化學(xué)品 藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn) 征求意見(jiàn)稿

1GB/T21805—XXXX化學(xué)品藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)本文件規(guī)定了化學(xué)品藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)的受試物信息、試驗(yàn)原理、參比物、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)程序、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)與報(bào)告。本文件適用于評(píng)價(jià)具有低揮發(fā)性、高環(huán)境穩(wěn)定性且試驗(yàn)條件下可溶于水的受試物對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響。如果要測(cè)試揮發(fā)性的、強(qiáng)吸附性的、有顏色的、不溶或難溶于水的受試物，以及可能影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有效利用的受試物，需要對(duì)所述試驗(yàn)程序進(jìn)行修改（如密閉系統(tǒng)、試驗(yàn)容器的適應(yīng)等）。2術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。2.1生物量biomass一定體積試驗(yàn)溶液中活體生物的干重，例如每升試驗(yàn)溶液中含多少毫克藻類(lèi)干重。生物量通常被定義為質(zhì)量，但在本文件中，是指單位體積的質(zhì)量，同時(shí)，本文件中，通常測(cè)量生物量的替代參數(shù)，例如細(xì)胞數(shù)量、熒光等，因此術(shù)語(yǔ)“生物量”也指這些替代參數(shù)。2.2變異系數(shù)coefficientofvariation標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)之比，也可以百分比表示，記作CV%。變異系數(shù)是一個(gè)無(wú)量綱的數(shù)，因而便于樣本間的相互比較。對(duì)照組各平行試驗(yàn)平均特定生長(zhǎng)率變異系數(shù)的平均值按以下方法計(jì)算：1）通過(guò)試驗(yàn)各階段對(duì)照組各平行試驗(yàn)的生長(zhǎng)速率，分別計(jì)算得出各階段的對(duì)照組各平行試驗(yàn)平均特定生長(zhǎng)率變異系數(shù)；2）將上述1）等到的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得出對(duì)照組各平行試驗(yàn)平均特定生長(zhǎng)率變異系數(shù)的平均值。2.3效應(yīng)濃度effectconcentration；ECx暴露期（或偏離完整或常規(guī)試驗(yàn)周期，應(yīng)說(shuō)明）內(nèi)，與對(duì)照組相比，引起受試生物生長(zhǎng)下降x%（如50%）的受試物濃度。EC有基于生長(zhǎng)率的ErC和基于生長(zhǎng)量的EyC之分。2.4藻類(lèi)生長(zhǎng)培養(yǎng)基growthmedium藻類(lèi)暴露于受試物時(shí)，其生長(zhǎng)所基于的完全人工合成的培養(yǎng)介質(zhì)。通常將受試物溶于培養(yǎng)基（配制試驗(yàn)液）。2.5生長(zhǎng)率growthrate2GB/T21805—XXXX即平均特定生長(zhǎng)率（averagespecificgrowthrate），是暴露期間生物量的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)。2.6最低可觀察效應(yīng)濃度lowestobservedeffectconcentration；LOEC一定暴露期內(nèi)，與對(duì)照相比，對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)有明顯（p<0.05）抑制效應(yīng)的最低試驗(yàn)濃度（受試物設(shè)置濃度）。高于LOEC的所有試驗(yàn)濃度均可觀察到與LOEC相同的或更嚴(yán)重的毒性影響。如果未滿足該條件，須就LOEC（以及NOEC）的選擇進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。2.7無(wú)可觀察效應(yīng)濃度noobservedeffectconcentration；NOEC緊臨并低于最低可觀察效應(yīng)濃度（LOEC）的試驗(yàn)濃度（受試物設(shè)置濃度）。2.8反應(yīng)變量responsevariable用于估計(jì)毒性的變量，該變量源自通過(guò)不同計(jì)算方法描述生物量的任何測(cè)量參數(shù)。本文件中指生長(zhǎng)率和生長(zhǎng)量。2.9特定生長(zhǎng)率specificgrowthrate暴露結(jié)束時(shí)生物量自然對(duì)數(shù)與暴露開(kāi)始時(shí)生物量自然對(duì)數(shù)之差與試驗(yàn)周期的商，以每天生物量的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)表示。2.10暴露結(jié)束時(shí)生物量與暴露開(kāi)始時(shí)生物量之差，以反映試驗(yàn)期間生物量的增長(zhǎng)。3受試物信息3.1以下受試物信息對(duì)于確定試驗(yàn)條件可能有用：a)結(jié)構(gòu)式；b)純度；c)光中的穩(wěn)定性；d)試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性；e)吸光性；f)水解離常數(shù)（pKag)轉(zhuǎn)化方面的研究結(jié)果，包括水中的生物降解試驗(yàn)結(jié)果。3.2以下受試物信息應(yīng)該已知：a)水中溶解度；b)正辛醇-水分配系數(shù)（POW）；c)蒸氣壓；d)試驗(yàn)條件下有效的受試物定量分析方法，包括注明回收率和檢測(cè)限。4試驗(yàn)原理3GB/T21805—XXXX本試驗(yàn)的目的是確定受試物對(duì)淡水微藻和/或藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響。將呈指數(shù)增長(zhǎng)的藻類(lèi)通過(guò)分批培養(yǎng)，暴露于受試物。試驗(yàn)周期通常72小時(shí)。盡管測(cè)試持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短，但可以評(píng)估對(duì)藻類(lèi)幾個(gè)世代的影響。與無(wú)受試物暴露的對(duì)照相比，暴露于不同濃度的受試物，藻類(lèi)生長(zhǎng)會(huì)受到不同程度的抑制，將生長(zhǎng)抑制效應(yīng)作為暴露濃度的函數(shù)進(jìn)行評(píng)估。測(cè)量藻類(lèi)在營(yíng)養(yǎng)充足、連續(xù)光照足夠長(zhǎng)時(shí)間的條件下不受限制地呈指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)的特定生長(zhǎng)率的降低，以充分表達(dá)受試物的毒性效應(yīng)（達(dá)到最佳靈敏度）。測(cè)量不同時(shí)間藻類(lèi)的生物量，以量化藻類(lèi)的生長(zhǎng)和生長(zhǎng)抑制。但因藻類(lèi)干重難以測(cè)量，使用替代參數(shù)。在這些替代參數(shù)中，最常使用細(xì)胞計(jì)數(shù)。