化學(xué)品 慢性毒性與致癌性聯(lián)合試驗(yàn)方法 征求意見稿

1GB/T21608-xxxx化學(xué)品慢性毒性與致癌性聯(lián)合試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了嚙齒類動(dòng)物慢性毒性與致癌性聯(lián)合試驗(yàn)的范圍、試驗(yàn)基本原則、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)報(bào)告。本文件適用于化學(xué)品的慢性毒性與致癌性聯(lián)合試驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3試驗(yàn)基本原則在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大部分生命期間內(nèi)以一定方式長期接觸受試物，觀察動(dòng)物的中毒癥狀，并進(jìn)行生化指部位及發(fā)生時(shí)間，評價(jià)受試物的潛在致癌性。4試驗(yàn)方法4.1經(jīng)口染毒對試驗(yàn)受試物的基本要求4.1.1受試物為固體或液體等；4.1.2受試物化學(xué)識別性特征；4.1.3受試物的純度(雜質(zhì)和含量)；4.1.4受試物溶解度；4.1.5受試物穩(wěn)定性(包括在與飼料、飲水混合后的制備物中的穩(wěn)定性)；4.1.6水解與pH值的關(guān)系；4.1.7形成復(fù)合體的能力；4.1.8熔點(diǎn)/沸點(diǎn)。4.2吸入染毒試驗(yàn)對受試物的基本要求4.2.1氣體、揮發(fā)性物質(zhì)或氣溶膠/顆粒物；4.2.2受試物化學(xué)識別性特征；4.2.3受試物純度及雜質(zhì)；4.2.4液體受試物:飽和蒸氣壓,沸點(diǎn)；4.2.5氣溶膠/顆粒物受試物:顆粒大小,形狀和分散度；4.2.6受試物閃點(diǎn)；4.2.7受試物爆炸性。4.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境2GB/T21788-xxxx4.3.1動(dòng)物的選擇動(dòng)物品系的選擇應(yīng)有根據(jù)。在前期所進(jìn)行的試驗(yàn)所提供的有關(guān)急性、亞急性、亞慢性與毒代動(dòng)力學(xué)資料可為選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物(種屬和品系)提供有力的依據(jù)。與其他實(shí)驗(yàn)指南所討論的一樣,小鼠和大鼠是評價(jià)受試物潛在致癌性應(yīng)用最為廣泛的動(dòng)物,而大鼠和犬在慢性毒性試驗(yàn)中使用最多。應(yīng)采用實(shí)驗(yàn)室常用的年輕、健康的成年動(dòng)物。慢性毒性合并致癌性試驗(yàn)應(yīng)優(yōu)先選用與初期短階段實(shí)驗(yàn)相同品系和來源的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。雌性動(dòng)物應(yīng)未曾生育和妊娠。在慢性毒性/致癌結(jié)合評價(jià)試驗(yàn)中常規(guī)應(yīng)選用大鼠,但也不排除使用其他動(dòng)物。原則上,所選動(dòng)物種屬和品系對受試物的致癌作用和毒性作用應(yīng)很敏感,但其腫瘤自發(fā)背景不應(yīng)太高而影響對致癌作用進(jìn)行有意義的評價(jià)4.3.2飼養(yǎng)環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、飼料和飲水為了得到有意義的試驗(yàn)結(jié)果，必須嚴(yán)格控制飼養(yǎng)環(huán)境和動(dòng)物管理操作技術(shù)。除嚴(yán)格控制外，對動(dòng)物的操作管理和觀察要有監(jiān)視設(shè)備，以減少出入動(dòng)物室的頻率。飼養(yǎng)室環(huán)境條件、試驗(yàn)期間發(fā)生疾病、對動(dòng)物應(yīng)用藥物治療、飼料中的雜質(zhì)、空氣、水、墊料的質(zhì)量以及對動(dòng)物操作的熟練程度等因素都會(huì)對動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果有明顯的影響。應(yīng)該避免在一個(gè)飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)不同種屬的動(dòng)物。為了防止染毒受試物造成相互暴露的交叉,一個(gè)飼養(yǎng)室內(nèi)僅能飼養(yǎng)接觸一種受試物的動(dòng)物。對照動(dòng)物應(yīng)飼養(yǎng)在試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)室內(nèi),如飼養(yǎng)在別的地方,會(huì)給資料的評價(jià)帶來額外的問題。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)單籠飼養(yǎng)，或同性別小組同籠。單籠飼養(yǎng)僅在具充分合理性的情況下才作考慮?；\具應(yīng)合理安排，將籠具布局的影響降至最小。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的室溫應(yīng)為22～26℃。40%～70%。