化學(xué)品 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法 上下增減劑量法（UDP） 征求意見(jiàn)稿

1化學(xué)品急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法上下增減劑量法(UDP)本文件規(guī)定了化學(xué)品急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法——上下增減劑量法（UDP）的范圍、術(shù)語(yǔ)和定義、試驗(yàn)原則、試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)和報(bào)告。本文件適用于化學(xué)品急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法——上下增減劑量法（UDP）。本方法更適用于染毒后一天或兩天內(nèi)就引起死亡的物質(zhì)，而不適用于染毒后可能造成預(yù)期死亡時(shí)間大量延遲（5d或以上）的物質(zhì)。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。急性經(jīng)口毒性acuteoraltoxicity將受試物一次或在24h內(nèi)多次經(jīng)口給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后所產(chǎn)生的不良效應(yīng)。3.2遲發(fā)性死亡delayeddeath給予受試物48h內(nèi)未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡或?yàn)l死狀態(tài)，但在14d的觀察期間內(nèi)出現(xiàn)死亡。3.3劑量dose給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受試物的量，以質(zhì)量（g,mg）來(lái)表示，或以每單位體重試驗(yàn)動(dòng)物所接受的受試物質(zhì)量來(lái)表示（如mg/kg）。3.4劑量級(jí)數(shù)因子doseprogressionfactor又稱劑量間距因子。是指當(dāng)一只動(dòng)物存活時(shí)，下一只動(dòng)物劑量增加（即劑量級(jí)數(shù)）的倍數(shù)；或當(dāng)一只動(dòng)物死亡時(shí)，下一只動(dòng)物劑量減少的除數(shù)。劑量級(jí)數(shù)因子建議為1/（劑量-效應(yīng)曲線的斜率估值）的反對(duì)數(shù)。默認(rèn)的劑量級(jí)數(shù)因子為3.2，即0.5或1/2的反對(duì)數(shù)。3.5全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度globallyharmonizedsystemofclassificationandlabellingofchemicals（GHS）2GB/T21826—××××全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度，是經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）（人類健康和環(huán)境）、聯(lián)合國(guó)危險(xiǎn)貨物運(yùn)輸專家委員會(huì)（UNCETDG理化特性）和國(guó)際勞工組織（ILO危險(xiǎn)貨物運(yùn)輸信息傳遞）的聯(lián)合行動(dòng)產(chǎn)物。并與化學(xué)品有效管理機(jī)構(gòu)間規(guī)劃組織（IOMC）負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)。3.6瀕臨死亡impendingdeath在下一個(gè)計(jì)劃觀察點(diǎn)前出現(xiàn)垂死狀態(tài)或死亡。嚙齒類動(dòng)物瀕臨死亡狀態(tài)的表現(xiàn)有抽搐、側(cè)臥、斜躺和震顫。3.7經(jīng)口半數(shù)致死劑量medianlethaloraldose(LD50)經(jīng)口給予受試物后導(dǎo)致50%實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡的統(tǒng)計(jì)學(xué)劑量，以每單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重接受的受試物重量（mg/kg）來(lái)表示。3.8限度劑量limitdose受試物給予的劑量上限（2000mg/kg或5000mg/kg）。3.9垂死狀態(tài)moribundstatus試驗(yàn)動(dòng)物處于臨死狀態(tài)或即使接受治療也不能存活的狀態(tài)。3.10名義試驗(yàn)動(dòng)物量nominalsamplesize名義試驗(yàn)動(dòng)物量可用兩種方法計(jì)算：染毒序列開(kāi)始時(shí)出現(xiàn)相似效應(yīng)的動(dòng)物數(shù)量減1得到一個(gè)數(shù)量，再用試驗(yàn)動(dòng)物的總數(shù)減去這個(gè)數(shù)量即為名義試驗(yàn)動(dòng)物量；或者，記錄結(jié)局第一次發(fā)生相反的一對(duì)動(dòng)物的數(shù)量，用試驗(yàn)動(dòng)物的總數(shù)減去一個(gè)比該數(shù)量?。ú缓緮?shù)）的值，即可得到名義試驗(yàn)動(dòng)物量。例如，在一個(gè)模型序列OOOXXOXO中，X和O表示動(dòng)物的相反結(jié)局（如X表示在48小時(shí)內(nèi)死亡，O表示存活）。此時(shí)，試驗(yàn)動(dòng)物的總數(shù)量（或傳統(tǒng)意義的樣本容量）是8，名義試驗(yàn)動(dòng)物量是6。在這個(gè)例子中，有4只動(dòng)物發(fā)生相反。必須注意文件中某一特定部分中的數(shù)量是指名義試驗(yàn)動(dòng)物量還是試驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)。例如，最大試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量是15。當(dāng)以最大試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量終止試驗(yàn)時(shí)，名義試驗(yàn)動(dòng)物量將小于或等于15。名義試驗(yàn)動(dòng)物量是從第（r-1）個(gè)動(dòng)物開(kāi)始（出現(xiàn)相反對(duì)的第二只動(dòng)物前的那一只）（3.13）。可預(yù)測(cè)的死亡predictabledeath通過(guò)臨床表現(xiàn)可以預(yù)測(cè)在試驗(yàn)結(jié)束前的某個(gè)時(shí)間會(huì)發(fā)生死亡，如：不能喝水或進(jìn)食。概率積分變換probit對(duì)劑量（通常以對(duì)數(shù)表示）來(lái)說(shuō)，效應(yīng)服從標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布（即以平均值為對(duì)稱軸，以標(biāo)準(zhǔn)差σ調(diào)節(jié)曲線形狀）。劑量-效應(yīng)模型經(jīng)概率積分變換后，可視為以σ的倒數(shù)為斜率的直線。致死量的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布是對(duì)稱的，所以其平均值即為L(zhǎng)D50，也可理解為中位響應(yīng)。