其他替代參數(shù)包括細(xì)胞體積、熒光、光密度等。測(cè)量的替代參數(shù)和生物量之間的換算系數(shù)應(yīng)該是已知的。測(cè)試終點(diǎn)為生長(zhǎng)抑制，以試驗(yàn)期間生物量對(duì)數(shù)增加（特定生長(zhǎng)率）的降低來(lái)表達(dá)。根據(jù)一系列試驗(yàn)濃度下的平均特定生長(zhǎng)率，確定引起特定生長(zhǎng)率降低達(dá)另一反應(yīng)變量是生長(zhǎng)量，即暴露結(jié)束時(shí)生物量與暴露開(kāi)始時(shí)生物量之差。根據(jù)一系列試驗(yàn)濃度下的平均生長(zhǎng)量，確定引起生長(zhǎng)量降低達(dá)到x%（例如50%）的濃度并表示為EyCx（例如EyC50）。此外，可以統(tǒng)計(jì)得出最低可觀察效應(yīng)濃度（LOEC）和(或)無(wú)可觀察效應(yīng)濃度（NOEC）。5參比物3,5-二氯苯酚可作為參比物。對(duì)于綠藻，也可使用重鉻酸鉀作為參比物。定期測(cè)試參比物對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響，至少每年兩次。6試驗(yàn)方法6.1儀器設(shè)備6.1.1試驗(yàn)容器試驗(yàn)容器和其他與試驗(yàn)液直接接觸的器皿應(yīng)完全為玻璃或其他化學(xué)惰性材料制成，用于試驗(yàn)前應(yīng)徹底清洗并滅菌。試驗(yàn)容器通常為具有一定容積的玻璃瓶，如三角瓶，以保證試驗(yàn)期間有足夠的試驗(yàn)液用于測(cè)試，同時(shí)也保證CO2的充分交換。注意必須保證有足夠的液體用作分析測(cè)量。6.1.2培養(yǎng)設(shè)備使用溫度控制精度在±2℃范圍內(nèi)的光照培養(yǎng)箱。6.1.3照度計(jì)光照強(qiáng)度的測(cè)量方法非常重要，特別是光接受器的類(lèi)型可能影響測(cè)量值。最好使用4π的球面照度計(jì)（可接受來(lái)自各方向各角度的直射或反射光照）或2π球面照度計(jì)（可接受來(lái)自上方各角度的直射或反射光照）。6.1.4測(cè)量藻類(lèi)生物量的儀器設(shè)備細(xì)胞計(jì)數(shù)是藻類(lèi)生物量最常用的替代參數(shù)。用于計(jì)數(shù)的儀器設(shè)備主要有電子顆粒計(jì)數(shù)儀、帶計(jì)數(shù)室的顯微鏡、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等。也可使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、熒光計(jì)、分光光度計(jì)、色度計(jì)等測(cè)量其他替代參數(shù)。為了在低生物量時(shí)進(jìn)行有效測(cè)量，分光光度計(jì)吸收池的光徑必須至少為4cm。應(yīng)明確替代參數(shù)和藻類(lèi)干重之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系。6.1.5其他儀器4GB/T21805—XXXX——pH計(jì)——電子天平——高壓滅菌器等6.2受試生物選擇一些不易附著于瓶壁上的綠藻和藍(lán)藻作為受試生物。a）綠藻——近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata，曾用名：羊角月芽藻/Pseudokirchneriellasubcapitata）——近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus，曾用名：柵藻/Scenedesmussubspicatus）——普通小球藻（Chlorellavulgaris）b）硅藻——舟形藻（Naviculapelliculosa）c）藍(lán)藻——水華魚(yú)腥藻（Anabaenaflos-aquae）——聚球藻（Synechococcusleopoliensis）上述藻類(lèi)的詳細(xì)信息見(jiàn)附錄A。也可選用其他藻類(lèi)，但應(yīng)在報(bào)告中說(shuō)明其品系和（或）來(lái)源，并確保在試驗(yàn)期間相應(yīng)的試驗(yàn)條件下保持指數(shù)生長(zhǎng)。6.3培養(yǎng)基使用OECD和AAP的藻類(lèi)培養(yǎng)基，其組成見(jiàn)附錄B。注意兩種培養(yǎng)基的初始pH值和緩沖能力（調(diào)節(jié)pH值）不同，因此，所使用的培養(yǎng)基不同，測(cè)試結(jié)果可能會(huì)有所不同，尤其是當(dāng)受試物在水中離子化程度較高時(shí)。有時(shí)可能需要對(duì)藻類(lèi)培養(yǎng)基進(jìn)行修改，例如在測(cè)試金屬和螯合劑或在不同的pH值條件下測(cè)試時(shí)，這時(shí)應(yīng)詳細(xì)描述改良后培養(yǎng)基的使用并證明其合理性。7試驗(yàn)程序7.1試驗(yàn)準(zhǔn)備7.1.1藻液的制備為使受試藻類(lèi)適應(yīng)試驗(yàn)條件，保證藻類(lèi)在用于接種試驗(yàn)液時(shí)處于指數(shù)生長(zhǎng)期，試驗(yàn)開(kāi)始前2-4天在與試驗(yàn)條件相同的試驗(yàn)培養(yǎng)基中進(jìn)行藻類(lèi)預(yù)培養(yǎng)，制備藻類(lèi)接種物。應(yīng)調(diào)整藻類(lèi)生物量，使其在接種物培養(yǎng)中的指數(shù)增長(zhǎng)占優(yōu)勢(shì)，直到試驗(yàn)開(kāi)始。藻類(lèi)接種物培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)測(cè)量接種物培養(yǎng)中藻類(lèi)生物量的增加，以確保在培養(yǎng)條件下藻類(lèi)的生長(zhǎng)在正常范圍內(nèi)。附錄C中描述了藻類(lèi)培養(yǎng)程序的一個(gè)示例?？梢苑磸?fù)轉(zhuǎn)接2~3次，經(jīng)檢查藻類(lèi)生長(zhǎng)健壯并正處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)即可用來(lái)制備試驗(yàn)中需要的藻液。試驗(yàn)時(shí)，所有試驗(yàn)液中的藻類(lèi)的初始生物量應(yīng)相同并足夠低，以保證在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下藻類(lèi)在成熟期保持指數(shù)增長(zhǎng)而沒(méi)有養(yǎng)分耗盡的風(fēng)險(xiǎn)。初始生物量不應(yīng)超過(guò)0.5mg/L干重。各種藻類(lèi)在試驗(yàn)液中的初始細(xì)胞濃度建議如下：近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）5×103~5×104個(gè)/mL近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）2×103~5×103個(gè)/mL舟形藻（Naviculapelliculosa）104個(gè)/mL水華魚(yú)腥藻（Anabaenaflos-aquae）104個(gè)/mL5GB/T21805—XXXX聚球藻（Synechococcusleopoliensis）5×104~5×105個(gè)/mL7.1.2試驗(yàn)溶液的制備將受試物溶解在經(jīng)滅菌后的新鮮藻類(lèi)培養(yǎng)基中配制受試物儲(chǔ)備液。試驗(yàn)時(shí)稀釋成不同的濃度，并接種受試藻類(lèi)接種物，配制成一系列不同濃度的受試物溶液。所有試驗(yàn)溶液必須包含相同濃度的藻類(lèi)培養(yǎng)基和藻類(lèi)初始生物量。