采用人工照明，12h光照，12h黑暗。使用常規(guī)試驗(yàn)飼料，自由飲水。飼料應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的所有營養(yǎng)要求，可能影響試驗(yàn)結(jié)果的飼料中污染物包括（但不限于）殺蟲劑殘留、持久性有機(jī)污染物、植物雌激素、重金屬和霉菌毒素應(yīng)越低越好。飼料營養(yǎng)成分和污染物水平應(yīng)定期分析，至少應(yīng)在試驗(yàn)開始時(shí)及更換飼料批次時(shí)分析，分析信息應(yīng)包含在最終報(bào)告中。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水的分析信息亦需提供。當(dāng)受試物通過喂飼進(jìn)行染毒時(shí)，選擇飼料時(shí)既要確保其與受試物適當(dāng)?shù)幕旌?，又要符合?shí)驗(yàn)動(dòng)物的營養(yǎng)要求。動(dòng)物準(zhǔn)備應(yīng)采用之前未經(jīng)試驗(yàn)且適應(yīng)試驗(yàn)條件至少7d以上的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。對大鼠來說，動(dòng)物應(yīng)在斷奶和適應(yīng)期后盡快開始染毒，最好在8周齡之前。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)標(biāo)明品系、來源、性別、體重和年齡。在試驗(yàn)開始時(shí)，每性別動(dòng)物的體重差異應(yīng)不超過同性別所有動(dòng)物平均體重±20%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)隨機(jī)分為對照組和劑量組，每性別各組動(dòng)物的平均體重應(yīng)物顯著性差異。若出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，如有可能應(yīng)重復(fù)隨機(jī)化步驟。每只動(dòng)物應(yīng)分配以唯一的標(biāo)識號，通過紋刺、微芯片植入或其他合適方法對標(biāo)識號進(jìn)行永久標(biāo)記。如果嚙齒動(dòng)物飼養(yǎng)在無特殊致病生物的環(huán)境（SPF）中，那么，控制試驗(yàn)期間的患傳染病和寄生蟲就較容易。長期試驗(yàn)中作用的墊料應(yīng)消毒。動(dòng)物飼養(yǎng)室應(yīng)安靜，通風(fēng)條件良好，有可控制的照明、溫度及濕度。動(dòng)物應(yīng)該在環(huán)境適應(yīng)一定時(shí)間后再開始試驗(yàn)。應(yīng)該避免在一個(gè)飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)不同種屬的動(dòng)物。為了防止染毒受試物造成相互暴露的交叉，一個(gè)飼養(yǎng)室內(nèi)僅能飼養(yǎng)接觸一種受試物的動(dòng)物。對照動(dòng)物應(yīng)飼養(yǎng)在試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)室內(nèi)，如飼養(yǎng)在別的地方，會(huì)給資料的評價(jià)帶來額外的問題。試驗(yàn)籠、籠架和其他設(shè)備必須擺放有序和易于定期清洗，應(yīng)避免使用消毒劑和農(nóng)藥，特別是動(dòng)物有可能接觸的地方，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸這些有生物活性的物質(zhì)會(huì)對試驗(yàn)結(jié)果造成影響。詳細(xì)的動(dòng)物飼養(yǎng)的操作和管理可在科學(xué)文獻(xiàn)、動(dòng)物福利期刊和良好的實(shí)驗(yàn)室（GLP）的文件中查找到。動(dòng)物飼料應(yīng)能滿足所選擇動(dòng)物種屬的營養(yǎng)需求，不應(yīng)含可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的雜質(zhì)。因?yàn)轱暳现械?GB/T21788-xxxx污染物和各種營養(yǎng)素的水平會(huì)改變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理過程。應(yīng)讓嚙齒類動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。對喂飼器內(nèi)剩余的飼料每周至少要更新替換一次。目前，主要有三種類型的飼料:常規(guī)飼料（標(biāo)準(zhǔn)飼料）、綜合性飼料和各種任意配制的飼料。其中，前兩種飼料被廣泛的用于致癌性動(dòng)物試驗(yàn)中。不論選擇哪種類型的飼料，供應(yīng)者必須定期檢測基礎(chǔ)飼料中的營養(yǎng)成分與雜質(zhì)含量。最好能知道動(dòng)物這樣的飲食方式對代謝、動(dòng)物的壽命及腫瘤的發(fā)展的影響。當(dāng)受試物本身是一種營養(yǎng)類物質(zhì)，如工業(yè)制造的蛋白或淀粉、單細(xì)胞蛋白、輻照食物等，應(yīng)特別注意飼料的配方，因?yàn)檫@些產(chǎn)品加入飼料的水平可高達(dá)飼料的20%~60%（如改良的淀粉與未改良的比較、單細(xì)胞蛋白與大豆比較），從而損害了相應(yīng)的營養(yǎng)物（素）。