33.13相反reversal是指一種現(xiàn)象，即在某個(gè)染毒劑量下沒(méi)有觀測(cè)出試驗(yàn)動(dòng)物的毒性效應(yīng)，在下一個(gè)染毒劑量下試驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)出效應(yīng)；反之亦然（也就是前一個(gè)動(dòng)物表現(xiàn)出效應(yīng)，后一個(gè)動(dòng)物無(wú)效應(yīng)）。相反結(jié)果是由一對(duì)組成。發(fā)生第一次相反結(jié)果的動(dòng)物以r-1和r編號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)差standarddeviation(σ)是一個(gè)正態(tài)對(duì)數(shù)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差，該曲線描述的是試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)化學(xué)品染毒的承受范圍（如染毒劑量超過(guò)試驗(yàn)動(dòng)物的承受限，試驗(yàn)動(dòng)物就可能表現(xiàn)出毒性效應(yīng)）。估值σ反映了試驗(yàn)動(dòng)物在整個(gè)染毒劑量區(qū)間內(nèi)效應(yīng)的變動(dòng)性。見(jiàn)斜率和概率。3.15斜率（劑量-反應(yīng)曲線）slope（ofthedose-responsecurve）是劑量-效應(yīng)曲線與劑量主軸所形成的角度值。如果以概率作為度量尺度與染毒劑量對(duì)數(shù)進(jìn)行概率分析時(shí)是正態(tài)分布，那么劑量-效應(yīng)曲線將會(huì)是一條直線，且斜率是σ（試驗(yàn)動(dòng)物染毒承受力的標(biāo)準(zhǔn)偏差）。見(jiàn)概率和σ。3.16終止規(guī)則stoppingrule本文件中所用的終止規(guī)則在以下情況是同義的：1）一個(gè)具體的終止判定依據(jù)；2）用來(lái)確定測(cè)試序列何時(shí)終止的規(guī)則的匯集。特別是進(jìn)行正式試驗(yàn)時(shí)，終止規(guī)則作為一個(gè)快速判定依據(jù)使用，通過(guò)比率與臨界值的比較結(jié)果來(lái)決定是否終止試驗(yàn)。4試驗(yàn)原則4.1一般原則試驗(yàn)之前應(yīng)綜合考慮可獲得的受試物所有可用信息，包括受試物的名稱和化學(xué)結(jié)構(gòu)，物理化學(xué)性質(zhì)，受試物的任何體外或體內(nèi)毒性試驗(yàn)結(jié)果;結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)或混合物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，以及受試物的預(yù)期用途。這些信息有助于推斷毒性試驗(yàn)在人體健康和環(huán)境保護(hù)方面的相關(guān)性，也有助于選擇合適的起始劑量。本方法允許使用置信區(qū)間對(duì)LD50進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》中化學(xué)品的分類標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)這些試驗(yàn)結(jié)果可以對(duì)具有急性毒性的物質(zhì)進(jìn)行定級(jí)和分類。計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果表明，當(dāng)沒(méi)有無(wú)數(shù)據(jù)可用于LD50和劑量-效應(yīng)曲線斜率的初步估算時(shí)，以175mg/kg劑量附近開(kāi)始，利用劑量的半對(duì)數(shù)單位（對(duì)應(yīng)劑量級(jí)數(shù)因子3.2）估算，可以得到最好的結(jié)果。如果受試物是高毒性，則應(yīng)對(duì)該起始劑量進(jìn)行修正。釆用半對(duì)數(shù)間距可以更高效地使用動(dòng)物，也可以增加預(yù)測(cè)LD50的準(zhǔn)確性。由于本方法對(duì)起始劑量有偏差，故初始劑量的選取一定要低于LD50的估值。然而，與其他急性毒性測(cè)試方法相似，對(duì)可變性大的受試物（即劑量-效應(yīng)曲線斜率小）致死劑量的估算還是會(huì)引入偏差，且LD50會(huì)有一個(gè)大的統(tǒng)計(jì)誤差。針對(duì)估算值的特性，本文件在主要試驗(yàn)部分介紹了一項(xiàng)停止規(guī)則以對(duì)其進(jìn)行校正（見(jiàn)5.3.2.2.3）。計(jì)算機(jī)可確立試驗(yàn)順序并提供估值，這簡(jiǎn)化了逐個(gè)動(dòng)物間的計(jì)算。如果已知受試物在某個(gè)劑量下因腐蝕或嚴(yán)重刺激而導(dǎo)致明顯疼痛，則不需要對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)。瀕臨死亡的動(dòng)物、明顯疼痛的動(dòng)物、或表現(xiàn)出嚴(yán)重且持久痛苦的動(dòng)物，應(yīng)予以人道處死，在分析試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)將其視為于試驗(yàn)中死亡的動(dòng)物。限度試驗(yàn)可有效識(shí)別可能具有低毒性的化學(xué)品。4GB/T21826—××××4.2限度試驗(yàn)原理限度試驗(yàn)是一項(xiàng)連續(xù)的試驗(yàn)，動(dòng)物最大使用量是5只。試驗(yàn)使用的劑量可為2000mg/kg，特殊情況下也可為5000mg/kg。使用2000mg/kg和5000mg/kg的試驗(yàn)過(guò)程略有差別（見(jiàn)5.3.2.1.1和5.3.2.1.2）。當(dāng)受試物的LD50接近限度劑量時(shí)，進(jìn)行連續(xù)試驗(yàn)計(jì)劃可以增加統(tǒng)計(jì)的有效性，但可能會(huì)向不進(jìn)行限度試驗(yàn)的情況偏離；即出現(xiàn)方法安全性的問(wèn)題。正如任何的限度試驗(yàn)，當(dāng)真實(shí)LD50非常接近限度劑量時(shí)，可能會(huì)降低對(duì)受試物進(jìn)行正確的分類。4.3正式試驗(yàn)原理4.3.1正式試驗(yàn)是由一個(gè)單一次序的劑量級(jí)數(shù)組成，一次使用一只動(dòng)物，每次至少要間隔48h。按照低于最佳估算LD50一級(jí)的劑量給第一只動(dòng)物染毒。如果試驗(yàn)動(dòng)物存活，便使用最初劑量3.2倍的劑量給第二只動(dòng)物染毒；如果第一只試驗(yàn)動(dòng)物死亡，第二只動(dòng)物就要接受較低的劑量，劑量級(jí)數(shù)同上面相似（3.2是一個(gè)默認(rèn)的劑量級(jí)數(shù)因子，對(duì)應(yīng)于一個(gè)半對(duì)數(shù)單位的劑量級(jí)數(shù)，5.3.2.2.2提供了劑量級(jí)數(shù)因子的選擇）。對(duì)每只動(dòng)物都應(yīng)認(rèn)真觀察至48h后，才能決定是否對(duì)下一只動(dòng)物染毒及確定染毒劑量。該決定取決于48h觀察期滿時(shí)動(dòng)物的生存狀況（見(jiàn)5.3.2.2.1和5.3.2.2.5中劑量間隔的選擇）。