如果受試物難溶于水，制備受試物儲(chǔ)備液時(shí)可以添加適合的溶劑，例如丙酮、t-丁基乙醇和二甲基甲酰胺等。應(yīng)選用對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)無(wú)影響的溶劑，所有試驗(yàn)溶液（包括對(duì)照）中溶劑的添加濃度應(yīng)相同，并且最大允許濃度為100μL/L。7.2試驗(yàn)操作7.2.1預(yù)試驗(yàn)為確定正式試驗(yàn)中受試物濃度的設(shè)置范圍，可以先進(jìn)行一次預(yù)試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)的濃度可按對(duì)數(shù)間距排布，最低濃度應(yīng)為受試物的檢測(cè)下限，最高濃度應(yīng)為飽和濃度。測(cè)量項(xiàng)目和方法可簡(jiǎn)化，試驗(yàn)時(shí)間有時(shí)也可縮短。7.2.2正式試驗(yàn)可以根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)置正式試驗(yàn)的受試物濃度范圍，最好在對(duì)藻類(lèi)產(chǎn)生5%~75%生長(zhǎng)抑制效應(yīng)之間以幾何級(jí)數(shù)設(shè)置受試物濃度系列。至少設(shè)5個(gè)濃度組，公比應(yīng)不超過(guò)3.2，對(duì)于劑量-效應(yīng)曲線較為平坦的受試物，可能需要更大的公比數(shù)。每個(gè)濃度3個(gè)平行。如果試驗(yàn)不需要得出無(wú)可觀察效應(yīng)濃度（NOEC），可以適當(dāng)減少平行數(shù)而增加試驗(yàn)濃度的設(shè)置數(shù)量。應(yīng)同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。對(duì)照組至少設(shè)3個(gè)平行。如果條件允許，對(duì)照組平行數(shù)為受試組的2倍。若使用溶劑，還應(yīng)增設(shè)溶劑對(duì)照組?？梢耘渲埔惶讍为?dú)的試驗(yàn)溶液用于受試物濃度的分析測(cè)量。7.2.3試驗(yàn)培養(yǎng)試驗(yàn)容器用透氣塞封口，放入培養(yǎng)設(shè)備中。試驗(yàn)期間，為保持藻細(xì)胞的懸浮和CO2的流通，需持續(xù)搖動(dòng)或攪拌。培養(yǎng)溫度為21℃~24℃,并保持在±2℃的范圍。建議將容器隨機(jī)擺放并每天改變其在培養(yǎng)設(shè)備中的位置。試驗(yàn)期間，對(duì)照組pH值的升高應(yīng)小于1.5。如受試物含有金屬或是在試驗(yàn)的pH值下發(fā)生部分離子化的化合物，需限制pH值的偏離，以確保獲得可重復(fù)的良好的試驗(yàn)結(jié)果。pH值的偏離小于0.5在理論上是可行的，同時(shí)可通過(guò)確保有充足的CO2在空氣和試驗(yàn)液間交換來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如增大搖動(dòng)頻率。另一個(gè)途徑是減少初始生物量或縮短試驗(yàn)周期來(lái)減少對(duì)CO2的需求。試驗(yàn)溶液表面應(yīng)接收持續(xù)均勻的光照，如冷白型或日光型光照。波長(zhǎng)在400nm~700nm、光照強(qiáng)度在60μE·m-2·s-1~120μE·m-2·s-1的范圍的光照適用于所推薦綠藻生長(zhǎng)（對(duì)于單位為L(zhǎng)ux的照度計(jì)，60μE·m-2·s-1~120μE·m-2·s-1大約為4440Lux~8880Lux的冷白光）。培養(yǎng)區(qū)域的光強(qiáng)差異應(yīng)保持在±15%范圍內(nèi)。7.2.4試驗(yàn)周期試驗(yàn)周期為72h。但如果達(dá)到質(zhì)量保證與質(zhì)量控制的各項(xiàng)要求，也可根據(jù)實(shí)際情況縮短或延長(zhǎng)試驗(yàn)周期。6GB/T21805—XXXX7.2.5測(cè)量、分析與觀察試驗(yàn)期間，至少每天測(cè)量各試驗(yàn)容器中藻類(lèi)的生物量。如果從試驗(yàn)溶液中吸取少量試驗(yàn)液進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量完成后，嚴(yán)禁將取出的試驗(yàn)液放回至試驗(yàn)容器中。試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)測(cè)量試驗(yàn)液的pH值。試驗(yàn)開(kāi)始和試驗(yàn)期間定期取樣分析，以確定各試驗(yàn)溶液的初始濃度以及試驗(yàn)期間的實(shí)際暴露濃度。如試驗(yàn)期間受試物濃度維持在配制濃度（或?qū)崪y(cè)初始濃度）±20%的范圍內(nèi)，可僅分析試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)最高濃度組、最低濃度組和接近50%生長(zhǎng)抑制濃度組中受試物的濃度；如無(wú)法維持，則應(yīng)測(cè)量所有濃度組中受試物的濃度。如果受試物具有揮發(fā)性、不穩(wěn)定性或強(qiáng)吸附性，則應(yīng)每隔24h測(cè)量一次，以確定受試物的損失。對(duì)于此類(lèi)物質(zhì)，可能需要增加平行數(shù)。在上述任何情況下，各濃度組只需用1個(gè)平行（或?qū)讉€(gè)平行中的試驗(yàn)溶液合并）來(lái)測(cè)量受試物的濃度。用于受試物濃度分析的培養(yǎng)基應(yīng)與試驗(yàn)用培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)同樣的處理，即接種了藻類(lèi)且在試驗(yàn)相同的條件下培養(yǎng)。如果需要分析溶解的受試物濃度，需將藻類(lèi)從培養(yǎng)基中分離。最好使用離心法進(jìn)行分離，較低轉(zhuǎn)速就可使藻類(lèi)沉淀。如測(cè)量濃度在配制濃度（或?qū)崪y(cè)初始濃度）±20%的范圍內(nèi)，可用配制濃度或?qū)崪y(cè)初始濃度進(jìn)行結(jié)果計(jì)算；如超出該范圍，則使用實(shí)測(cè)濃度的幾何平均值或根據(jù)受試物濃度下降的模型進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。相較其它絕大多數(shù)短期的水生毒性試驗(yàn)，藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)是一個(gè)更加動(dòng)態(tài)的試驗(yàn)系統(tǒng)。試驗(yàn)中實(shí)際的暴露濃度難以確定，尤其是對(duì)于在低濃度下的強(qiáng)吸附性物質(zhì)。由于吸附于增加的藻類(lèi)細(xì)胞上，試驗(yàn)溶液中受試物的損失并不意味著它從該試驗(yàn)系統(tǒng)中消失。計(jì)算結(jié)果時(shí)，需核查在受試物濃度降低過(guò)程中是否伴隨著藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的減小。如果發(fā)生此類(lèi)情況，建議使用合適的受試物濃度下降模型；反之則最好采用初始濃度（配制或?qū)崪y(cè)）進(jìn)行計(jì)算。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用顯微鏡觀察試驗(yàn)接種的藻類(lèi)細(xì)胞外觀是否正常和健康，并記錄藻類(lèi)細(xì)胞的任何異常情況（可能由于暴露于受試物中引起的）。