對通用的已知會(huì)影響致癌的飲食成分（如抗氧化劑、不飽和脂肪酸和硒）應(yīng)不會(huì)達(dá)到干擾致癌作用的濃度。幾種常見對致癌作用評價(jià)可能造成潛在影響的飲食污染物應(yīng)進(jìn)行檢測以確定其在飼料中是否存在，這些包括農(nóng)藥的殘留、有機(jī)氯、多環(huán)芳烴、雌激素、重金屬、亞硝胺和霉菌毒素。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期對基礎(chǔ)飼料測定營養(yǎng)素、意外的污染物，包括致癌物質(zhì)。應(yīng)保留這些檢查結(jié)果并在每個(gè)受試物的最終報(bào)告中列出。如果受試物摻于水和飲食中時(shí)，受試物必需在其配制物中均勻穩(wěn)定。在開始慢性實(shí)驗(yàn)之前測定受試物的在配制物中的穩(wěn)定性和均勻性可用來估計(jì)飼料制備和抽樣監(jiān)測的次數(shù)。對飼料進(jìn)行消毒時(shí)應(yīng)該知道消毒操作對受試物和營養(yǎng)成分的影響，根據(jù)影響的程度，應(yīng)對飼料的營養(yǎng)水平進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。使用化學(xué)消毒劑時(shí)，要知道化學(xué)消毒劑（如氧化乙烯）對生物測試的影響。致癌試驗(yàn)期間研究者必須知道對所用飲水中有無潛在污染物。雖然達(dá)到人體飲用水標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飲水的水質(zhì)已能滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求，研究者也應(yīng)該有對所供動(dòng)物飲水中成分的檢測報(bào)告資料。4.3.3動(dòng)物的性別和開始試驗(yàn)的時(shí)間應(yīng)當(dāng)使用兩種性別的動(dòng)物。進(jìn)行慢性毒性和致癌性試驗(yàn)通常是使用斷乳的動(dòng)物作為起始試驗(yàn)的年齡。這樣的操作程序能使動(dòng)物在生命的絕大部分時(shí)間內(nèi)接觸受試物的對誘發(fā)的腫瘤作用充分發(fā)揮出來。對嚙齒類動(dòng)物應(yīng)當(dāng)在斷乳后和檢疫后盡早開始染毒,可能時(shí)最好在6周齡前就開始試驗(yàn)。4.3.4動(dòng)物數(shù)量為了保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的要求,試驗(yàn)要征求統(tǒng)計(jì)學(xué)家的意見。動(dòng)物進(jìn)入試驗(yàn)組還是對照組應(yīng)嚴(yán)格按照隨機(jī)操作程序進(jìn)行。所設(shè)計(jì)的動(dòng)物數(shù)要保證試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組都有足夠的動(dòng)物數(shù)滿足進(jìn)行生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的要求。致癌性試驗(yàn)部分，以大鼠為例，每個(gè)劑量組和并行對照組每性別應(yīng)包含至少50只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，各劑量組可設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)，以提高關(guān)鍵估算的統(tǒng)計(jì)功效例如，低劑量組動(dòng)物數(shù)超過50只，以評價(jià)低劑量組致癌性潛力。但應(yīng)注意的是，各組動(dòng)物數(shù)的適度增加，對統(tǒng)計(jì)功效的提高作用則相對很小。慢性毒性試驗(yàn)部分，各劑量組和并行對照組每性別應(yīng)包含至少10只大鼠，需注意的是該動(dòng)物數(shù)量低于慢性毒性試驗(yàn)的要求，理由是致癌性試驗(yàn)部分的大量動(dòng)物亦可提供有效數(shù)據(jù)。當(dāng)采用小鼠進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，慢性毒性試驗(yàn)部分各劑量組可適當(dāng)增加動(dòng)物數(shù)以滿足血液學(xué)檢查要求。4.4劑量水平和受試物濃度4.4.1為了達(dá)到致癌危險(xiǎn)性評價(jià)的目的，至少要設(shè)三個(gè)劑量組的染毒組及一個(gè)同步對照組。最高劑量組可以引起輕微的毒性反應(yīng),如血清酶水平改變或體重減輕等(減少程度低于10%,但不能明顯縮短動(dòng)物壽命(因腫瘤引起的除外).對混于飼料內(nèi)染毒,最高的濃度不能超過5%.最低劑量組在不影響動(dòng)物的4GB/T21788-xxxx正常生長、發(fā)育和壽命的同時(shí),不能引起任何毒性反應(yīng),其劑量一般不應(yīng)低于上一高劑量的10%.中劑量應(yīng)介于高劑量和低劑量之間,也可參照受試物的毒代動(dòng)力學(xué)資料進(jìn)行設(shè)計(jì)。4.4.2進(jìn)行慢性毒性毒理學(xué)評價(jià)時(shí),應(yīng)增設(shè)高劑量附加染毒組和該附加組的同步對照。