結(jié)果仍模校兩可或可疑。6.2.4體外哺乳動物細胞基因突變試驗陽性結(jié)果,表明受試樣品可引起所用哺乳動物細胞基因突變。有可重復的濃度-反應關(guān)系意義較大。陰性結(jié)果表明在本試驗條件下,受試樣品不引起所用哺乳動物細胞的基因突變。6.3試驗報告試驗報告應包括以下信息:6.3.1樣品a)名稱和識別碼如CAS編號(如已知);b)物理性質(zhì)和純度;c)與試驗實施相關(guān)的物理化學特性;d)受試樣品穩(wěn)定性。e)多組分物質(zhì)、uvb及混合物6.3.2賦形劑a)選擇溶劑/賦形劑的理由;b)最終培養(yǎng)基中溶劑/賦形劑的百分比。6.3.3細跑a)細胞類型和來源;b)細胞培養(yǎng)皿/瓶數(shù)量;c)細胞傳代的次數(shù)(如適用);d)細胞培養(yǎng)的維護方法(如適用);e)沒有支原體的證據(jù)。e)核型特征/或染色體模式數(shù)f)細胞倍增時間6.3.4試驗條件a)細胞濃度和細胞培養(yǎng)數(shù)量選擇的理由,包括細胞毒性數(shù)據(jù)和溶解度限值等(如可能);b)培養(yǎng)基成分、CO2濃度、體積分數(shù);c)受試樣品濃度;d)所加入的賦形劑和受試樣品的體積;e)孵育溫度;f)孵育時間;g)處理持續(xù)的時間;h)細胞處理時的密度;i)代謝活化系統(tǒng)的類型和成分,包括可接受的標準（S9來源、S9混合料的制備方法、S9混合料和S9在最終培養(yǎng)基中的濃度、S9的質(zhì)量控制）;GB/T21786—XXXXj)陽性和陰性對照;k)表達期長短(包括細胞接種數(shù),傳代和接種程序及所加培養(yǎng)液,如適用);1)選擇劑及其濃度特征:m)測試可接受性的標準;n)計數(shù)存活細胞和突變細胞的方法;o)集落大小和類型認定的定義(包括所謂小集落和大集落的標準,如適用)。p)考慮研究為肯定、否定或者存疑的標準6.3.5結(jié)果a)細胞毒性和其他觀察到的結(jié)局;b)沉淀現(xiàn)象和測定時間;c)受試樣品接觸過程中的pH值和滲透性數(shù)據(jù)(如可確定);d)集落大小(至少包括陰性和陽性對照組的數(shù)據(jù));e)實驗室具備檢測L5178YTK+/-體系小突變集落能力的說明(如適用);f)劑量-反應關(guān)系(如有);g)統(tǒng)計學分析(適用與單次或多次重復數(shù)據(jù))，p值，如果有；h)同期的陰性(溶劑/賦形劑)和陽性對照數(shù)據(jù);i)同時陰性和陽性對照數(shù)據(jù)（濃度和溶劑）j)突變率。6.3.6結(jié)果討論6.3.7結(jié)論6.3.8注：歷史對照數(shù)據(jù)實驗室應建立:-本實驗室陽性對照范圍和95%可信區(qū)間-本實驗室陰性(未處理，溶劑)對照范圍和95%可信區(qū)間。當首次獲得陰性對照范圍的數(shù)據(jù)，相應的陰性對照應與發(fā)表的對照數(shù)據(jù)一致。隨著陰性對照的數(shù)據(jù)越來越多，理想的陰性對照應在該對照的均數(shù)95%控制限以內(nèi)。開始建立實驗室的歷史陰性對照數(shù)據(jù)庫時，應至少有10次實驗的數(shù)據(jù)，相同實驗條件下進行的至少30次實驗為更好。實驗室應使用質(zhì)量控制方法，例如控制圖(例如c圖或x條形圖[i])，以識別其陽性和陰性對照數(shù)據(jù)的變異，并表明該方法在其實驗室是“可控”。陰性對照數(shù)據(jù)應包括單個或兩個陽性物處理后的突變頻率。相應實驗時，陰性對照最好在實驗室歷史陰性對照數(shù)據(jù)的95%范圍內(nèi)。如果陰性數(shù)據(jù)不在95%的控制線，這些陽性數(shù)據(jù)要想應用，其條件