7.2.6藻類(lèi)生長(zhǎng)測(cè)量方法測(cè)量藻類(lèi)生長(zhǎng)的指標(biāo)和方法很多，建議可以測(cè)量以下指標(biāo)：a）細(xì)胞計(jì)數(shù)在顯微鏡下，用0.1ml計(jì)數(shù)框或血球計(jì)數(shù)板對(duì)藻細(xì)胞的數(shù)量計(jì)數(shù)。用計(jì)數(shù)框時(shí)可采用視野法，即對(duì)顯微鏡視野中的所有細(xì)胞計(jì)數(shù)。放大倍數(shù)40×10，每片至少計(jì)數(shù)10個(gè)視野，如果藻細(xì)胞密度小，則要適當(dāng)增加計(jì)數(shù)視野，藻數(shù)按視野累加。每次計(jì)數(shù)（同一批取樣的樣品）應(yīng)采用相同方法（視野數(shù)目、放大倍數(shù)等）。每一樣品至少計(jì)數(shù)兩次，如計(jì)數(shù)結(jié)果相差大于15應(yīng)予重復(fù)計(jì)數(shù)。如工作量過(guò)大，可先取樣，用盧戈氏液固定后保存，留待以后計(jì)數(shù)。鏡檢計(jì)數(shù)工作量較大，有條件時(shí)可采用電子顆粒計(jì)數(shù)儀。b）光密度取一定量的測(cè)試液在分光光度計(jì)上測(cè)量其光密度，波長(zhǎng)可選用650nm、663nm或其它波長(zhǎng)。亦可用熒光光度計(jì)測(cè)量。c）葉綠素樣品經(jīng)離心或過(guò)濾后，用丙酮、乙醇或其它溶劑萃取，進(jìn)行分光測(cè)量。亦可用熒光光度計(jì)測(cè)量。7.2.7限度試驗(yàn)如果預(yù)試驗(yàn)表明受試物濃度達(dá)到100mg/L或試驗(yàn)條件下飽和溶液濃度（該溶解度低于100mg/L）時(shí)未對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)產(chǎn)生毒性影響，可進(jìn)行含有1個(gè)對(duì)照組和1個(gè)濃度組（100mg/L或在試驗(yàn)條件下飽和溶液濃度）的限度試驗(yàn)。進(jìn)行限度試驗(yàn)，最好有受試物的濃度分析加以佐證。除了平行數(shù)增加到至少6個(gè)之外，所有有關(guān)試驗(yàn)條件、試驗(yàn)方法、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制的描述均適用于限度試驗(yàn)。對(duì)照組和受試組中測(cè)得7GB/T21805—XXXX的反應(yīng)變量需用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行比較分析，例如Studentt檢驗(yàn)。如果兩組的方差不相等，則應(yīng)進(jìn)行不等方差調(diào)整的t檢驗(yàn)。8質(zhì)量保證與質(zhì)量控制試驗(yàn)達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)方為有效：a）試驗(yàn)開(kāi)始的72h內(nèi)，對(duì)照組藻類(lèi)呈指數(shù)增長(zhǎng)且濃度應(yīng)至少增加16倍，即特定生長(zhǎng)率大于等于0.92/d。對(duì)于常用的試驗(yàn)藻種，生長(zhǎng)率遠(yuǎn)高于此。如試驗(yàn)使用的藻種生長(zhǎng)較慢，該標(biāo)準(zhǔn)可能不適用。如果發(fā)生此類(lèi)情況，應(yīng)延長(zhǎng)試驗(yàn)周期，直至對(duì)照組藻類(lèi)呈指數(shù)增長(zhǎng)且濃度增加16倍。同樣，只要對(duì)照組藻類(lèi)保持無(wú)限的指數(shù)增長(zhǎng)且濃度增加16倍，也可縮短試驗(yàn)周期，但至少48h。b）試驗(yàn)各階段，如0d~1d、1d~2d和2d~3d，對(duì)照組各平行的不同階段平均特定生長(zhǎng)率變異系數(shù)的平均值應(yīng)不超過(guò)35%。c）整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)照組各平行的平均特定生長(zhǎng)率變異系數(shù)，用近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）和近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）作為藻種時(shí)，應(yīng)不超過(guò)7%；用其他非常用藻種時(shí)，應(yīng)不超過(guò)10%。d）試驗(yàn)期間對(duì)照組溶液pH的變化范圍不大于1.5個(gè)單位。e）參比物重鉻酸鉀和3,5-二氯苯酚對(duì)近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）的72hErC50參考范圍分別為0.92mg/L~1.46mg/L和2.08mg/L~4.68mg/L。參比物重鉻酸鉀和3,5-二氯苯酚對(duì)近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）的72hErC50參考范圍分別為0.72mg/L~0.96mg/L和4.04mg/L~8.80mg/L。~9數(shù)據(jù)與報(bào)告9.1數(shù)據(jù)處理9.1.1繪制生長(zhǎng)曲線用測(cè)量的替代參數(shù)（如藻細(xì)胞濃度、熒光性）表示試驗(yàn)容器中藻類(lèi)的生物量。以表格形式列出24h、48h和72h對(duì)照組和各受試組的試驗(yàn)容器中的藻類(lèi)生物量。以時(shí)間為橫軸，藻類(lèi)生物量為縱軸，取各平行的平均值，繪制對(duì)照組和各受試組的藻類(lèi)生長(zhǎng)曲線。須使用對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸，也可使用直線坐標(biāo)軸。用對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸作出的生長(zhǎng)曲線是一條直線，其斜率就是藻類(lèi)的特定生長(zhǎng)率。觀察生長(zhǎng)曲線，檢查整個(gè)試驗(yàn)期間對(duì)照組的生長(zhǎng)是否達(dá)到預(yù)期的指數(shù)增長(zhǎng)。仔細(xì)檢查所有數(shù)據(jù)點(diǎn)和圖表，核對(duì)原始數(shù)據(jù)和程序是否存在可能的錯(cuò)誤。仔細(xì)檢查可能偏離系統(tǒng)誤差的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)。如果發(fā)現(xiàn)了明顯的程序上的錯(cuò)誤或該錯(cuò)誤發(fā)生的可能性非常高，將相關(guān)的數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)為異常值，并在進(jìn)行下一步的統(tǒng)計(jì)分析時(shí)剔除這些數(shù)據(jù)。（如果其中一個(gè)平行中藻類(lèi)的濃度為零，那可能是該平行試驗(yàn)液中未接入藻類(lèi)或器皿的洗滌方法不正確）。試驗(yàn)報(bào)告中對(duì)于作為異常值被剔除的數(shù)據(jù)應(yīng)闡明其原因?？梢越邮艿脑騼H限于（罕見(jiàn)的）程序錯(cuò)誤，而不僅僅是精度差。異常值識(shí)別的統(tǒng)計(jì)程序?qū)@類(lèi)問(wèn)題的用途有限，不能代替專(zhuān)家判斷。最好在之后出現(xiàn)的圖表中保留異常值。9.1.2選擇反應(yīng)變量試驗(yàn)的目的是確定受試物質(zhì)對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響。有兩個(gè)反應(yīng)變量，分別是平均特定生長(zhǎng)率和生長(zhǎng)量。