高劑量附加染毒組的染毒劑量應(yīng)能產(chǎn)生明顯毒性,用于顯示受試物的毒理學(xué)作用特征。4.4.3限量試驗(yàn)：對于慢性毒性試驗(yàn)部分，若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在1000mg/（kg·d）或更高劑量未出現(xiàn)不良反應(yīng)，試驗(yàn)不必再設(shè)其他劑量組。這依據(jù)于前期試驗(yàn)提供的信息，并參考相關(guān)結(jié)構(gòu)物的試驗(yàn)結(jié)果。除非人類暴露情況提示應(yīng)采用更高劑量，1000mg/（kg體重·d）可作為限量試驗(yàn)的劑量。4.4.4劑量水平和劑量水平間距的選擇應(yīng)能建立劑量-反應(yīng)關(guān)系，并取決于受試物作用模式、NOAEL及試驗(yàn)的其他預(yù)期結(jié)果，例如在最低劑量水平的基準(zhǔn)劑量。設(shè)置最低劑量水平應(yīng)考慮的因素包括預(yù)期的劑量-反應(yīng)曲線斜率、新陳代謝中出現(xiàn)重要改變的劑量、毒作用模式的預(yù)期臨界值及預(yù)期的低劑量外推出發(fā)點(diǎn)。當(dāng)進(jìn)行致癌性慢性毒性聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)，主要試驗(yàn)?zāi)康氖谦@得有關(guān)致癌性風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的信息，而慢性毒性相關(guān)信息通常為次要目標(biāo)，在選擇劑量水平及劑量間距時(shí)應(yīng)考慮這一點(diǎn)。4.4.5應(yīng)依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮褪茉囄镄再|(zhì)而選擇劑量間距，通常2~4倍間距能帶來良好的試驗(yàn)效果，增設(shè)的第四劑量組常傾向于采用更大的間距（超過6～10倍）。一般情況下應(yīng)避免使用10倍以上間距。4.4.6劑量選擇需考慮的要點(diǎn)：a）在劑量-反應(yīng)中已知或可疑的非線性特征及拐點(diǎn)；b）毒代動(dòng)力學(xué)，內(nèi)劑量和外劑量之間代謝誘導(dǎo)、飽和及非線性特征的劑量范圍；c）前驅(qū)損傷（precursorlesions）,效應(yīng)標(biāo)志，關(guān)鍵的基礎(chǔ)生物學(xué)過程的指標(biāo);d）作用方式的關(guān)鍵（或可疑）點(diǎn)，例如在細(xì)胞毒性增高、內(nèi)分泌紊亂、體內(nèi)平衡機(jī)制混亂開始時(shí)的劑量;e）劑量-反應(yīng)曲線需進(jìn)行抗差分析（robustestimation）的區(qū)域，如預(yù)期的基準(zhǔn)劑量區(qū)域或可疑臨界值區(qū)域；f）考慮預(yù)期的人類暴露水平，尤其是選擇中、低劑量時(shí)。4.4.7溶劑選擇如有必要，受試物可溶解或懸浮于合適的溶劑中。溶劑或其他添加劑的以下特性需作適當(dāng)考慮對受試物的吸收、分布、代謝及滯留作用可能改變受試物毒性特征的化學(xué)作用對動(dòng)物進(jìn)食量、飲水量及營養(yǎng)狀態(tài)的影響。如果可能的話，首選水溶（懸）液，其次考慮油溶（乳）液，如玉米油，之后是其他可能的溶劑。對于水之外的溶劑，其毒理學(xué)特性應(yīng)為已知。應(yīng)檢測受試物在染毒介質(zhì)中的穩(wěn)定性和均一性。4.4.8受試物濃度對于喂飼和飲水染毒，保證正常營養(yǎng)及飲水平衡不受受試物干擾極為重要。長期喂飼毒性試驗(yàn)中，飼料中受試物的濃度通常不應(yīng)超過5%，以避免營養(yǎng)失衡。飼料中濃度（mg/kg飼料或質(zhì)量分?jǐn)?shù)10-6或依據(jù)動(dòng)物體重的劑量水平[mg/（kg·d）]皆可采用。交替使用時(shí)需作說明。4.5對照組必須設(shè)立對照組。對照組動(dòng)物除了不接觸受試物外其他條件均與染毒組相同。在某些特殊的情況下,例如吸入染毒以及或經(jīng)口染毒受試物的制備應(yīng)用了生物活性不明的乳化劑等賦形劑,應(yīng)增設(shè)賦形劑對照組。4.6染毒途徑經(jīng)口、經(jīng)皮和經(jīng)呼吸道吸人是三種主要染毒途徑。選擇何種途徑要根據(jù)受試樣品的理化特性和人體有代表性的接觸方式。5GB/T21788-xxxx4.6.1經(jīng)口染毒已有證據(jù)表明受試物能經(jīng)胃腸道吸收,首選經(jīng)口染毒。經(jīng)口染毒可以有多種方式混于飼料或溶于飲水中,或采取灌胃飼養(yǎng)的方式。如果受試物混于飼料或溶于飲水中染毒,動(dòng)物接觸受試物是連續(xù)性的。喂養(yǎng)染毒時(shí)混于飼料中受試物的濃度不能高于5%(受試物如為營養(yǎng)素除外).灌胃染毒時(shí),理想的染毒次數(shù)是每周灌胃7次。雖然每周染毒5次,在未染毒的期間內(nèi)可能存在恢復(fù)過程和毒性減退消失,可對試驗(yàn)結(jié)果造成影響和評價(jià)上的困難。然而,從實(shí)際上的考慮每周染毒5次也可以接受。4.6.2經(jīng)皮染毒采用皮膚染毒,可能用于模擬人類經(jīng)皮接觸受試物是主要途徑,或用于誘發(fā)皮膚損傷的動(dòng)物模型。染毒時(shí),理想的染毒次數(shù)是每周7次。