使用停止原則可以使試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量維持在較低水平（見(jiàn)5.3.2.2.4），調(diào)整染毒劑量模式可以降低較差的起始劑量值或較低的斜率造成的影響。當(dāng)滿足這些停止原則時(shí)，染毒就要停止（見(jiàn)5.3.2.2.3和6.2.1），這時(shí)，基于終止時(shí)所有動(dòng)物的試驗(yàn)情況，就可以對(duì)LD50和置信區(qū)間進(jìn)行評(píng)估。在大多數(shù)情況下，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)第一對(duì)相反后，試驗(yàn)僅需4只動(dòng)物就可完成。釆用最大似然法對(duì)LD50進(jìn)行計(jì)算（見(jiàn)6.2.1和6.2.3）。4.3.2計(jì)算的過(guò)程以主要試驗(yàn)得到的結(jié)果作為起點(diǎn)，給出一個(gè)可信的置信區(qū)間評(píng)估。置信區(qū)間CI的介5試驗(yàn)方法5.1試驗(yàn)動(dòng)物5.1.1動(dòng)物選擇5.1.1.1嚙齒類動(dòng)物首選大鼠，但也可選用其他嚙齒類動(dòng)物。通常選用雌性大鼠，因?yàn)樵趥鹘y(tǒng)LD50試驗(yàn)相關(guān)的文獻(xiàn)中，性別間的敏感性幾乎不存在差異；即使觀測(cè)出性別差異，雌性大鼠通常也是較敏感的。但是，若結(jié)構(gòu)特性相關(guān)化學(xué)品的毒理學(xué)或毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示雄性動(dòng)物可能更敏感，則應(yīng)選用雄性動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)用雄性動(dòng)物做試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)提供充分的理由。5.1.1.2試驗(yàn)應(yīng)選用年輕的健康成年動(dòng)物，雌性動(dòng)物應(yīng)非經(jīng)產(chǎn)、未受孕。在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，每只動(dòng)物應(yīng)該在8周齡~12周齡，其體重差異不應(yīng)超過(guò)試驗(yàn)前試驗(yàn)動(dòng)物平均體重的20%。5.1.2飼養(yǎng)條件動(dòng)物房的溫度應(yīng)控制在22°C(±3°C）。動(dòng)物房清潔期間除外，相對(duì)濕度應(yīng)控制在30%~70%，最好控制在50%~60%。應(yīng)釆用人工照明，保持12h光照和12h黑暗交替。染毒48h后，除非同籠動(dòng)物接觸會(huì)因毒性反應(yīng)增加動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)，否則動(dòng)物不應(yīng)單籠飼養(yǎng)，即使單籠飼養(yǎng)，出于動(dòng)物福利的考慮，宜適時(shí)減少單籠飼養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。采用常規(guī)嚙齒類動(dòng)物飼料喂食，自由飲水。5.1.3動(dòng)物準(zhǔn)備隨機(jī)選擇動(dòng)物并進(jìn)行標(biāo)號(hào)，以便于個(gè)體識(shí)別，染毒前至少提前5d將動(dòng)物置于試驗(yàn)籠中飼養(yǎng)，使其適應(yīng)試驗(yàn)條件。如果進(jìn)行連續(xù)的試驗(yàn)，應(yīng)確保整個(gè)研究中動(dòng)物體重和周齡的適用性。5.2受試物配制一般情況下，不同劑量應(yīng)使用相同的受試物給予體積，通過(guò)調(diào)節(jié)受試物濃度配制所需劑量的試驗(yàn)溶液。但如果受試物是液體或混合物，應(yīng)使用不稀釋的受試物（即恒定濃度），因其既適用于后續(xù)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，又滿足一些監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求。在任何情況下，都不能超過(guò)最大染毒體積。液體的每次最大染毒體積取決于試驗(yàn)動(dòng)物的大小。對(duì)嚙齒類動(dòng)物而言，體積一般不超過(guò)1mL/100g體重；如果是水溶液，可以5使用2mL/100g體重。建議受試物盡可能溶解在水中，或制成懸浮液或乳狀液，其次考慮用油（如玉米油最后再選擇其他賦形劑。當(dāng)選用非水賦形劑時(shí)，應(yīng)了解所用賦形劑的毒理特性。受試物應(yīng)在毒性試驗(yàn)前現(xiàn)用現(xiàn)配，除非已知在配制過(guò)程中受試物在賦形劑中的穩(wěn)定性，且可以接受其狀態(tài)。5.3試驗(yàn)步驟5.3.1染毒5.3.1.1使用胃管或合適的插管對(duì)動(dòng)物進(jìn)行灌喂染毒。如果非正常情況下，未能一次染毒，也可在24h內(nèi)分段多次染毒。5.3.1.2動(dòng)物在染毒前應(yīng)禁食（如，大鼠應(yīng)禁食過(guò)夜不禁水；小鼠在染毒前禁食3h～4h不禁水）。禁食后對(duì)動(dòng)物稱重，然后再進(jìn)行染毒。根據(jù)禁食后的動(dòng)物體重來(lái)計(jì)算染毒劑量。染毒后大鼠要禁食3h～4h，小鼠為1h～2h。當(dāng)染毒分多次進(jìn)行時(shí)，根據(jù)染毒時(shí)間段的長(zhǎng)短來(lái)保障動(dòng)物飼料和水供應(yīng)。5.3.2限度試驗(yàn)和正式試驗(yàn)如果相關(guān)的資料表明受試物可能無(wú)毒，即低于管控限度劑量，則可以進(jìn)行限度試驗(yàn)。受試物的毒性信息可以通過(guò)結(jié)構(gòu)相似化合物、混合物及產(chǎn)品的毒性信息來(lái)獲得。當(dāng)缺少或者無(wú)受試物的毒性信息時(shí)，或推測(cè)出受試物有毒時(shí)，應(yīng)進(jìn)行正式試驗(yàn)。5.3.2.1限度試驗(yàn)5.3.2.1.12000mg/kg劑量限度試驗(yàn)先對(duì)一只動(dòng)物進(jìn)行染毒。如果動(dòng)物出現(xiàn)死亡，則進(jìn)行正式試驗(yàn)并計(jì)算LD50。如果動(dòng)物存活，依次對(duì)另外4只動(dòng)物進(jìn)行染毒，共對(duì)5只動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。如果有3只動(dòng)物出現(xiàn)死亡，限度試驗(yàn)停止，進(jìn)行正式試驗(yàn)。如果3只或3只以上動(dòng)物存活，那么LD50大于2000mg/kg。如果試驗(yàn)中一只動(dòng)物出現(xiàn)非預(yù)期延遲死亡，而其他動(dòng)物存活，此時(shí)要停止染毒并觀察所有的動(dòng)物，看其它動(dòng)物在相同的觀察周期是否也會(huì)出現(xiàn)死亡（見(jiàn)5.3.2.2中初始觀察期）。延遲死亡的動(dòng)物應(yīng)同其它死亡的動(dòng)物一樣記入死亡數(shù)量。結(jié)果評(píng)估如下（O=存活，X＝死亡）?！?dāng)3只或3只以上動(dòng)物出現(xiàn)死亡，LD50低于限量劑量（2000mg/kg）。OXOXXOOXXXOXXOXOXXX如果有3只動(dòng)物出現(xiàn)死亡，則進(jìn)行正式試驗(yàn)?！獪y(cè)試5只動(dòng)物。