使用這兩個(gè)反應(yīng)變量計(jì)算的毒性值不具有可比性，應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果時(shí)必須認(rèn)識(shí)到這種差異。試驗(yàn)條件，基于平均特定生長(zhǎng)率(ErCx)的ECx值通常會(huì)高于基于生長(zhǎng)量(EyCx)的結(jié)果，這是由于各自方法的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)。8GB/T21805—XXXX這僅僅只是數(shù)值在數(shù)學(xué)上不同，不應(yīng)被解釋為兩個(gè)反應(yīng)變量存在靈敏度差異。平均特定生長(zhǎng)率是基于藻類(lèi)在非限制培養(yǎng)中的一般指數(shù)生長(zhǎng)模式，其中毒性是根據(jù)對(duì)生長(zhǎng)速率的影響來(lái)估計(jì)的，而不依賴(lài)于對(duì)照組特定生長(zhǎng)率的絕對(duì)水平、濃度-反應(yīng)曲線的斜率或試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間。相反，基于生長(zhǎng)量的毒性結(jié)果受所有這些其他因素的影響，EyCx取決于每個(gè)試驗(yàn)使用的藻類(lèi)物種的特定生長(zhǎng)率和最大特定生長(zhǎng)率，而這些在不同藻類(lèi)之間甚至相同藻類(lèi)不同菌株之間都可能是不同的。生長(zhǎng)量不應(yīng)用于比較藻類(lèi)甚至不同菌株對(duì)受試物的敏感性。因此科學(xué)上更傾向于使用平均特定生長(zhǎng)率來(lái)估算毒性。9.1.3濃度的換算把顯微鏡視野計(jì)數(shù)結(jié)果換算為細(xì)胞濃度N，見(jiàn)式（1）：式中：Cs為計(jì)數(shù)框面積（20mm×20mm）Fs=πr2；Fs為視野面積；r＝測(cè)量值（mm），r為視野半徑；Pn＝n1+n2+???+ni（i＝n）；其中N（個(gè)/ml）每瓶試樣中藻濃度；Pn為n個(gè)視野細(xì)胞數(shù)累加值；ni為第i個(gè)視野的藻細(xì)胞數(shù)。9.1.4計(jì)算參數(shù)a）特定生長(zhǎng)率和基于生長(zhǎng)率的抑制率特定生長(zhǎng)率，見(jiàn)式（2）。式中：μi-j——從i時(shí)間到j(luò)時(shí)間的特定生長(zhǎng)率，單位為每天（d-1Xi——i時(shí)間的生物量；Xj——j時(shí)間的生物量。對(duì)于對(duì)照組和各受試組，計(jì)算各平行的特定生長(zhǎng)率的平均值和方差估算值。采用藻類(lèi)初始接種生物量的設(shè)定值計(jì)算整個(gè)試驗(yàn)周期（通常0d~3d）的平均特定生長(zhǎng)率，比采用測(cè)量值計(jì)算的更精確。如果生物量測(cè)量?jī)x器允許足夠精確地測(cè)量低接種物生物量（如流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可使用初始生物量的測(cè)量值進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算并評(píng)估試驗(yàn)過(guò)程中每天的（0d~1d、1d~2d和2d~3d）特定生長(zhǎng)率，并檢查對(duì)照組的生長(zhǎng)率是否符合質(zhì)量保證與質(zhì)量控制的要求。如果與總平均特定生長(zhǎng)率相比，第一天的特定生長(zhǎng)率相當(dāng)?shù)停f(shuō)明第一天藻類(lèi)處于生長(zhǎng)停滯期。通過(guò)預(yù)培養(yǎng)消除對(duì)照組中的生長(zhǎng)停滯期或使其最小化，暴露組中的生長(zhǎng)停滯表明藻類(lèi)經(jīng)受試物作用后可能恢復(fù)或由于受試物的損失（包括吸附于藻類(lèi)）減少了暴露量。因此，為了評(píng)價(jià)暴露期間發(fā)生的受試物對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響，應(yīng)評(píng)價(jià)試驗(yàn)各階段的生長(zhǎng)率。如果平均特定生長(zhǎng)率和各階段生長(zhǎng)率間存在顯著差異，說(shuō)明藻類(lèi)未保持持續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)，因此，要仔細(xì)檢查生長(zhǎng)曲線?；谏L(zhǎng)率的抑制率，見(jiàn)式（3）。9GB/T21805—XXXX式中：Ir——基于特定生長(zhǎng)率的抑制率，%；μC——對(duì)照組各平行特定生長(zhǎng)率的平均值；μT——受試組各平行的特定生長(zhǎng)率的平均值。b）生長(zhǎng)量和基于生長(zhǎng)量的抑制率生長(zhǎng)量，計(jì)算方法是將每個(gè)對(duì)照和處理試驗(yàn)容器中暴露結(jié)束時(shí)的生物量減去起始時(shí)的生物量，獲得各平行的生長(zhǎng)量。對(duì)于對(duì)照組和各受試組，計(jì)算各平行的生長(zhǎng)量的平均值和方差估算值?；谏L(zhǎng)量的抑制率，見(jiàn)式（4）。式中：Iy——基于生長(zhǎng)量的抑制率，%；YC——對(duì)照組各平行生長(zhǎng)量的平均值；YT——受試組各平行的生長(zhǎng)量的平均值。c）計(jì)算基于生長(zhǎng)率的抑制率或基于生長(zhǎng)量的抑制率時(shí)，如果試驗(yàn)添加了溶劑，應(yīng)選擇溶劑對(duì)照組進(jìn)行計(jì)算。9.1.5繪制濃度-效應(yīng)曲線以受試物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，特定生長(zhǎng)率或生長(zhǎng)量的抑制率為縱坐標(biāo)，作回歸曲線，即為濃度-效應(yīng)曲線。繪制曲線時(shí)忽略上一階段定為異常值的數(shù)據(jù)。通過(guò)觀察或計(jì)算機(jī)內(nèi)插法畫(huà)一條通過(guò)各數(shù)據(jù)點(diǎn)的平滑線，從而獲得初步的濃度-效應(yīng)關(guān)系，然后使用更詳細(xì)的方法，最好是計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)方法做進(jìn)一步分析。有時(shí)，根據(jù)數(shù)據(jù)的質(zhì)量（精度）和數(shù)量以及數(shù)據(jù)分析工具的可用性，可能會(huì)決定（有時(shí)是有充分理由的）在此階段停止進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析，并根據(jù)初步的擬合曲線獲取關(guān)鍵數(shù)據(jù)EC50和EC10（和/或EC20這取決于數(shù)據(jù)的預(yù)期用途。不使用統(tǒng)計(jì)方法的正當(dāng)理由可能包括：a）計(jì)算機(jī)處理方法不適用于這些數(shù)據(jù)，并不能產(chǎn)生比專(zhuān)家判斷更可靠的結(jié)果——在這種情況下，一些計(jì)算機(jī)程序甚至可能無(wú)法產(chǎn)生可靠的解決方案（迭代可能不收斂等）b）一般的計(jì)算機(jī)程序不適于處理生長(zhǎng)刺激效應(yīng)。9.1.6統(tǒng)計(jì)過(guò)程通過(guò)回歸分析獲得定量的濃度-效應(yīng)關(guān)系。對(duì)反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性變換（如probit變換或logit變換或Weibull變換）后，可以進(jìn)行加權(quán)線性回歸。非線性回歸能更好地處理不可避免的數(shù)據(jù)不規(guī)范和偏離光滑分布的問(wèn)題，因此是更合適的方法。