每周染毒5次,雖然可對試驗(yàn)結(jié)果造成影響和評價(jià)上的困難,然而,從實(shí)際上的考慮每周染毒5次也可以接受。本方法中不包括誘發(fā)皮膚腫瘤的特殊性試驗(yàn)的內(nèi)容。4.6.3吸入染毒比起其他兩種染毒方法,吸入染毒在技術(shù)上更加復(fù)雜,本標(biāo)準(zhǔn)提供了詳細(xì)吸入染毒試驗(yàn)操作技術(shù)。在某些特定的情況下,推薦使用氣管注入的方式染毒。這種長期毒性試驗(yàn),按工業(yè)職業(yè)性接觸方式是每天吸入6h,每周5d(稱間歇染毒方式);按生活環(huán)境接觸方式為每天染毒22h~24h(留下約1h給動(dòng)物喂食和清理染毒裝置),每周吸入7d(稱連續(xù)染毒方式).染毒時(shí)間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物吸入接觸恒定的受試物濃度。動(dòng)物在這兩種染毒方式中的主要差別是間歇染毒的動(dòng)物每天在接觸后有17h~18h的恢復(fù)時(shí)間。如果是在每周染毒5d,在周末恢復(fù)時(shí)間更長。采用哪種染毒方式要根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮托枰M的人類的接觸方式。但必須考慮到某些技術(shù)上會(huì)存在很大困難。如連續(xù)染毒方式雖然能夠模仿環(huán)境接觸情況,但染毒期間除了需提供飲水和飼料外,需要更為復(fù)雜的氣溶膠(可靠度)、蒸汽的發(fā)生裝置和濃度監(jiān)測技術(shù)等。4.6.3.1染毒裝置推薦使用動(dòng)式口一鼻吸入染毒裝置,其對空氣條件的要求與柜式基本形同。使用染毒柜時(shí),其設(shè)計(jì)必須保證換氣次數(shù)能達(dá)到12次/h~15次/h;柜內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)在19%左右;柜內(nèi)受試樣品濃度均勻;對照組與吸入染毒組動(dòng)物用柜的結(jié)構(gòu)和設(shè)計(jì)要保證動(dòng)物接觸條件除了吸入或不吸入受試物外,其他應(yīng)完全相同;應(yīng)保證籠內(nèi)動(dòng)物不太擠迫,使動(dòng)物能最大限度接觸受試物;通用的規(guī)則是柜體內(nèi)空氣環(huán)境的穩(wěn)定,要求動(dòng)物所占體積不超過染毒柜容積的5%;染毒柜應(yīng)保持一定的負(fù)壓,以防受試物擴(kuò)散到周圍環(huán)境中。4.6.3.2染毒環(huán)境條件的測定下面的這些測定應(yīng)特別小心,避免柜內(nèi)氣體體積分?jǐn)?shù)的大幅波動(dòng)或者染毒條件的改變:4.6.3.2.1氣流流速測定:通過染毒裝置的氣流流速應(yīng)采用連續(xù)監(jiān)控。4.6.3.2.2染毒柜內(nèi)氣體受試物濃度測定:在染毒過程中,受試物的實(shí)際濃度應(yīng)盡可能的保持不變。4.6.3.2.2溫度和濕度測定:對嚙齒類動(dòng)物,其染毒環(huán)境溫度應(yīng)控制在22℃士3℃,相對濕度,除了水性氣溶膠外,應(yīng)最好保持在30%～70%。最好兩個(gè)指標(biāo)被同時(shí)連續(xù)監(jiān)控。4.6.3.2.4粒度測定:對受試物在柜內(nèi)空氣中呈液體或固體氣溶膠形式的粒度分布進(jìn)行測定；氣溶膠的顆粒大小應(yīng)該是所使用動(dòng)物的可呼吸性的空氣動(dòng)力學(xué)直徑大小。應(yīng)采集染毒柜中處于動(dòng)物的呼吸帶的氣體樣品,所采集的樣品的粒徑的分布是能代表性動(dòng)物實(shí)際接觸的。所有懸浮的氣溶膠,即便是大部分粒子是非可呼吸性的樣品粒度應(yīng)采用不同粒徑的數(shù)量或質(zhì)量所占比例來表示。為保證染毒期間氣溶膠的穩(wěn)6GB/T21788-xxxx定,應(yīng)在氣溶膠發(fā)生器的研發(fā)階段盡量多采集樣品進(jìn)行粒度大小分析、標(biāo)定；在動(dòng)物暴露期常在需要證明動(dòng)物所接觸的粒子分布恒定一致時(shí)才進(jìn)行分析測定。4.7染毒周期經(jīng)口染毒時(shí)，動(dòng)物每日染毒（每周7d通常染毒期為12個(gè)月（慢性毒性部分）或24個(gè)月（致癌性部分）。任何其他染毒計(jì)劃，如每周染毒5d，應(yīng)說明理由。在經(jīng)皮染毒時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般每天染毒6h，每周7d，染毒期一般為12個(gè)月（慢性毒性部分）或24個(gè)月（致癌性部分）。進(jìn)行吸入染毒時(shí)，每天染毒6h，每周7d，若有適當(dāng)理由亦可每周5d，染毒期一般為12個(gè)月（慢性毒性部分）或24個(gè)月（致癌性部分）。如果使用大鼠以外的嚙齒類動(dòng)物口鼻暴露，可調(diào)整最大染毒時(shí)間以減少動(dòng)物痛苦，染毒時(shí)間低于每天6h的需說明理由。當(dāng)采用灌胃染毒時(shí)，使用胃管或合適的插管，每天同一時(shí)間灌胃。一般情況下，每天灌胃1次，若受試物有局部刺激性，可每天分次染毒以保證染毒劑量（每天2次）。最大灌胃體積依實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重而定，在保持可行性的前提下盡量降低，大鼠通常不超過1ml/100g體重。