當(dāng)3只或3只以上動(dòng)物存活，則LD50高于限度劑量（2000mg/kg）。OOOOOOOOXOOOOOXOOOXXOXOXOOXOOO/XOOXXOOOXOO/XOXXOO5.3.2.1.25000mg/kg劑量限度試驗(yàn)如管理特殊要求，可進(jìn)行5000mg/kg限度試驗(yàn)（見(jiàn)附錄C）。出于動(dòng)物福利的考慮，不鼓勵(lì)對(duì)GHS第5類（2000mg/kg~5000mg/kg）中的物質(zhì)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，只有當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果極可能涉及人類或動(dòng)物健康以及環(huán)境保護(hù)等時(shí)，方考慮進(jìn)行該試驗(yàn)。對(duì)一只動(dòng)物用5000mg/kg劑量進(jìn)行染毒，如果動(dòng)物死亡，就進(jìn)行正式試驗(yàn)來(lái)確定LD50。如果動(dòng)物存活，繼續(xù)對(duì)另外兩只動(dòng)物進(jìn)行染毒。如果兩只動(dòng)物都存活，則LD50高于限度劑量，限度試驗(yàn)結(jié)束（即持續(xù)觀察14d，不對(duì)另外的動(dòng)物進(jìn)行染毒）。如果一只或者兩只動(dòng)物出現(xiàn)死亡那么再給另外兩只動(dòng)物依次染毒。如果試驗(yàn)中有一只動(dòng)物出現(xiàn)意外的延遲死亡且有其他動(dòng)物存活，此時(shí)應(yīng)停止染毒并觀察所有的動(dòng)物，看其他動(dòng)物在相同的觀察周期6GB/T21826—××××是否也會(huì)死亡。延遲死亡的動(dòng)物應(yīng)同其他死亡的一樣記入死亡數(shù)量。結(jié)果評(píng)估如下（O=存活，X=死亡，U=不必要）。——當(dāng)3只或更多的動(dòng)物死亡，LD50低于限量劑量（5000mg/kg）。OXOXXOOXXXOXXOXOXXX——當(dāng)3只或更多的動(dòng)物存活，LD50高于限量劑量（5000mg/kg）。OOOOXOXOOXOO-OOXXOOOXOOXXOO5.3.2.2正式試驗(yàn)5.3.2.2.1通常每間隔48h對(duì)動(dòng)物染毒一次，一次染毒一只動(dòng)物。然而，染毒間隔的設(shè)置是由發(fā)作、持續(xù)時(shí)長(zhǎng)和中毒癥狀的嚴(yán)重性共同決定的。應(yīng)當(dāng)確認(rèn)先前染毒的動(dòng)物仍然存活，方可進(jìn)行下一個(gè)劑量的染毒。不確定會(huì)產(chǎn)生何種效應(yīng)時(shí)，染毒間隔時(shí)間可做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)連續(xù)染毒過(guò)程中的染毒間隔固定時(shí)，試驗(yàn)較易進(jìn)行。如果試驗(yàn)中的染毒間隔時(shí)間是變化的，則不必要重新計(jì)算染毒劑量和概率比率。為了選擇起始劑量，所有可得到的資料，包括受試物結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的信息以及受試物的所有毒性測(cè)試結(jié)果，都應(yīng)用于估算LD50和劑量-效應(yīng)曲線的斜率。5.3.2.2.2第一只動(dòng)物的染毒劑量要比LD50的最佳預(yù)測(cè)值低一級(jí)。如果這只動(dòng)物存活，便使用較高的劑量給第二只動(dòng)物染毒。如果第一只動(dòng)物出現(xiàn)死亡或者垂死的狀況，那么就用較低的劑量對(duì)第二只動(dòng)物進(jìn)行染毒。劑量級(jí)數(shù)因子應(yīng)該選擇為1/（劑量-效應(yīng)曲線斜率的估計(jì)值）的反對(duì)數(shù)，而且在整個(gè)測(cè)試中應(yīng)該保持不變（級(jí)數(shù)3.2對(duì)應(yīng)的斜率為2）。當(dāng)沒(méi)有受試物的斜率信息時(shí)，使用的劑量級(jí)數(shù)因子為3.2。使用默認(rèn)的級(jí)數(shù)因子，染毒劑量依次為1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、2000mg/kg（或者特殊情況下使用1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、1750mg/kg、5000mg/kg的序列進(jìn)行試驗(yàn)）。如果無(wú)法預(yù)測(cè)受試物的致死量信息，染毒劑量應(yīng)當(dāng)從175mg/kg開(kāi)始。大多數(shù)的情況下，這個(gè)劑量是亞致死量，所以釆用此劑量可以減少動(dòng)物的疼痛和痛苦程度。如果動(dòng)物對(duì)化學(xué)品的耐受程度存在較大可變性（即斜率估計(jì)值低于2.0），在開(kāi)始測(cè)試前應(yīng)考慮在劑量對(duì)數(shù)值上增加0.5（即3.2級(jí)數(shù)因子）。類似地，對(duì)于已知斜率很陡的受試物，應(yīng)選取比默認(rèn)值小的劑量級(jí)數(shù)因子。（附錄A包含了一個(gè)劑量級(jí)數(shù)表，起始劑量為175mg/kg，斜率范圍在1~8之間）。5.3.2.2.3是否繼續(xù)進(jìn)行染毒，取決于固定時(shí)間間隔（如48h）后所有動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)符合以下任一項(xiàng)時(shí)，試驗(yàn)終止：a）在上限劑量時(shí)有連續(xù)3只動(dòng)物存活；b）在連續(xù)測(cè)試的任意6只動(dòng)物中有5個(gè)相反現(xiàn)象發(fā)生；c）至少有4只動(dòng)物跟隨第一個(gè)相反現(xiàn)象，并且確定的概率比率超過(guò)臨界值（見(jiàn)6.2.4和附錄B。在試驗(yàn)進(jìn)行到第一個(gè)相反現(xiàn)象后的第4只動(dòng)物時(shí)，要對(duì)每一次染毒劑量進(jìn)行計(jì)算）。對(duì)于LD50和斜率變化很大的受試物，試驗(yàn)出現(xiàn)相反后有4到6只動(dòng)物跟隨第一個(gè)相反現(xiàn)象即可滿足終止規(guī)則c）。在一些情況下，對(duì)于劑量-效應(yīng)曲線斜率較小的受試物，可能需要更多的動(dòng)物（試驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)最多可達(dá)15）。5.3.2.2.4當(dāng)符合終止規(guī)則時(shí)，根據(jù)6.1和6.2.1的試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算LD50。5.3.2.2.5人道處死的垂死動(dòng)物視同試驗(yàn)中死亡。如果試驗(yàn)中一只動(dòng)物發(fā)生延遲死亡，并且其他服用同等或更多劑量的動(dòng)物仍存活，應(yīng)停止染毒，并觀察所有動(dòng)物，看其他動(dòng)物是否會(huì)在相似的觀察期內(nèi)死亡。如果后來(lái)存活的動(dòng)物同樣死亡，且所有劑量水平可能都超過(guò)LD50，則此時(shí)建議重新開(kāi)始試驗(yàn)，所用起始劑量至少低于最低的死亡劑量的兩級(jí)（并延長(zhǎng)觀察時(shí)間），因?yàn)楫?dāng)起始劑量低于LD50時(shí)，方法是最準(zhǔn)確的。