但當(dāng)反應(yīng)近于零抑制或完全抑制時(shí)，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換可能會(huì)放大不規(guī)范性以致影響分析。應(yīng)注意，在標(biāo)準(zhǔn)的分析方法中，probit、logit或Weibull變換一般用于二元數(shù)據(jù)（如死亡率或生存率），如果用于生長(zhǎng)或生物量數(shù)據(jù)，則必須進(jìn)行修改。附錄D中進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明了非線性回歸分析的應(yīng)用。對(duì)于要分析的每個(gè)反應(yīng)變量，應(yīng)根據(jù)濃度-效應(yīng)關(guān)系對(duì)ECx值進(jìn)行點(diǎn)估計(jì)，可能的話，還應(yīng)確定每個(gè)點(diǎn)估計(jì)的95%的置信限。應(yīng)以圖或統(tǒng)計(jì)的方式評(píng)估反應(yīng)數(shù)據(jù)對(duì)回歸模型的擬合優(yōu)度。進(jìn)行回歸分析時(shí)，GB/T21805—XXXX應(yīng)使用個(gè)體重復(fù)反應(yīng)值而非處理組均值。但是，如果由于數(shù)據(jù)過(guò)于分散而很難或無(wú)法進(jìn)行非線性曲線擬合，則通過(guò)對(duì)組均值進(jìn)行回歸可避免這一問(wèn)題，是減少可疑異常值影響的一個(gè)實(shí)用方法。如果采用這樣的處理程序，則應(yīng)在檢驗(yàn)報(bào)告中說(shuō)明，是因?yàn)槭褂脗€(gè)體重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合的結(jié)果不好，因此未采用常規(guī)程序。如果可用的回歸模型/方法不適用于數(shù)據(jù)，也可以使用自舉線性插值法獲得EC50的估計(jì)值和置信限。為檢驗(yàn)受試物對(duì)生長(zhǎng)率的影響，應(yīng)使用方差分析(ANOVA)技術(shù)比較處理組均值，以估計(jì)LOEC進(jìn)而估計(jì)NOEC。然后，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)亩嘀乇容^或趨勢(shì)檢驗(yàn)方法將每個(gè)濃度組的均值與對(duì)照組均值進(jìn)行比較，Dunnett檢驗(yàn)或Williams檢驗(yàn)可能是較好的方法。必須用圖或正式檢驗(yàn)的方法檢驗(yàn)ANOVA的方差齊性假設(shè)是否成立，這里，Levene檢驗(yàn)或Bartlett檢驗(yàn)都適用。如果方差齊性假設(shè)不成立，可以通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換來(lái)校正。如果方差表現(xiàn)為極端異質(zhì)性，且難以通過(guò)數(shù)據(jù)變換來(lái)較正，則應(yīng)該考慮采用step-downJonkheere趨勢(shì)檢驗(yàn)等其他分析方法。近期的科學(xué)發(fā)展建議放棄NOEC的概念，以ECx替代。但對(duì)藻類(lèi)試驗(yàn)，x的合適取值尚未確定。（根據(jù)所選擇的反應(yīng)變量，）x在10%-20%范圍內(nèi)取值似乎都可以，因此EC10和EC20最好都報(bào)告。9.1.7生長(zhǎng)刺激有時(shí)會(huì)觀察到低濃度的生長(zhǎng)刺激效應(yīng)（負(fù)抑制）。這可能是由于受試物的興奮效應(yīng)（“毒性刺激”）或?qū)⒋碳ば陨L(zhǎng)因子與受試物一起添加到所用的藻類(lèi)培養(yǎng)基中造成的。請(qǐng)注意，添加無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素不應(yīng)有任何直接影響，因?yàn)榕囵B(yǎng)基應(yīng)在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中保持營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩。低劑量刺激通常在EC50計(jì)算中可以忽略，除非它是極端的。但是，如果它是極端的，或者要計(jì)算低x的ECx值，則可能需要特殊計(jì)算機(jī)程序。如果可能，應(yīng)避免從數(shù)據(jù)分析中刪除刺激反應(yīng)，如果可用的曲線擬合軟件不能接受輕微刺激，則可以使用帶自舉的直線內(nèi)插法。如果刺激是極端的，可以考慮使用興奮效應(yīng)模型（hormesismodel）。9.1.8非毒性生長(zhǎng)抑制光吸收試驗(yàn)材料可能會(huì)導(dǎo)致藻類(lèi)生長(zhǎng)速率降低，因?yàn)槲鈺?huì)減少可用光量。應(yīng)通過(guò)修改試驗(yàn)條件將此類(lèi)物理效應(yīng)與毒性效應(yīng)區(qū)分開(kāi)來(lái)，并在試驗(yàn)報(bào)告中做出單獨(dú)說(shuō)明。9.2試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：a）受試物.物理屬性和相關(guān)理化性質(zhì)，包括水中溶解度；.化學(xué)特性（如CAS編號(hào)），包括純度。b）受試生物.藻類(lèi)的種類(lèi)、來(lái)源或提供者，以及培養(yǎng)條件。c）試驗(yàn)條件.試驗(yàn)開(kāi)始日期和持續(xù)時(shí)間；.試驗(yàn)設(shè)計(jì)：試驗(yàn)容器、培養(yǎng)體積和試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的生物量密度；.培養(yǎng)基的成分；.試驗(yàn)濃度和平行（如平行數(shù)、試驗(yàn)濃度數(shù)及其公比）；.試驗(yàn)溶液的配制，包括溶劑的使用；.培養(yǎng)設(shè)備；.光照強(qiáng)度和光質(zhì)（來(lái)源，是否均勻.溫度；.濃度測(cè)量：設(shè)定濃度和所有實(shí)測(cè)濃度。應(yīng)說(shuō)明添加回收試驗(yàn)的方法和儀器的最低檢測(cè)限；GB/T21805—XXXX.對(duì)本文件的所有偏離；.生物量的測(cè)量方法，以及所測(cè)參數(shù)和干重的關(guān)系。d）結(jié)果.試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)各受試組的pH值；.生物量的測(cè)量方法，以及各測(cè)量時(shí)間各試驗(yàn)容器中的生物量；.生長(zhǎng)曲線（生物量-時(shí)間）；.計(jì)算出的各平行的各參數(shù)值，及其平均值和變異系數(shù)；.劑量-效應(yīng)曲線；.評(píng)估受試物對(duì)藻類(lèi)的毒性，如EC50、EC10、EC20及其置信區(qū)間。LOEC和NOEC及其統(tǒng)計(jì)方法（可選）；.如果采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，說(shuō)明最小顯著差數(shù)；.各受試組中任何對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)有刺激效應(yīng)的結(jié)果；.觀察到的其他效應(yīng)，如藻類(lèi)在形態(tài)學(xué)上的改變；.結(jié)果討論，包括對(duì)偏離的解釋說(shuō)明。