通過調(diào)整濃度縮小灌胃體積差異，以保證所有劑量組有相同的灌胃量。有潛在腐蝕性或刺激性的受試物則例外，需做稀釋以避免嚴(yán)重的局部反應(yīng)。應(yīng)避免采用可能腐蝕或刺激消化道的受試物濃度。慢性毒性試驗(yàn)部分的試驗(yàn)期染毒期通常為12個(gè)月，亦可根據(jù)特殊管理要求或特別的機(jī)制研究目的縮短或延長，但應(yīng)說明理由，尤其是縮短染毒期的原因。所有劑量組動(dòng)物按設(shè)計(jì)時(shí)間處死并進(jìn)行慢性毒性及非腫瘤病理學(xué)評價(jià)。為觀察化學(xué)品所致毒理學(xué)改變之可逆性而設(shè)的附加組動(dòng)物，應(yīng)在停止染毒后再觀察至少4周，恢復(fù)期長度不應(yīng)超過全部試驗(yàn)期的1/3。嚙齒類動(dòng)物致癌性試驗(yàn)部分的染毒期通常為24個(gè)月，包括了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的主要生命周期。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系的生命周期，可以采用更短或更長的試驗(yàn)期，對于特定的小鼠品系，如AKRJ、C3H/J和C57BL/6J系，18個(gè)月的試驗(yàn)期可能更適宜。以下提供一些關(guān)于試驗(yàn)期、試驗(yàn)終止和存活動(dòng)物的指導(dǎo)。a）當(dāng)?shù)蛣┝拷M或?qū)φ战M動(dòng)物的存活數(shù)不足25%時(shí)，應(yīng)考慮終止試驗(yàn)。b）僅有高劑量組動(dòng)物因毒性作用過早死亡時(shí)，不應(yīng)終止試驗(yàn)。c）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活情況應(yīng)按性別分別考慮。d）當(dāng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)已不足以進(jìn)行有效的統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)時(shí)，應(yīng)考慮終止試驗(yàn)。4.8觀察4.8.1臨床觀察4.8.1.1每天應(yīng)檢查所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的發(fā)病情況和死亡情況，早晚各檢查1次。盡量在每日相同時(shí)間進(jìn)行至少1次普通臨床觀察。在動(dòng)物灌胃后預(yù)期反應(yīng)的高峰時(shí)段，最好每天增加一次對特定毒理學(xué)特征的檢查。在出現(xiàn)毒性作用時(shí)還應(yīng)增加必要的每天觀察次數(shù)以便死亡動(dòng)物及時(shí)解剖、冷藏。對質(zhì)弱或?yàn)l死動(dòng)物及時(shí)或隔離、或處死、冷藏,并解剖檢查,盡量減少因疾病、自溶或被同類所食造成的動(dòng)物損失。除此之外仔細(xì)記錄毒性作用的開始時(shí)間及其轉(zhuǎn)歸。應(yīng)記錄任何毒性作用包括疑似癌變的發(fā)生和發(fā)展情況。4.8.1.2在第一次染毒前、染毒1周后和染毒后每個(gè)月應(yīng)對所有動(dòng)物進(jìn)行至少1次詳細(xì)的臨床觀察。觀察方案應(yīng)獨(dú)立于劑量組，并盡可能減小不同觀察者間的人為差異。動(dòng)物最好在相同時(shí)間于籠外進(jìn)行觀察，結(jié)果應(yīng)仔細(xì)記錄，最好使用試驗(yàn)室制定的記分系統(tǒng)。應(yīng)盡可能保持觀察條件的一致性。記錄體征應(yīng)包括（但不限于）皮膚、毛發(fā)、眼、黏膜、分泌物、排泄物和自主活動(dòng)（如流淚、立毛、瞳孔大小及不正常的呼吸狀態(tài)）的變化，步態(tài)、姿勢、抓取反應(yīng)、震顫、痙攣、行為怪癖（如過度舔毛、反復(fù)繞圈）、異常表現(xiàn)（如自殘、倒走）也應(yīng)做記錄。7GB/T21788-xxxx4.8.1.3在第1次染毒前，使用眼科鏡或其他合適設(shè)備對所有動(dòng)物進(jìn)行眼科檢查。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，最好能檢查所有動(dòng)物，否則應(yīng)至少檢查最高劑量組和對照組。若發(fā)現(xiàn)與染毒相關(guān)的眼部改變，則應(yīng)對所有動(dòng)物進(jìn)行檢查。若有結(jié)構(gòu)分析或其他證據(jù)支持眼部毒性，則應(yīng)增加眼科檢查次數(shù)。4.8.1.4若前期反復(fù)染毒28d和/或90d毒性試驗(yàn)顯示出有神經(jīng)毒性作用，對不同刺激的感覺反應(yīng)性（如聽覺、視覺和本體感受刺激），可選擇在試驗(yàn)開始前、開始第3個(gè)月后、第12個(gè)月后或更長時(shí)間進(jìn)行握力評定和肌肉活動(dòng)評分法測試。亦可采用其他替代測試。4.8.1.5若前期反復(fù)染毒28d和/或90d毒性試驗(yàn)顯示出有免疫毒性作用，可于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)選擇做相應(yīng)檢查。