如果后續(xù)服用與之前死亡的動(dòng)物同等或更多劑量的動(dòng)物能夠存活，就不需要改變劑量級(jí)數(shù)，因?yàn)樗劳鰟?dòng)物的信息將會(huì)作為比存活動(dòng)物更低劑量的死亡率包含到計(jì)算中去，而不是后來(lái)的存活動(dòng)物里，這會(huì)使LD50降低。5.4觀察75.4.1染毒后30min內(nèi)至少觀察一次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，前24h內(nèi)要定期觀察（染毒后4h內(nèi)要特別注意），之后14d內(nèi)每天觀察一次，除非發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡或者進(jìn)行人道處死。但觀察期限并非固定不變，應(yīng)根據(jù)動(dòng)物毒性反應(yīng)大小、毒性反應(yīng)時(shí)間以及恢復(fù)期時(shí)長(zhǎng)等因素來(lái)決定，如有必要可延長(zhǎng)觀察期。毒性癥狀出現(xiàn)和消失的時(shí)間應(yīng)重點(diǎn)觀察，尤其是遲發(fā)性毒性癥狀。系統(tǒng)記錄每只動(dòng)物的觀察結(jié)果。5.4.2如果動(dòng)物連續(xù)出現(xiàn)毒性癥狀，需進(jìn)行額外觀察。臨床觀察包括皮膚、被毛、眼、黏膜、呼吸、循環(huán)、植物神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，活動(dòng)和行為特征的改變。應(yīng)重點(diǎn)觀察震顫、驚厥、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物處于瀕死狀態(tài)，或動(dòng)物表現(xiàn)出劇烈疼痛或持續(xù)嚴(yán)重痛苦癥狀，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行人道處死。當(dāng)動(dòng)物被人道處死或者被發(fā)現(xiàn)死亡時(shí)，應(yīng)盡可能精確地記錄死亡時(shí)間。5.5體重應(yīng)在給予受試物前對(duì)動(dòng)物個(gè)體稱重，之后應(yīng)至少每周稱重一次。記錄和計(jì)算體重的變化。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活動(dòng)物應(yīng)在稱重后人道處死。5.6病理學(xué)所有的動(dòng)物（包括在試驗(yàn)期死亡及人道處死）都應(yīng)進(jìn)行大體剖檢。記錄每只動(dòng)物的大體病理變化。在首次染毒后存活24h或更長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)物可以考慮對(duì)其進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，以獲得更多有用的信息。6數(shù)據(jù)和報(bào)告6.1數(shù)據(jù)應(yīng)提供動(dòng)物個(gè)體數(shù)據(jù)。以表格匯總所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括每個(gè)劑量組使用的動(dòng)物數(shù)量、出現(xiàn)毒性癥狀的動(dòng)物數(shù)量、試驗(yàn)中死亡或人道處死的動(dòng)物數(shù)量，動(dòng)物個(gè)體的死亡時(shí)間，毒性效應(yīng)及相反效應(yīng)的描述和過(guò)程，以及大體解剖結(jié)果。同時(shí)提供選擇起始劑量和劑量級(jí)數(shù)的依據(jù)。6.2正式試驗(yàn)LD50計(jì)算6.2.1除了6.2.2描述的特殊情況以外，采用最大似然法計(jì)算LD50。下列統(tǒng)計(jì)學(xué)詳細(xì)資料有助于最大似然法計(jì)算（用假設(shè)σ)。無(wú)論是直接死亡、遲發(fā)性死亡或人道處死，都包含在最大似然法分析的目標(biāo)函數(shù)中。似然函數(shù)見(jiàn)式（1）~（3）：L=L1L2 Ln.......................................................................................（1）如果第i個(gè)動(dòng)物存活，Li=1-F（Zi）或 （2）如果第i個(gè)動(dòng)物死亡，Li=F（Zi） 式中：L——試驗(yàn)結(jié)果的似然值；n——試驗(yàn)動(dòng)物的總數(shù)；F——標(biāo)準(zhǔn)累積正態(tài)分布；Zi——[log（di）-μ]/σ;di——第i個(gè)動(dòng)物的染毒劑量。μ和σ為給定,σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差。真實(shí)LD50的估算值由似然值L取最大值時(shí)的μ計(jì)算得到（見(jiàn)6.2.3）。σ的估計(jì)值一般為0.5，除非能夠得到一個(gè)較好的一般性或特殊情況的數(shù)據(jù)。6.2.2在某些情況下，不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算或有可能得出錯(cuò)誤結(jié)果。出現(xiàn)以下情況時(shí)可以通過(guò)特殊方法確定LD50的估算值：a）如果試驗(yàn)基于5.3.2.2.3中的a即重復(fù)進(jìn)行上限劑量試驗(yàn)）停止，或者因上限劑量停止試驗(yàn)，LD50則高于上限劑量值。分類也在此基礎(chǔ)上完成。b）如果所有死亡動(dòng)物的染毒劑量都比所有存活動(dòng)物高（或者所有存活動(dòng)物的染毒劑量比所有死亡動(dòng)物的高，雖然這幾乎是不可能的），則LD50介于存活動(dòng)物染毒劑量和死亡動(dòng)物染毒劑量之間。這些觀察結(jié)果不能進(jìn)一步給出LD50的準(zhǔn)確信息。盡管如此，假設(shè)給定σ值，則可以計(jì)算出最大似然LD50。5.3.2.2.3的b）對(duì)這種情況進(jìn)行了描述。c）如果存活和死亡的動(dòng)物所使用的染毒劑量只有一個(gè)是相同的，并且其他的死亡動(dòng)物都使用更高的染毒劑量而其他存活動(dòng)物都使用更低的染毒劑量，或者出現(xiàn)相反的情況，則LD50等于相同的那個(gè)染毒劑量。如果受試物是一個(gè)與之非常接近的相關(guān)物質(zhì)，應(yīng)該使用一個(gè)較小的染毒劑量級(jí)數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)。8GB/T21826—××××如果上述情況都不出現(xiàn)，則LD50應(yīng)用最大似然法進(jìn)行計(jì)算。6.2.3最大似然計(jì)算可以釆用SAS（如非線性回歸分析統(tǒng)計(jì)程序PROCNLIN）或統(tǒng)計(jì)軟件BMDP（如AR程序）的計(jì)算程序包（這些計(jì)算程序包在參考文獻(xiàn)[1]的附錄1D中有描述）?；蚴褂闷渌挠?jì)算軟件。ASTME1163—1987的附錄對(duì)這些程序作了特殊說(shuō)明（BASIC程序使用的σ值需要進(jìn)行校正）。程序得到的結(jié)果是logLD50估算值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。6.2.45.3.2.2.3中的c）是基于試驗(yàn)程序的三次試驗(yàn)，以表格的形式列出不同μ值時(shí)6.2.1的似然性結(jié)果。當(dāng)?shù)?