GB/T21805—XXXX（資料性）試驗(yàn)藻種A.1生物品系A(chǔ).1.1綠藻近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata，曾用名：羊角月芽藻/Pseudokirchneriellasubcapitata）近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus，曾用名：柵藻/Scenedesmussubspicatus）普通小球藻（Chlorellavulgaris）A.1.2硅藻舟形藻（Naviculapelliculosa）A.1.3藍(lán)藻水華魚(yú)腥藻（Anabaenaflos-aquae）聚球藻（Synechococcusleopoliensis）A.2外觀和特征表A.1試驗(yàn)藻種的外觀和特征subcapitata）subspicatus）pelliculosa）flos-aquae）leopoliensis）40~50ab用細(xì)胞大小計(jì)算的結(jié)果；A.3試驗(yàn)藻種的培養(yǎng)與測(cè)量A.3.1近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）和近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）GB/T21805—XXXX多種培養(yǎng)基適用于這兩種綠藻。合適的培養(yǎng)基類(lèi)型可由提供單位獲取。單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞密度的測(cè)量比較簡(jiǎn)單，可用電子顆粒計(jì)數(shù)儀或顯微鏡。A.3.2水華魚(yú)腥藻（Anabaenaflos-aquae）多種培養(yǎng)基適用于此藻。注意，必須在藻類(lèi)進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期前轉(zhuǎn)接，否則將難以恢復(fù)。水華魚(yú)腥藻（Anabaenaflos-aquae）會(huì)生長(zhǎng)成鏈狀細(xì)胞的集合體。根據(jù)培養(yǎng)條件的不同，形成的集合體大小形狀也不同。進(jìn)行顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)或電子顆粒計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)時(shí)必須破壞該集合體。為了減小計(jì)數(shù)差異，取樣并進(jìn)行超聲波處理以破壞細(xì)胞的鏈狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)超聲波處理后，鏈狀細(xì)胞鏈長(zhǎng)變短，但是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞細(xì)胞。各受試組超聲的強(qiáng)度和時(shí)間應(yīng)相同。計(jì)數(shù)足夠的視野數(shù)（血球計(jì)數(shù)板，至少400個(gè)小格）有利于補(bǔ)償計(jì)數(shù)差異。這可以改善顯微鏡下測(cè)量密度的可靠性。可以使用電子顆粒計(jì)數(shù)儀測(cè)量經(jīng)超聲斷鏈處理的總細(xì)胞體積。將藻種接種至試驗(yàn)容器中時(shí)，采用攪拌或其他類(lèi)似方法使接種物懸浮。持續(xù)振蕩（150轉(zhuǎn)/min）或定時(shí)劇烈搖動(dòng)試驗(yàn)容器，以防魚(yú)腥藻聚團(tuán)。如果已形成團(tuán)狀物，在取樣進(jìn)行測(cè)量時(shí)應(yīng)劇烈搖動(dòng)，以破壞藻團(tuán)并使藻細(xì)胞均勻分布。A.3.3聚球藻（Synechococcusleopoliensis）多種培養(yǎng)基適用于此藻。合適的培養(yǎng)基類(lèi)型可由提供單位獲取。單個(gè)桿狀細(xì)胞。細(xì)胞非常小，用顯微鏡計(jì)數(shù)很復(fù)雜也很困難。使用電子顆粒計(jì)數(shù)儀時(shí)，粒徑范圍應(yīng)調(diào)至1μm。也可使用體外熒光計(jì)進(jìn)行測(cè)量。A.3.4舟形藻（Naviculapelliculosa）多種培養(yǎng)基適用于此藻。合適的培養(yǎng)基類(lèi)型可由提供單位獲取。注意培養(yǎng)基中硅酸鹽的量。在某些生長(zhǎng)條件下會(huì)形成團(tuán)狀物。該藻類(lèi)細(xì)胞有時(shí)能夠產(chǎn)生脂類(lèi)，因此在液面可能積聚成膜?；谝陨显?，為了獲得具有代表性的樣品，在取樣測(cè)量時(shí)需采用某些特殊的方法。例如使用漩渦攪拌器劇烈攪動(dòng)。GB/T21805—XXXX（資料性）培養(yǎng)基B.1OECD藻類(lèi)培養(yǎng)基OECD藻類(lèi)培養(yǎng)基同ISO8692中所述培養(yǎng)基，配制方法見(jiàn)表B.1。表B.1OECD藻類(lèi)培養(yǎng)基NH4ClMgCl2?6H2OCaCl2?2H2OMgSO4?7H2OKH2PO4FeCl3?6H2OH3BO3MnCl2?4H2ONa2MoO4?2H2ONaHCO3Na2SiO3?9H2O將配制好的儲(chǔ)備液經(jīng)0.2μm濾膜過(guò)濾或高壓滅菌（120℃,15min），4℃避光冷藏保存。儲(chǔ)備液2和儲(chǔ)備液4只能通過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌。GB/T21805—XXXXB.2APP藻類(lèi)培養(yǎng)基APP藻類(lèi)培養(yǎng)基同ASTM中所述培養(yǎng)基，配制方法見(jiàn)表B.2。表B.2APP藻類(lèi)培養(yǎng)基NaNO3MgCl2?6H2OH3BO3MnCl2?4H2OFeCl3?6H2ONa2MoO4?2H2ONa2SeO4?5H2O bMgSO4?7H2OK2HPO4NaHCO3--Na2SiO3?9H2Oab只有硅藻的儲(chǔ)備培養(yǎng)時(shí)需要。定容用水為去離子水或蒸餾水。使用0.1mol/L或1.0mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至7.5±0.1。將配制好的培養(yǎng)基經(jīng)0.22μm濾膜（使用電子顆粒計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)）或0.45μm濾膜（不使用電子顆粒計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)）過(guò)濾滅菌，4℃避光冷藏保存直至用于實(shí)驗(yàn)。GB/T21805—XXXXB.3OECD藻類(lèi)培養(yǎng)基和AAP藻類(lèi)培養(yǎng)基中各成分的比較表B.3OECD藻類(lèi)培養(yǎng)基和AAP藻類(lèi)培養(yǎng)基中各成分的比較NaHCO3NaNO3NH4ClMgCl2?6H2OCaCl2?2H2OMgSO4?7H2OK2HPO4KH2PO4FeCl3?6H2OH3BO3MnCl2?4H2ONa2MoO4?2H2OpHEDTA的摩爾比率略高于單位元素的。這樣可以避免離子沉淀，同時(shí)使重金屬離子的螯合作用最小化。在使用舟形藻（Naviculapelliculosa）作為受試生物時(shí)，兩種培養(yǎng)基中都需補(bǔ)充N(xiāo)a2SiO3?9H2O，使其濃度達(dá)到1.4mg/L（以Si計(jì)）。培養(yǎng)基的pH值是液體中的碳酸鹽和空氣中CO2的部分壓力之間平衡的結(jié)果。25℃時(shí)的pH值與重碳酸鹽的摩爾濃度之間的近似關(guān)系見(jiàn)式（B.1）。