4.8.2體重所有動(dòng)物在染毒前均稱量體重。在試驗(yàn)前13周，每周至少稱重1次13周以后，至少每月稱重14.8.3動(dòng)物攝食量食物消耗量在試驗(yàn)前13周應(yīng)每周至少稱量1次，其后每月至少稱量1次。但是在動(dòng)物健康狀況或體重異常時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加測定次數(shù)。若受試物通過飲水染毒，飲水消耗量在試驗(yàn)前13周應(yīng)每周至少記量1次，其后每月至少記量1次。當(dāng)動(dòng)物飲水行為發(fā)生改變時(shí)，應(yīng)考慮記錄飲水消耗量。4.9血液檢查進(jìn)行嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在第3個(gè)月、第6個(gè)月和第12個(gè)月（每組雌雄各10只）進(jìn)行血液學(xué)檢查，若試驗(yàn)期超過12個(gè)月，則試驗(yàn)結(jié)束時(shí)亦應(yīng)檢查。進(jìn)行小鼠試驗(yàn)時(shí)，需增設(shè)附加組以滿足血液學(xué)檢查要求。對于非嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)，采血樣本數(shù)量減少（例如每組每性別4只狗），中期采血和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采血同以上嚙齒類動(dòng)物。無論是否嚙齒類動(dòng)物，若在前期進(jìn)行的類似劑量的90d試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)血液學(xué)指標(biāo)的變化，則在第3個(gè)月時(shí)不必進(jìn)行血液學(xué)檢查。應(yīng)檢查下列血液學(xué)指標(biāo)總白細(xì)胞及分類計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度、血細(xì)胞容量（紅細(xì)胞壓積）、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、前凝血酶原時(shí)間和活性局部促凝血酶原激酶時(shí)間。根據(jù)受試物的毒性，亦可進(jìn)行海因茨小體、紅細(xì)胞形態(tài)異?；蚋哞F血紅蛋白等其他血液學(xué)參數(shù)的檢查?？傊?，根據(jù)受試物的試驗(yàn)觀察和/或預(yù)期作用可靈活掌握。若化學(xué)品對造血系統(tǒng)產(chǎn)生影響，常規(guī)檢查之外的網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓細(xì)胞學(xué)檢查也應(yīng)進(jìn)行。4.10尿液檢查所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（每組雌雄各10只）均應(yīng)進(jìn)行尿液分析，檢查時(shí)間間隔與血液學(xué)和臨床生化檢查相同。若在前期進(jìn)行的類似劑量的90d試驗(yàn)中尿液分析未發(fā)現(xiàn)異常，則在第3個(gè)月時(shí)不必進(jìn)行尿檢。臨床病理專家推薦的檢查指標(biāo)包括外觀、體積、滲透壓、比重、pH、總蛋白和葡萄糖。其他的檢查項(xiàng)目包括酮體、尿氮素原、膽紅素和潛隱血。如有必要，可進(jìn)一步增加檢測指標(biāo)以觀察可能的作用。一般情況下，在進(jìn)行犬試驗(yàn)前需要確定血液學(xué)及臨床生化的基礎(chǔ)測量值，嚙齒類動(dòng)物則不必，但當(dāng)歷史性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)不足時(shí)，應(yīng)考慮補(bǔ)充該數(shù)據(jù)。4.11臨床化學(xué)檢查按照與血液學(xué)檢查相同的時(shí)間間隔，對所有動(dòng)物（每組雌/雄各10只）進(jìn)行臨床生化測定以檢查組織（特別是腎臟和肝臟）內(nèi)的主要毒性作用。對于小鼠，可能需增設(shè)附加組動(dòng)物以滿足臨床生化測定8GB/T21788-xxxx的要求。對于非嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)，采血樣本數(shù)量減少（例如每組每性別4只狗），中期采樣時(shí)間和試驗(yàn)結(jié)束采樣與嚙齒類動(dòng)物相同。若在前期進(jìn)行的類似劑量的90d試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)臨床生化指標(biāo)的變化，則在第3個(gè)月時(shí)不必進(jìn)行血液學(xué)檢查。動(dòng)物在采血之前最好禁食過夜。從采集到的血液分離血漿,檢查指標(biāo)包括：葡萄糖、尿素（尿素氮）、肌酐、總蛋白、白蛋白、鈣、鈉、鉀、膽固醇，至少2項(xiàng)肝細(xì)胞學(xué)檢查（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶、總膽酸）、至少2項(xiàng)肝膽檢查（堿性磷酸酶、γ-谷酰轉(zhuǎn)移酶、5'-核苷酸酶、總膽紅素、總膽酸）?？筛鶕?jù)受試物毒性特點(diǎn)選擇其他適合的臨床生化檢測指標(biāo)?？傊?