只動(dòng)物已經(jīng)不能滿足5.3.2.2.3中a）或b）時(shí)，對(duì)之后的每個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比。標(biāo)準(zhǔn)似然性比率方程列于附錄B中。這些對(duì)比以自動(dòng)化方式利用電子數(shù)據(jù)表軟件很容易完成并可以重復(fù)進(jìn)行，如附錄B中提到計(jì)算機(jī)軟件。如果符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則，試驗(yàn)停止，可用最大似然性方法即可計(jì)算出LD50。6.3置信區(qū)間的估算6.3.1根據(jù)正式試驗(yàn)和LD50估計(jì)值的計(jì)算，可以得出LD50的置信區(qū)間。任何一個(gè)置信區(qū)間都可以在正式試驗(yàn)的可靠性和實(shí)用性方面提供有價(jià)值的信息。一個(gè)寬的置信區(qū)間表明LD50估計(jì)值有較多的不確定性。LD50估計(jì)值的可靠性低時(shí)，其有效性也就低。一個(gè)窄的置信區(qū)間表明LD50估計(jì)值有較小的不確定性。LD50估計(jì)值可靠性高，其有效性也就高。這就意味著，如果重復(fù)進(jìn)行正式試驗(yàn)，那么新的LD50估計(jì)值應(yīng)與原來(lái)的LD50估計(jì)值接近，并且這兩個(gè)LD50估計(jì)值都會(huì)接近真實(shí)LD50。6.3.2根據(jù)正式試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算出真實(shí)LD50的兩個(gè)不同類型置信區(qū)間中的其中一個(gè)?！?dāng)至少采用三種染毒劑量進(jìn)行試驗(yàn)，且以中間劑量染毒時(shí)至少有一個(gè)動(dòng)物存活和一個(gè)動(dòng)物死亡，此條件下，可以用一個(gè)似然性的計(jì)算機(jī)程序得到一個(gè)置信區(qū)間，即真實(shí)LD50的95%置信區(qū)間。但由于希 望使用少量的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)際置信水平一般不準(zhǔn)確。使用隨機(jī)停止規(guī)則改善了應(yīng)對(duì)條件發(fā)生變化的能力，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致報(bào)道的置信水平與真實(shí)置信水平存在稍許差別。——如果所有動(dòng)物在某一染毒劑量或低于該劑量水平時(shí)存活，且所有動(dòng)物在下一個(gè)較高染毒劑量下死亡，則可以計(jì)算出一個(gè)區(qū)間，下限為所有動(dòng)物存活時(shí)的最高染毒劑量，上限為所有動(dòng)物死亡時(shí)的染毒劑量。這個(gè)區(qū)間標(biāo)注為“大約”，即這個(gè)區(qū)間的準(zhǔn)確置信水平不能明確確定。由于這種類型的效應(yīng)僅發(fā)生在劑量-效應(yīng)曲線斜率陡峭的情況下，而在大多數(shù)情況下，真實(shí)的LD50應(yīng)落在所得置信區(qū)間內(nèi)或與置信區(qū)間非常接近。這個(gè)區(qū)間可能相對(duì)較窄，且在大多數(shù)的實(shí)際使用中十分準(zhǔn)確。6.3.3在某些情況下，所得置信區(qū)間為無(wú)窮大，此時(shí)以零作為它的下限，無(wú)窮大作為它的上限，或兩者兼而有之。例如，當(dāng)所有動(dòng)物死亡或所有動(dòng)物存活時(shí)，可能會(huì)得到此類置信區(qū)間。本流程需要專門(mén)的計(jì)算方法，可使用美國(guó)環(huán)保局或經(jīng)合組織提供的專門(mén)程序，或者使用美國(guó)環(huán)保局或經(jīng)合組織提供的技術(shù)性細(xì)節(jié)資料。資料中描述的這些置信區(qū)間的覆蓋情況和專用程序的性能，同樣也可以通過(guò)美國(guó)環(huán)保局獲得。6.4試驗(yàn)報(bào)告報(bào)告的內(nèi)容應(yīng)包括以下的信息：6.4.1受試物6.4.1.1物理性質(zhì)、純度等相關(guān)的物理化學(xué)性質(zhì)（包括異構(gòu)體）；6.4.1.2標(biāo)識(shí)資料，包括CAS號(hào)。6.4.2賦形劑如果賦形劑不是水，注明賦形劑的選擇理由。6.4.3試驗(yàn)動(dòng)物6.4.3.1所用動(dòng)物品系；6.4.3.2動(dòng)物的微生物狀況（如已知）；6.4.3.3動(dòng)物數(shù)量、鼠齡和性別（包括使用雄性代替雌性的理由）；6.4.3.4供應(yīng)商、飼養(yǎng)條件與飼料等。6.4.4試驗(yàn)條件6.4.4.1起始劑量選擇的依據(jù)，劑量級(jí)數(shù)因子以及后續(xù)的劑量水平；6.4.4.2受試物的配描述，包括染毒時(shí)物理形態(tài)；6.4.4.3受試物的染毒體積和染毒時(shí)間；6.4.4.4飼料和水質(zhì)的詳細(xì)資料（包括飼料類型、飼料來(lái)源和水源）。6.4.5結(jié)果6.4.5.1體重及體重變化；96.4.5.2以表格的形式列出每只動(dòng)物的劑量水平和效應(yīng)數(shù)據(jù)（即動(dòng)物出現(xiàn)的毒性癥狀，包括特征、嚴(yán)重程度、效應(yīng)持續(xù)時(shí)間和死亡率）；6.4.5.3染毒時(shí)的動(dòng)物個(gè)體的體重，每周體重，以及死亡及處死時(shí)的體重；6.4.5.4每只動(dòng)物出現(xiàn)毒性癥狀的時(shí)間進(jìn)程及癥狀是否可逆；6.4.5.5每只動(dòng)物的大體解剖發(fā)現(xiàn)和組織病理學(xué)結(jié)果（如果有）；6.4.5.6LD50值；6.4.5.7統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果（使用的計(jì)算機(jī)程序描述和電子數(shù)據(jù)表格的計(jì)算）。6.4.6結(jié)果的討論和分析6.4.7結(jié)論GB/T21826—××××（規(guī)范性附錄）染毒過(guò)程A.1主要試驗(yàn)的染毒劑量序列A.1.1上下增減劑量法：對(duì)每一序列，給動(dòng)物逐只染毒，通常間隔48h。第一只動(dòng)物接受的劑量比LD50最佳估計(jì)值低一個(gè)級(jí)數(shù)。這個(gè)選擇反映了一個(gè)調(diào)整趨勢(shì)，使偏差朝著偏向初始劑量、偏離LD50的方向移動(dòng)。為之后的每只動(dòng)物調(diào)整劑量，以確保全部試驗(yàn)的結(jié)果穩(wěn)定。以下內(nèi)容為劑量范圍的選取提供了更多的指導(dǎo)。A.1.2默認(rèn)劑量級(jí)數(shù)：一旦確定了初始劑量和劑量間隔，毒理學(xué)家就應(yīng)該列出所有可能的劑量，包括上限（通常是2000mg/kg或5000mg/kg）。接近上限的劑量應(yīng)從劑量級(jí)數(shù)中剔除。本文件的本意是提供初始的幾個(gè)劑量，形成可自我調(diào)整的劑量序列。鑒于試驗(yàn)易出現(xiàn)正偏差，所以在對(duì)物質(zhì)毫無(wú)所知的情況下，建議以175mg/kg為初始劑量。如果主要試驗(yàn)中采用了默認(rèn)流程，測(cè)初始劑量應(yīng)該為175mg/kg，劑量級(jí)數(shù)因子應(yīng)該取對(duì)數(shù)計(jì)算的默認(rèn)值0.5。