式中：NaHCO3為15mg/L時(shí)，pHeq=7.5（AAP培養(yǎng)基）NaHCO3為50mg/L時(shí)，pHeq=8.1（OECD培養(yǎng)基）GB/T21805—XXXXB.4OECD和AAP培養(yǎng)基中各元素的比較表B.4OECD和AAP培養(yǎng)基中各元素的比較CNPKNaGB/T21805—XXXX藻類(lèi)培養(yǎng)過(guò)程示例C.1一般建議根據(jù)以下程序培養(yǎng)藻類(lèi)的目的是為了培養(yǎng)毒性試驗(yàn)所用的藻類(lèi)。所使用的方法應(yīng)確保藻類(lèi)不受細(xì)菌污染。無(wú)菌培養(yǎng)可能是可取的，但必須建立和使用單藻培養(yǎng)。所有操作必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，以免受到細(xì)菌和其他藻類(lèi)污染。C.2設(shè)備和材料C.3培養(yǎng)程序C.3.1準(zhǔn)備培養(yǎng)基中所有營(yíng)養(yǎng)鹽都以濃縮儲(chǔ)備液形式避光冷藏保存。這些溶液通過(guò)過(guò)濾或高壓滅菌消毒。配制培養(yǎng)基時(shí)，將相應(yīng)量的儲(chǔ)備液加到無(wú)菌的蒸餾水中。注意不要發(fā)生污染。對(duì)于固體培養(yǎng)基加0.8％的瓊脂即可。C.3.2儲(chǔ)備培養(yǎng)儲(chǔ)備培養(yǎng)是定期將藻類(lèi)轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中作為初始測(cè)試材料的小型藻類(lèi)培養(yǎng)。如果藻類(lèi)不經(jīng)常使用，可以在試管內(nèi)固體培養(yǎng)基斜面上保存，至少兩個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。用三角瓶進(jìn)行儲(chǔ)備培養(yǎng)時(shí)要控制培養(yǎng)基的量（如體積為100ml），若在溫度為20℃、連續(xù)光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，要一個(gè)星期轉(zhuǎn)接一次。在大量轉(zhuǎn)接時(shí)要用無(wú)菌吸管轉(zhuǎn)接到有新鮮培養(yǎng)基三角瓶?jī)?nèi)。這樣，對(duì)于生長(zhǎng)快速的品種，其初始濃度比原培養(yǎng)物低100倍。可以從生長(zhǎng)曲線確定藻類(lèi)的生長(zhǎng)速率。若生長(zhǎng)率已知，就可以估計(jì)轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基的密度。培養(yǎng)物必須在到達(dá)衰亡期之前轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中。C.3.3預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)旨在為試驗(yàn)提供一定量的適合接種測(cè)試的藻類(lèi)培養(yǎng)物。預(yù)培養(yǎng)應(yīng)在與試驗(yàn)要求相同的條件下進(jìn)行。通常培養(yǎng)2d~4d后藻類(lèi)仍處于指數(shù)生長(zhǎng)階段即可用于試驗(yàn)接種。若鏡檢發(fā)現(xiàn)藻類(lèi)預(yù)培養(yǎng)物被污染或生長(zhǎng)異常（如畸形等）應(yīng)廢棄。GB/T21805—XXXX非線性回歸數(shù)據(jù)分析D.1總體思路藻類(lèi)試驗(yàn)和其他微生物生長(zhǎng)試驗(yàn)中的反應(yīng)——生物量的生長(zhǎng)——本質(zhì)上是一個(gè)連續(xù)的測(cè)量變量。如果使用生長(zhǎng)速率，為過(guò)程速率；如果使用生物量，則為其隨時(shí)間的積分。兩者都對(duì)應(yīng)于非暴露控制下重復(fù)試驗(yàn)的反應(yīng)均值，反映了所施加條件（光照和溫度是藻類(lèi)試驗(yàn)的主要影響因素）下的最大反應(yīng)值。試驗(yàn)系統(tǒng)是連續(xù)分布的或同質(zhì)的，可以將生物量視為一個(gè)不存在斷開(kāi)的連續(xù)統(tǒng)。此類(lèi)系統(tǒng)中，反應(yīng)的方差分布只與試驗(yàn)因素有關(guān)（通常用誤差的對(duì)數(shù)正態(tài)分布或正態(tài)分布描述）。與通常以分?jǐn)?shù)表示的生物測(cè)量反應(yīng)變量相反，生物個(gè)體的耐受度（通常為二項(xiàng)分布）一般假定為最主要的方差影響因素?？刂品磻?yīng)在這里為零或本底水平。在不復(fù)雜的情況下，歸一化的或相對(duì)的反應(yīng)值，r，將從1（零抑制）單調(diào)下降到0（完全抑制）。應(yīng)注意，所有反應(yīng)值都有一個(gè)誤差相伴，明顯的負(fù)抑制僅是計(jì)算的隨機(jī)誤差結(jié)果。D.2回歸分析D.2.1模型回歸分析的目的是以數(shù)學(xué)回歸函數(shù)Y=f(C)的形式或更常用的F(Z)的形式（其中Z＝logC）來(lái)定量描述濃度反應(yīng)曲線。用其逆函數(shù)C=f-1(Y)計(jì)算ECX值，包括EC50、EC10和EC20及其95%的置信限。已經(jīng)有幾個(gè)簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)函數(shù)形式被證明可以在藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中成功地描述濃度-效應(yīng)關(guān)系，例如logistic方程、非對(duì)稱(chēng)Weibul方程和對(duì)數(shù)正態(tài)分布函數(shù)，這些函數(shù)都是S形曲線，當(dāng)C趨近于0時(shí)漸進(jìn)于0，當(dāng)C趨近于無(wú)窮時(shí)漸進(jìn)于1。最近提出的使用連續(xù)閾值的函數(shù)模型（例如Kooijman的“種群生長(zhǎng)抑制”模型，Kooijman等，1996）或可作為漸進(jìn)模型的替代方法。該模型假設(shè)，濃度低于某閾值EC0+時(shí)沒(méi)有影響，其反應(yīng)值用在起點(diǎn)不可微的簡(jiǎn)單連續(xù)函數(shù)濃度軸上截距所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)值來(lái)進(jìn)行估計(jì)。應(yīng)注意，如果方差異質(zhì)性得到補(bǔ)償，則可用殘差平方和（固定方差假設(shè)）或加權(quán)平方和的簡(jiǎn)單最小化來(lái)進(jìn)行分析。D.2.2過(guò)程統(tǒng)計(jì)過(guò)程可概括如下：選擇適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)方程，Y=f(C)，用非線性回歸擬合數(shù)據(jù)。為了從數(shù)據(jù)中獲得盡可能多的信息，使用每個(gè)燒瓶的測(cè)量值要優(yōu)于使用重復(fù)測(cè)量的均值。但另一方面，實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，如果測(cè)量方差較大，則與使用單個(gè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)相比，使用重復(fù)測(cè)量的均值可以提供更穩(wěn)健的數(shù)學(xué)估計(jì)，系統(tǒng)誤差的影響更小。繪制擬合曲線，檢驗(yàn)其是否較好擬合了測(cè)量數(shù)據(jù)，殘差分析是擬合效果檢查中特別有用的工具。如果所選的濃度反應(yīng)擬合函數(shù)不能很好地描述整個(gè)曲線或者曲線中的某些重要部分，例如低濃度時(shí)的反應(yīng)，可選擇另外