，根據(jù)受試物的試驗(yàn)觀察和/或預(yù)期的作用可靈活掌握。4.12病理學(xué)檢查病理學(xué)檢查(包括大體解剖與組織病理學(xué)檢查兩部分)是慢性毒性/致癌結(jié)合試驗(yàn)的重要部分,必須給予充分的重視。應(yīng)全面檢查、詳細(xì)描述和報(bào)告，包括結(jié)果的診斷。4.12.1大體解剖所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均應(yīng)進(jìn)行全面細(xì)致的大體解剖，檢查對象包括動(dòng)物體表、孔竅、顱腔、胸腔、腹腔及其內(nèi)容物。對中期處死和附加組動(dòng)物可制定特別的關(guān)鍵性檢測，如神經(jīng)毒理學(xué)或免疫毒理學(xué)，這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可不進(jìn)行剖檢及后續(xù)步驟。動(dòng)物處死前應(yīng)收集血液以進(jìn)行血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)(differentialbloodcounts)。所有肉眼可見病損、腫瘤或懷疑是腫瘤性改變的組織或臟器皆應(yīng)保存。應(yīng)試圖找到大體解剖與病理組織之間的聯(lián)系。哨兵動(dòng)物是否剖檢則由試驗(yàn)負(fù)責(zé)人視具體情況而定。4.12.2器官稱重除上述不作解剖的動(dòng)物之外，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦、心臟、腎、肝、脾、腎上腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮和甲狀腺（固定后與甲狀旁腺一起稱重）應(yīng)在剝離附著組織后及時(shí)稱重，以免干燥。4.12.3表1所列臟器與組織皆應(yīng)固定保存，以進(jìn)行組織學(xué)及組織病理學(xué)檢查（方括號內(nèi)的組織為可選）。如果進(jìn)行了其他臨床檢查,在進(jìn)行組織病理學(xué)檢查之前,應(yīng)對從這些檢查所得到的信息進(jìn)行認(rèn)真分析,可能會(huì)給病理學(xué)家提示許多有意義的指導(dǎo)。表1需進(jìn)行病理學(xué)檢查的器官心胰牙腎肺9GB/T21788-xxxx4.12.4成對的器官，如腎和腎上腺等，雙側(cè)均應(yīng)保存。根據(jù)臨床觀察及其他發(fā)現(xiàn)的證據(jù)，可相應(yīng)增加檢查的組織。根據(jù)受試物已知特性而考慮到的可能靶器官，也應(yīng)保留。4.12.5所有肉眼可見的腫瘤和其他病損都應(yīng)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。此外,建議進(jìn)行下列檢查:a）對在固定保存的器官和組織中組織病理學(xué)檢查見到的所有損傷、異常的詳細(xì)描述,包括：試驗(yàn)期間死亡動(dòng)物及處死動(dòng)物的所有組織所有肉眼可見異常的組織（包括腫瘤高劑量組和對照組的所有組織。b）由接觸受試物引起的、或可能是受試物引起的、在較低的劑量組也檢查出來的組織和器官異常;c）試驗(yàn)結(jié)果提供動(dòng)物正常壽命有明顯改變的證據(jù),或出現(xiàn)可能改變毒性效應(yīng)的誘導(dǎo)作用,下一個(gè)劑量組也應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的上述檢查;d）在所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系正常的損傷發(fā)生率(在相同試驗(yàn)條件下,如歷史對照數(shù)據(jù))對正確的評價(jià)暴露組所觀察到的異常改變是不可缺少的;e）成對的器官（如腎、腎上腺等），雙側(cè)均應(yīng)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。5數(shù)據(jù)與報(bào)告5.1數(shù)據(jù)處理提供單只動(dòng)物數(shù)據(jù)。所有的數(shù)據(jù)匯總列表，顯示每組試驗(yàn)開始時(shí)的動(dòng)物數(shù)、試驗(yàn)期間死亡或處死的動(dòng)物數(shù)及死亡時(shí)間、出現(xiàn)中毒體征動(dòng)物數(shù)、描述觀察到的中毒體征，包括發(fā)作時(shí)間、持續(xù)期和嚴(yán)重程度，呈現(xiàn)損傷的動(dòng)物數(shù)，損傷類型及所占動(dòng)物數(shù)的百分比。匯總列表應(yīng)提供出現(xiàn)毒性作用動(dòng)物數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差以及損傷分級。歷史性對照數(shù)據(jù)對于試驗(yàn)結(jié)果的解釋非常有價(jià)值，例如當(dāng)并行對照組的數(shù)據(jù)與最近同樣種群及試驗(yàn)條件下的對照組發(fā)生大幅度偏離時(shí)。用于評估的歷史性對照數(shù)據(jù)，應(yīng)采用5年以內(nèi)源自相同試驗(yàn)室采用同齡同品系動(dòng)物的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)