劑量的使用應(yīng)包含1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、2000mg/kg或有特殊需要時(shí)應(yīng)包含1.75mg/kg、5.5mg/kg,、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、1750mg/kg、5000mg/kg。對(duì)于某些高毒性的物質(zhì)，染毒劑量要向低值移動(dòng)。A.1.3表A.1提供了劑量級(jí)數(shù)為整數(shù)倍數(shù)的斜率（1~8），此時(shí)的劑量級(jí)數(shù)因子不是默認(rèn)值。表A.1劑量序列單位為毫克每千克斜率＝123456780.175*0.175*0.175*0.3750.175*0.310.175*0.2750.440.175*0.260.3750.175*0.240.340.470.175*0.230.310.410.550.810.550.990.690.550.820.650.910.550.730.973.12.752.61.752.43.41.752.33.15.53.755.54.46.93.755.54.76.54.15.57.3表A.1劑量序列（續(xù)）單位為毫克每千克斜率＝156788.18.29.99.19.727.517.517.537.54437.5474169658182999197275260240230310375440375340470310410550550690550650550730810990820910970240023003100275026003750340031005000a如果需要較低500050005000的劑量，將序列延續(xù)至較低的劑量。50005000500041005000GB/T21826—××××（資料性附錄）似然比終止規(guī)則的估算B.1正式試驗(yàn)可能以三項(xiàng)終止規(guī)則（見(jiàn)5.3.2.2.2）中的第一項(xiàng)為基礎(chǔ)完成。但無(wú)論如何，即使不滿足任意一項(xiàng)停止規(guī)則，只要已對(duì)15個(gè)動(dòng)物進(jìn)行了有效染毒，染毒也應(yīng)當(dāng)停止。表B.1~表B.4列舉了缺失受試物信息的例子，此情況下推薦使用默認(rèn)的起始劑量為175mg/kg，默認(rèn)的劑量級(jí)數(shù)因子為3.2或一個(gè)半對(duì)數(shù)。請(qǐng)注意這些表格的內(nèi)容僅是作為例證。B.2表B.1顯示，在限度劑量2000mg/kg下，如果3個(gè)動(dòng)物存活，正式試驗(yàn)將如何停止。表B.2顯示，在限度劑量為5000mg/kg下的類似情形（這些都是限度試驗(yàn)不適用的情況）。表B.3舉出了一個(gè)特殊的序列，其中6個(gè)試驗(yàn)動(dòng)物中出現(xiàn)了5個(gè)相反，然后結(jié)束試驗(yàn)。最后，表B.4舉例說(shuō)明這樣一個(gè)情況：當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果既不滿足終止規(guī)則a）也不滿足終止規(guī)則b），且連續(xù)4個(gè)試驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)了相反反應(yīng)，則應(yīng)評(píng)估終止規(guī)則c）。B.3終止規(guī)則c）需要在每個(gè)動(dòng)物測(cè)試后用似然比終止規(guī)則對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，從出現(xiàn)相反后的第四個(gè)動(dòng)物開(kāi)始。推測(cè)出三個(gè)“試驗(yàn)程序方法”。技術(shù)上來(lái)說(shuō)，這些程序方法是可能的，如推薦的LD50的最大似然評(píng)估方法。這個(gè)程序接近于以概率為基礎(chǔ)的置信區(qū)間的計(jì)算。B.4程序的基礎(chǔ)是：當(dāng)已經(jīng)收集到了足夠的數(shù)據(jù)時(shí)，LD50點(diǎn)估計(jì)比偏離點(diǎn)估計(jì)的值更加可靠,此時(shí)需要用概率對(duì)點(diǎn)估計(jì)的可靠性進(jìn)行量化。因此要計(jì)算三個(gè)概率值：一個(gè)是數(shù)值剛好為L(zhǎng)D50點(diǎn)估計(jì)的概率（例子中稱為粗略估值或平均劑量估值），一個(gè)是數(shù)值低于點(diǎn)估計(jì)的概率，一個(gè)是數(shù)值高于點(diǎn)估計(jì)的概率。具體地，低數(shù)值為點(diǎn)估計(jì)除以2.5的商，高數(shù)值為點(diǎn)估計(jì)的2.5倍。B.5通過(guò)似然性比率的計(jì)算來(lái)比較似然值，然后判斷這些似然性比率（LR）是否超過(guò)一個(gè)臨界值。當(dāng)點(diǎn)估計(jì)的似然性比率超過(guò)其他每個(gè)似然性2.5步進(jìn)因子時(shí)，停止試驗(yàn)，該因子可表示點(diǎn)估計(jì)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有相對(duì)強(qiáng)的可靠性。因此計(jì)算兩個(gè)似然比率，一個(gè)是點(diǎn)估計(jì)與點(diǎn)估計(jì)除以2.5的商的似然比率，一個(gè)是點(diǎn)估計(jì)與點(diǎn)估計(jì)乘2.5的積的似然比率。B.6LD50值的計(jì)算用任何帶有正態(tài)概率函數(shù)功能的電子制表軟件均可完成。附錄B中表B.4所舉的LD50的例子就是模仿電子制表軟件構(gòu)建出來(lái)的。表B.4以極限劑量上限5000mg/kg為例介紹了計(jì)算步驟，上限劑量為2000mg/kg時(shí)計(jì)算步驟相同?；蛘?，使用具有數(shù)據(jù)輸入、公式運(yùn)算功能的，軟件，從OECD和USEPA網(wǎng)站上直接下載動(dòng)物數(shù)據(jù)，輸入LD50估算公式和置信區(qū)間計(jì)算公式后進(jìn)行計(jì)算。表B.5給岀了這類軟件的截圖。B.7上限劑量為5000mg/kg的虛擬范例（見(jiàn)表B.4）在這個(gè)虛擬例子中，限度劑量為5000mg/kg，在試驗(yàn)完9個(gè)動(dòng)物后滿足了似然比停止規(guī)則。第3個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)了第一次“相反”。當(dāng)試驗(yàn)完“相反”后的4個(gè)動(dòng)物時(shí)要檢查似然比終止規(guī)則是否滿足。在這個(gè)例子中，相反后的第4個(gè)動(dòng)物即為實(shí)際試驗(yàn)中的第7個(gè)動(dòng)物。因此，對(duì)于這個(gè)例子來(lái)說(shuō)，電子制表軟件的計(jì)算僅需要從第7個(gè)動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)后開(kāi)始，同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入。隨后，在第7個(gè)動(dòng)物、第8個(gè)動(dòng)物和第9個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)后也要進(jìn)行似然比終止規(guī)則的檢查。此例中，在第9個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)完后首次滿足了似然比終止規(guī)則?！来屋斎朊恐粍?dòng)物的劑量-效應(yīng)信息。第1欄步驟編號(hào)為1~15。試驗(yàn)動(dòng)物最多為15只。第2欄每一個(gè)接受試驗(yàn)的動(dòng)物在該欄標(biāo)記為I。第3欄輸入第i個(gè)動(dòng)物的染毒劑量。第4欄注明動(dòng)物反應(yīng)狀況：有效應(yīng)（標(biāo)記為X），無(wú)效應(yīng)（標(biāo)記為O）?！x和實(shí)際試驗(yàn)動(dòng)物量名義試驗(yàn)動(dòng)物量由第一次相反的兩只動(dòng)物（這里是第2只和第3只動(dòng)物）加上后來(lái)接受試驗(yàn)的所有動(dòng)物組成。第5欄列出了每只動(dòng)物是否記入名義試驗(yàn)動(dòng)物量中。第16行給出了名義試驗(yàn)動(dòng)物量（n）。這是名義試驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量。在這個(gè)例子里，n為8。第17行為實(shí)際試驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量?！狶D50的粗略估值記入名義試驗(yàn)動(dòng)物量中的動(dòng)物，其染毒劑量幾何平均值用于LD50粗略估值的計(jì)算。在表中，稱之為“平均劑量估值”。它隨著每只接受試驗(yàn)的動(dòng)物而更新。為了允許選擇一個(gè)較差的初始測(cè)試劑量，該平均值要限于名義動(dòng)物數(shù)量中，它可以產(chǎn)生一個(gè)初始的效應(yīng)群和一個(gè)初始的非效應(yīng)群。（但是，下面最終LD50的似然性計(jì)算中用到的是所有的動(dòng)物數(shù)量）。回憶一下，n個(gè)數(shù)量的幾何平均數(shù)是n個(gè)數(shù)量的1/n次方的產(chǎn)物。第18行為平均劑量估計(jì)值［例如,（175×55O×…×175O）1/8＝1292.78］第19行為第18行值的對(duì)數(shù)（10為底例如log101292.8＝3.112)?！狶D50粗略估值似然性似然性是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，用來(lái)量度數(shù)據(jù)對(duì)LD50或其他參數(shù)的估計(jì)值的支持程度。似然性比率可用于比較數(shù)據(jù)對(duì)于不同的LD50估計(jì)值的可靠程度。第8欄按LD50的粗略估值計(jì)算LD50平均估計(jì)值的似然性。該似然性（第21行）是分布到各只動(dòng)物上的似然性的總和（見(jiàn)6.2.1）。每只動(dòng)物上的似然性分布用Li表示。在第7欄中輸入各反應(yīng)劑量di的概率估計(jì)值，記作Pi。Pi從劑量-效應(yīng)曲線計(jì)算得出。注意：概率積分變換劑量-效應(yīng)曲線的參數(shù)是斜率和LD50，所以需要這些參數(shù)的數(shù)值。第18行的平均劑量估值用于LD50的估算。這個(gè)例子中的斜率使用默認(rèn)值2。利用下面列出的步驟計(jì)算反應(yīng)概率Pi。a）計(jì)算lgdi（第6欄）。），Zi=(lgdi–lgLD50)/σc）第i個(gè)劑量的估計(jì)反應(yīng)概率為Pi=F(Zi)），統(tǒng)計(jì)表中的函數(shù)F（或相似函數(shù)）用于正態(tài)第8欄:計(jì)算了似然性分布的自然對(duì)數(shù)InLi。Li僅僅是實(shí)際觀察到的每只動(dòng)物的效應(yīng)的概率：表現(xiàn)出效應(yīng)的動(dòng)物：InLi=lnPi無(wú)效應(yīng)的動(dòng)物：InLi=ln（1-Pi）注意這里用的是自然對(duì)數(shù)（In），而其他地方（通常）用的是以10為底的對(duì)數(shù)。這些選擇通常是由上下文來(lái)預(yù)測(cè)的。每只動(dòng)物都要完成上述步驟。最后：第20行：第8欄對(duì)數(shù)-似然性分布求和。第21行：對(duì)第20行的可能性貢獻(xiàn)的log值進(jìn)行exp函數(shù)計(jì)算。(如exp（-3.389）=e-3.389=0.0337)?！?jì)算LD50的粗略估值的上下兩種劑量的似然性如果可以精確估計(jì)數(shù)據(jù)，對(duì)偏離估計(jì)值LD50較遠(yuǎn)的值的似然性而言，合理的LD50估計(jì)值將會(huì)有高的似然性。比較平均劑量估值的似然性（1292.8，第18行）和以2.5階數(shù)因子發(fā)生變化的值（即到1292.8×2.5和1292.8/2.5）。計(jì)算同上面描述的類似（列于第9~12欄中除了517.1（=1292.8/2.5）和3232.0（=1292.8×2.5）替代1292.8用于LD50的估計(jì)。——計(jì)算似然性比率GB/T21826—××××——確定似然比是否超過(guò)臨界值高似然比意味著對(duì)LD50估計(jì)值的高度可靠性。上述兩個(gè)似然比計(jì)算結(jié)果（4.21和3.44）都超出GB/T21826—××××表格B.1劑量為2000mg/kg時(shí)，終止規(guī)則a）范例級(jí)數(shù)（I）包含劑量（X）效應(yīng)（O）無(wú)效應(yīng)是否屬于名義動(dòng)物數(shù)量劑量的常用對(duì)數(shù)值LD50=#DIV/0!LD50=#DIV/0!LD50=#DIV/0!效應(yīng)概率似然性分配（InLi）效應(yīng)概率似然性分配（InLi）效應(yīng)概率似然性 分配（InLi）OK1IO否2.2430#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!2I550O否2.7404#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!3I2000O否3.3010#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!4I2000O否3.3010#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!5I2000O否3.3010#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!6E-------7E-------8E-------9E-------E-------E-------E-----E-----E-----E-------名義試驗(yàn)動(dòng)物實(shí)際試驗(yàn)動(dòng)物量=量=05計(jì)算的LD50的最大似然估計(jì)值=無(wú)GB/T21826—××××表格B.2劑量為5000mg/kg時(shí)，終止規(guī)則a）范例級(jí)數(shù)（I）包含（E）不包含劑量（X）反應(yīng)（O）沒(méi)反應(yīng)是否屬于名義動(dòng)物數(shù)量劑量的常用對(duì)數(shù)值LD50=#DIV/0!LD50=#DIV/0!LD50=#DIV/0!效應(yīng)概率似然性分配（InLi）效應(yīng)概率似然性分配（InLi）效應(yīng)概率似然性 分配（InLi）OK1IO否2.2430#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!2I550O否2.7404#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!3IO否3.2430#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!4I5000O否3.6990#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!5I5000O否3.699